Co to jest transkryptom? A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 2

Transkrypt

1 ALEKSANDRA ŚWIERCZ

2 Co to jest transkryptom? A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 2

3 Ekspresja genów A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 3

4 Co to jest mikromacierz? Mikromacierz DNA (określany także jako chip DNA) to zbiór, krótkich DNA przyczepionych do powierzchni szklanej płytki. Mikromacierzy można użyć do mierzenia poziomu ekspresji genów Każdy punkt na mikromacierzy zawiera specyficzną sekwencję DNA, która reprezentuje jeden z genów (sonda, ang. probe) A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 5

5 Macierz ekspresji genów Geny/ sondy Próbki Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Próbka Poziom ekspresji genu lub stosunek, dla genu i-tego w j-tej próbce mrna M= A= A. Świercz { { log 2 (red intensity/green intensity) Funkcja (PM,MM) MAS, dchip lub RMA ½ log 2 (red intensity*green intensity) Funkcja (PM,MM) MAS, dchip lub RMA ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 6

6 Różnice między eksperymentem mikromacierzowym a RNA-seq Przy użyciu mikromacierzy można badać poziom ekspresji znanych genów, natomiast wykorzystując RNA-seq można także wykryć nowe izoformy genów A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 7

7 RNA-seq razem z Ion Torent A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 8

8 Dlaczego RNA-seq zamiast DNA-seq? Badanie funkcjonalności Genom może być taki sam, ale warunki eksperymentalne mogą mieć wpływ na ekspresję genów (np. traktowanie komórek lekarstwem, vs niczym nietraktowane, lub mysz dzika vs zmieniona genetycznie) Niektóre zmiany mogą być widoczne dopiero na poziome RNA Alternatywne izoformy Fuzja transkryptów (trans-splicing, transcription-induced chimerism) Edytowanie RNA - zmiana informacji w transkrypcie RNA przez reakcję chemiczną powodującą zmianę jednej zasady azotowej w inną (C->U, A->I, Inozyna interpretowana jako G). Przewidywanie sekwencji transkryptów z sekwencji genomu jest trudne: Alternatywny transkrypt Edytowanie RNA A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 9

9 Dlaczego RNA-seq zamiast DNA-seq? Interpretacja, czy poszczególne mutacje mają wpływ na sekwencje białkową Mutacje regulujące które wpływają na to czy izoformy mrna ulegają ekspresji i jak dużej Czy mutacje wpływają na promotory, eksonowe/intronowe motywy, miejsca splicingowe? Wpływ na białka kodujące mutacje somatyczne (często heterozygotyczne) Jeśli gen nie ulega ekspresji, mutacja w takim genie będzie mniej interesująca Jeśli gen ulega ekspresji tylko z alleli dzikiego typu, może to sugerować na utratę funkcjonalności (haploinsufficiency) Jeśli allel mutanta ulega ekspresji, może to oznaczać kandydata na target dla leku A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 10

10 Do czego wykorzystywane jest RNA-seq? Badanie ekspresji genów oraz różnicowej ekspresji genów Wyszukiwanie alternatywnego splicingu w genach Odkrywanie nowych transkryptów/izoform Odkrywanie mutacji w genach Wykrywanie fuzji genów Edytowanie RNA (mutacje w RNA) A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 11

11 Mikromacierze vs sekwencjonowanie Porównanie eksperymentów mikromacierzowych i RNA-seq pokazało, że: Jest duża zgodność w wynikach pomiędzy platformami, w szczególności pomiędzy wykrywaniem różnicowej ekspresji genów Platforma sekwencjonowania jest bardziej wrażliwa na wykrycie zmian, jest bardziej odporna na tło i różnice w powtórzeniach technicznych Zaletą RNA-seq jest porównanie poziomu ekspresji różnych genów między sobą (dla mikromacierzy można porównać ten sam gen między różnymi warunkami) Ograniczeniem RNA-seq jest natomiast wykrzywienie GC oraz niejednoznaczność w mapowaniu Większa jest moc statystyczna w wykrywaniu zmian, gdy odczyty występują w większej liczności A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 12

12 Sekwencjonowanie RNA po kolei RNA-seq Module, 2013, A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 14

13 Trzy podejścia do mapowania RNA-seq A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 15

14 Trudności przy mapowaniu RNA Geny w genomach eukariotycznych zawierają introny, a sewkencje mrna są już ich pozbawione. Programy mapujące odczyty z eksperymentów RNA-seq muszą być w stanie dopasować sekwencje z przerwami Introny w genomach ssaków mają długość od 50 bp - 100,000 bp. Średnia długość transkryptu mrna u człowieka to 2227 bp Średnia długość eksonu to 235 bp Średnio w jednym genie jest 9 eksonów Około 20% odczytów które mapują się na łączeniach eksonów mapują się tylko na < 10 nukleotydach na drugim eksonie A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 16

15 Trudności przy mapowaniu RNA Część sekwencji pochodzi z przetworzonych pseudogenów, z których niektóre lub wszystkie introny zostały usunięte (może to spowodować nieprawidłowe mapowanie odczytów) Genom ludzki posiada 14tys pseudogenów Pseudogeny mają sekwencję bardzo podobną do funkcjonalnych genów zawierających introny. W większości przypadków nie ulegają transkrypcji Problem w mapowaniu wynika stąd że odczyty, które mapują się na łączeniu eksonów, będą się mapowały w całości dokładnie lub z niewielkim błędem do pseudogenów, które nie zawierają intronów. Jeśli metoda mapująca mapuje najpierw odczyty w całości, a resztę próbuje dopasować z podziałem na eksony, to pominie odczyty które w całości zmapowane zostały do pseudogenów A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 17

16 D. Kim, G. Pertea, C. Trapnell, H. Pimentel, R. Kelley, S.L. Salzberg TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions Genome Biology 2013, 14:R36 A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 18

17 Trudności przy mapowaniu RNA Transkrypt badanego genomu może się różnić od genomu referencyjnego Różnice mogą być małe, typu SNP, insercje, delecje, niedopasowania Zmiany mogą być większe, rearanżacje chromosomowe przeniesienia dłuższych fragmentów, wiele kopii Małe zmiany nie wpływają znacznie na mapowanie trzeba dopuścić możliwość błędów w niedopasowaniu (może to niestety spowodować wiele miejsc mapowania) Większe zmiany: duże usunięcia, inwersje w obrębie tego samego chromosomu, oraz translokacje między-chromosomowe powodują że trudno znaleźć kolejne eksony genu fragment chrom. 2 fragment chrom. 5 W genomie badanym w stosunku do genomu referencyjnego część genu uległa translokacji oraz inwersji A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 19

18 TopHat2 pipeline Znane sygnały podziału eksonów GT-AG, GC-AG, AT-AC A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 20

19 A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 21

20 A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 22

21 Alamancos GP, Agirre E, Eyras E. (2014) Methods to study splicing from high-throughput RNA sequencing data. Methods Mol Biol 1126: A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 24