BIBLIOTEKI GENOWE BIBLIOTEKI GENOWE. Genomowa, cdna i inne

Transkrypt

1 BIBLIOTEKI GENOWE Genomowa, cdna i inne BIBLIOTEKI GENOWE Genomowa - jest zbiorem fragmentów chromosomalnego i organelarnego DNA organizmu umieszczonych w określonych wektorach (wielkość fragmentów zależy od stosowanego wektora i metody przygotowania DNA) biblioteka cdna jest analogicznym zbiorem fragmentów DNA powstałych na matrycy mrna poprzez odwrotną transkrypcję (wielkość fragmentów zależy od długości mrna i metody) inne

2 ORGANIZACJA GENU EUKARIOTYCZNEGO 5 UTR 3 UTR enhancers silencers CHEMICZNA STRUKTURA DNA I RNA

3 STRUKTURA DNA FIGURE 4.15 OVERVIEW OF RNA PROCESSING.

4 KLONOWANIE GENÓW Etap 1: Zrobić zrekombinowane DNA Zrekombinowany plazmid 1. Przetnij wektor enzymem restrykcyjnym - Enzymy restrykcyjne zwykle rozpoznają palindronowe 4 lub 6 nukleotydowe sekwencje 2. Zmieszaj zlinearyzowany wektor z fragmentem DNA 3. Reakcja ligacji łączy cukrowo-fosforanowe łańcuchy dając zrekombinowane DNA KLONOWANIE GENÓW Etap 2: Wykorzystaj bakterie do powielenia (replikacji) twojego DNA Zrekombinowany plazmid oprócz twojego fragmentu zawiera gen odporności na Ampicylinę

5 ENZYMY RESTRYKCYJNE I METYLACJA DNA SEKWENCJE ROZPOZNAWANE PRZEZ NIEKTÓRE RESTRYKAZY Enzyme Recognition site Type of cut end EcoRI G A-A-T-T-C 5 P extension BamHI G G-A-T-C-C 5 P extension PstI C-T-G-C-A G 3 P extension Sau3A1 G-A-T-C 5 P extension PvuII C-A-G C-T-G Blunt end HpaI G-T-T A-A-C Blunt end HaeIII G-G C-C Blunt end NotI G C-G-G-C-C-G-C 5 P extension

6 MAPPING OF RESTRICTION ENZYME SITES

7 BIBLIOTEKI GENOWE Genomowa - jest zbiorem fragmentów chromosomalnego i organelarnego DNA organizmu umieszczonych w określonych wektorach (wielkość fragmentów zależy od stosowanego wektora i metody przygotowania DNA) biblioteka cdna jest analogicznym zbiorem fragmentów DNA powstałych na matrycy mrna poprzez odwrotną transkrypcję (wielkość fragmentów zależy od długości mrna i metody) inne

8 ORIENTACYJNY ZAKRES DŁUGOŚCI TRANSKRYPTÓW (PODOBNIE CDNA) Rośliny z Robak z Człowiek z PLAZMIDY (BAKTERYJNE) dwuniciowe, koliste, 1-200kb zwykle 1 replikon (i więcej) kopii na komórkę potrzebują enz. Gospodarza do replikacji i transkrypcji często noszą geny korzystne dla gospodarza, np. odporność na antybiotyki pochodzenie od pmb1 lub ColE1 (ori i przyległe sekwencje) mogą być przekazywane do innych bakterii podczas koniugacji - wymagany gen mob markery selekcyjne: odporność na ampicylinę, tetracyklinę, chloramfenikol, kanamycynę geny reporterowe systemy ekspresji

9 3 najważniejsze elementy: miejsce klonowania, Ori - origin of replication, marker selekcyjny (amp r )

10 PUC18/19 puc18 and puc19 vectors are small, high copy number, E.coli plasmids, 2686 bp in length. They are identical except that they contain multiple cloning sites (MCS) arranged in opposite orientations. puc18/19 plasmids contain: (1) the pmb1 replicon rep responsible for the replication of plasmid (source plasmid pbr322). The high copy number of puc plasmids is a result of the lack of the rop gene and a single point mutation in rep of pmb1; (2) bla gene, coding for beta-lactamase that confers resistance to ampicillin (source plasmid pbr322); (3) region of E.coli operon lac containing CAP protein binding site, promoter Plac, lac repressor binding site and 5 -terminal part of the lacz gene encoding the N-terminal fragment of beta-galactosidase (source M13mp18/19). This fragment, whose synthesis can be induced by IPTG, is capable of intra-allelic (alfa) complementation with a defective form of beta-galactosidase encoded by host (mutation laczdm15). In the presence of IPTG, bacteria synthesize both fragments of the enzyme and form blue colonies on media with X-Gal. Insertion of DNA into the MCS located within the lacz gene (codons 6-7 of lacz are replaced by MCS) inactivates the N-terminal fragment of betagalactosidase and abolishes alfa-complementation. Bacteria carrying recombinant plasmids therefore give rise to white colonies.

11 WEKTORY OPARTE O BAKTERIOFAGA LAMBDA An electron micrograph of bacteriophage lambda by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter WIELKOŚĆ GENOMU LAMBDA OKOŁO 50 KPZ (LINIOWA, DWUNICIOWA CZĄSTECZKA) In stable state 1 (the prophage state) the bacteriophage synthesizes a repressor protein, which activates its own synthesis and turns off the synthesis of several other bacteriophage proteins, including the Cro protein. In state 2 (the lytic state) the bacteriophage synthesizes the Cro protein, which turns off the synthesis of the repressor protein, so that many bacteriophage proteins are made and the viral DNA replicates freely in the E. coli cell, eventually producing many new bacteriophage particles and killing the cell. This example shows how two gene regulatory proteins can be combined in a circuit to produce two heritable states. Both the lambda repressor and the Cro protein recognize the operator through a helix-turn-helix motif (see Figure 7-14). Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts and Walter (2002).

12 CYKL ROZWOJOWY BAKTERIOFAGA LAMBDA. The double-stranded DNA lambda genome contains 50,000 nucleotide pairs and encodes different proteins. When the lambda DNA enters the cell, the ends join to form a circular DNA molecule. This bacteriophage can multiply in E. coli by a lytic pathway, which destroys the cell, or it can enter a latent prophage state. Damage to a cell carrying a lambda prophage induces the prophage to exit from the host chromosome and shift to lytic growth (green arrows). Both the entrance of the lambda DNA to, and its exit from, the bacterial chromosome are accomplished by a conservative sitespecific recombination event, catalyzed by the lambda integrase enzyme (see Figure 5-80) by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter REPLIKACJA I PAKOWANIE FAGA LAMBDA konkatamer

13 PAKOWANIE FAGA LAMBDA WEKTORY FAGOWE BAKTERIOFAG LAMBDA - OK. 50 KPZ (DWUNICIOWY) adsorpcja do receptorów błonowych (gen lamb z operonu maltozowego) indukowanych przez maltozę w pożywce (represja przez glukozę) do adsorpcji potrzebny Mg++ i kilka min. RT lub 37C cały genom dostaje się do komórki, kapsyd nie rozwój lityczny lepkie końce - cząsteczka kolista ekspresja genów wczesnych replikacja dwukierunkowa replikacja rolling circle - konkatamery późna transkrypcja - otoczka montaż otoczki i pakowanie (cięcie w miejscu cos - białko A) liza (gen S) rozwój lizogeniczny wybór szlaku rozwojowego zależy od wewn. równowagi aktywności genów bakteriofaga i gospodarza ekspresja represora ci (blokuje wczesne i późne geny) i genu int (doprowadza do homologicznej rekombinacji z chromosomem w miejscu att) - przejście w stadium profaga

14 LAMBDA JAKO WEKTOR wady dzikiego faga: długi genom za dużo miejsc restrykcyjnych (w tym w genach istotnych dla litycznego rozwoju) - trudno wklonować kapsyd nie pozwala na upakowanie cząsteczek większych niż 105% i mniejszych niż 78% genomu dzikiego faga lambda) usuwanie wad usuwanie środkowej części nieistotnej dla wzrostu litycznego (wektor typu substytucyjnego) i wstawianie w to miejsce obcego DNA mutowanie miejsc restrykcyjnych wprowadzanie markerów genetycznych

15 WEKTORY OPARTE NA BAKTERIOFAGU LAMBDA Miejsca Cos na lewym i prawym końcu Miejsce klonowania KONSTRUOWANIE BIBLIOTEKI GENOMOWEJ WYKORZYSTANIE FAGOWEGO WEKTORA SUBSTYTUCYJNEGO

16 JAK PRZYGOTOWAĆ DNA DO KONSTRUKCJI BIBLIOTEKI GENOMOWEJ? CAŁKOWITE STRAWIENIE DNA ZWYKŁYMI ENZYMAMI RESTRYKCYJNYMI PROWADZI DO UTRATY WIELU WAŻNYCH REJONÓW GENOMU: Małe fragmenty klonują się z inną efektywnością niż duże Małe fragmenty mogą być za małe by wektor substytucyjny osiągnął odpowiednią wielkość do pakowania Duże fragmenty mogą być większe niż pojemność wektora Wszystkie fragmenty mają identyczne końce, co uniemożliwia odtworzenie dłuższego rejonu genomu niż sklonowany fragment TWORZENIE NAKŁADAJĄCYCH SIĘ FRAGMENTÓW DNA PRZEZ CZĘŚCIOWE TRAWIENIE.

17 KOSMIDY (ANG. COSMID) ZMODYFIKOWANE PLAZMIDY Z SEKWENCJĄ COS UMOŻLIWIAJĄCĄ PAKOWANIE DNA DO OTOCZKI FAGA LAMBDA (PUSTY OK. 5 KPZ) pierwotnie przeznaczone do klonowania dużych fragmentów genomowego DNA Konkatamer! wektor posiada ori i geny odporności i bez insertu można go wtransformować namnażać jak plazmid wektor z insertem pakuje się do otoczki i transfekuje się bakterie selekcja na antybiotyku, wzrost w postaci kolonii bakteryjnych max.47 kb, min. 33 kb (pojemność otoczki lambdy) klonowanie trudniejsze niż lambda - stosowany tylko w szczególnych przypadkach BAKTERIOFAGI JEDNONICIOWE (M13, f1, fd) jednoniciowe, koliste DNA, 6,4 kb (M13; forma infekcyjna) możliwość otrzymania dużych ilości jednoniciowego DNA (do sekwencjonowania, do robienia sond niciowo-specyficznych, mutageneza kierowana pakowanie podczas wyrzucania poza komórkę gospodarza - otoczka układana wokół DNA - nie ma ograniczenia wielkości kawałka pakowanego zainfekowane bakterie rosną 2x wolniej, łysinki zagłębione, nie lizują, b. duża gęstość czasem niestabilne, czasem klonuje się tylko w jednej orientacji wygodne miejsca klonowania

18 FAGMIDY połączenie cech plazmidów i fagów namnażanie w postaci faga tylko w obecności odpowiednich genów (np. na helperze) stabilność i plon nie trzeba subklonować mały wektor

19 OVERVIEW OF THE UNI-ZAP XR VECTOR SYSTEM The Uni-ZAP XR vector system combines the high efficiency of lambda library construction and the convenience of a plasmid system with blue white color selection. The Uni-ZAP XR vector (Figure 2) is double digested with EcoR I and Xho I and will accommodate DNA inserts from 0 to 10 kb in length. The Uni-ZAP XR vector can be screened with either DNA probes or antibody probes and allows in vivo excision of the pbluescript phagemid (Figure 3), allowing the insert to be characterized in a plasmid system. The polylinker of the pbluescript phagemid has 21 unique cloning sites flanked by T3 and T7 promoters and a choice of 6 different primer sites for DNA sequencing. The phagemid has the bacteriophage f1 origin of replication, allowing rescue of single-stranded DNA, which can be used for DNA sequencing or site-directed mutagenesis. Unidirectional deletions can be made with exonuclease III and mung bean nuclease by taking advantage of the unique positioning of 5 and 3 restriction sites. Transcripts made from the T3 and T7 promoters generate riboprobes useful in Southern and Northern blotting, and the lacz promoter may be used to drive expression of fusion proteins suitable for Western blot analysis or protein purification. Uni-ZAP XR Vector Map

20 INNE WEKTORY DO DUŻYCH FRAGMENTÓW Bakteriofagi P1 i PAC (P1- derived artificial chromosome) P1 - pojemność kpz, miejsce pac do pakowania do główek faga, 2 miejsca loxp, które dzięki genowi cre rekombinują w komórce gospodarza dając cząsteczki koliste i zachowują się jak plazmidy o małej liczbie kopii, indukcja dużej liczby kopii - lityczny replikon P1, chimery 2-5% PAC: kpz, połączenie systemów P1 i czynnika F (chimery i niestabilność?) INNE WEKTORY DO DUŻYCH FRAGMENTÓW: Sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) pojemność do 350 kpz działa jak jednokopijny czynnik płci F u E.coli; Cm R - odp. na chloramfenikol oris i repe - jednokierunkowa replikacja; para i parb - utrzymują 1-2 kopii cosn i loxp - miejsca rozszczepiania dla terminazy i białka crep1 nie trzeba pakować, stabilny przez >100 generacji, brak możliwości amplifikacji

21 SZTUCZNY CHROMOSOM DROŻDŻY Wersja kolista - plazmid pyac: ori z pbr322, centromer, ARS (autonomous replication sequence), markery selekcyjne, gen supresorowy, sekwencja międzytelomerowa z drożdży, sekwencje telomerowe z Tetrahymena pojemność do 2Mpz wady: 1) powstawanie klonów chimerycznych podczas ligacji lub rekombinacji (w niektórych bibliotekach nawet ponad 50% klonów), 2) niestabilność - delecje wewnętrznych rejonów insertów, 3) trudność w odseparowaniu od 15Mz chromosomu gospodarza LICZEBNOŚĆ BIBLIOTEKI Klonowanie fragmentów przy konstrukcji biblioteki jest losowe - niektóre sekwencje klonują się kilkakrotnie, niektóre wcale Fragmenty zachodzą na siebie (niepełne trawienie) liczba niezależnych rekombinantów wchodzących w skład biblioteki musi być większa niż n = wielkość genomu / średnia wielkość insertu dla prawdopodobieństwa 95% biblioteka musi liczyć 3 x n rekombinantów, dla 99% - 5 x n (genom człowieka i wektor o pojemności ok pz) bez uwzględnienia diploidalności powyższe szacunki zakładają równy udział całej sekwencji (zależy np. od metody izolacji i fragmentacji).

22 DEFINICJE pfu (plaque forming unit) - jednostka tworząca łysinkę, najczęściej pojedynczy fag, ale nie zawsze. Miano biblioteki - ilość pfu na jednostkę objętości (np. pfu/ml). Jednostka aktywności enzymu (jednostka, unit - U) - taka ilość białka enzymatycznego, która strawi całkowicie 1 mg DNA dzikiego bakteriofaga lambda w ciągu 1 godziny w optymalnych warunkach (bufor, temperatura). Biblioteka znormalizowana to biblioteka, w której zróżnicowanie częstości występowania określonych sekwencji zostało wyrównane przy pomocy różnych metod molekularnych (np. w bibliotece cdna występuje zmienność wynikająca ze zróżnicowanego poziomu transkrypcji genów) CECHY DOBREGO WEKTORA zdolność do autonomicznej replikacji dobrze scharakteryzowany genetycznie, fizycznie i rozwojowo obecność markerów selekcyjnych obecność pojedynczych miejsc restrykcyjnych do wklonowania, nie w obrębie genu markerowego lub innego ważnego w zależności od przeznaczenia, obecność odpowiedniego, silnego promotora duża ilość kopii na komórkę brak genów niebezpiecznych łatwość przechowywania i testowania

23 WEKTORY I ICH POJEMNOŚCI Vector system Host cell Insert capacity (kb) Plasmid E. coli Bacteriophage E. coli Cosmid E. coli Bacteriophage P1 E. coli BAC (bacterial artificial chromosome) P1 bacteriophagederived AC E. coli E. coli YAC Yeast 100-2,000 Human AC Cultured human cells >2,000