Wektory DNA - klonowanie molekularne

Transkrypt

1 Wektory DNA - klonowanie molekularne

2 Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. zmusić go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany tj. zrekombinowany in vitro z odpowiednim elementem genetycznym zwanym wektorem czyli cząsteczką DNA zdolną do wnikania do wnętrza komórek tego gospodarza zdolną do autonomicznej replikacji O takim fragmencie DNA wbudowanym do wektora i wprowadzonym do jakiegoś gospodarza (najczęściej bakteryjnego) mówimy że jest on sklonowany w bakteriach

3 Co oznacza klonowanie molekularne? Termin klonowanie w odniesieniu do pojedynczego fragmentu DNA oznacza namnażenie (powielanie) określonego odcinka DNA w komórkach gospodarza, (najczęściej bakterie np. Escherichia coli), przy zastosowaniu odpowiedniego wektora. Klonowanie DNA jest podstawową techniką inżynierii genetycznej. Klonowanie molekularne umożliwia: znalezienie, wyizolowanie i namnożenie wybranego genu z genomu jakiegoś organizmu, przeprowadzania manipulacji, na przykład mutagenezy, uzyskiwania ekspresji genu, czyli produkcji kodowanego przez niego produktu. Do klonowania molekularnego niezbędne są dwa elementy: wektor gospodarz

4 Nie zawsze celem klonowania molekularnego jest produkcja białka przez komórki bakteryjne - sklonowanie fragmentu DNA jest często celem samym w sobie Transformation

5 Klonowanie molekularne można przeprowadzić w komórkach mikroorganizmów jak i eukariotycznych, ale: Klonowanie w komórkach prokariotycznych jest nieporównywalnie prostsze ponieważ komórki bakteryjne łatwo jest hodować i izolować z nich duże ilości specyficznego DNA, które można poddawać kolejnym zabiegom: sekwencjonowaniu, mapowaniu, transformacji, hybrydyzacji, itd. W bakteriach możemy z powodzeniem klonować (powielać) geny prokariotyczne i eukariotyczne.

6 Jako wektorów do klonowania molekularnego w mikroorganizmach używa się: 1. Plazmidów 2. Bakteriofagów 3. Kombinacji elementów genetycznych plazmidowofagowych np. kosmidów, fagemidów, itp.

7 Wektory plazmidowe 1. Ogólnego przeznaczenia proste powielanie wybranego genu 2. Wektory do zadań specjalnych (są to wektory, które oprócz samego powielania DNA umożliwiają np. wydajną ekspresję sklonowanego genu produkcję białka badanie własności sklonowanego genu lub odcinka DNA otrzymywanie jednoniciowego DNA (ssdna) stabilne powielanie ekstremalnie duże fragmentów DNA konstrukcja banków (bibliotek) genomowych

8 Cechy dobrego wektora plazmidowego Zdolny do autonomicznej replikacji (niezależnej od chromosomu gospodarza) kilkadziesiąt kilkaset pz musi posiadać tzw. origin replikacji oriv (nieliczne wektory integracyjne, wbudowują się do DNA gospodarza, są bardziej stabilne, mają mniejszą ilość kopii) Marker selekcyjny (czyli gen kodujący białko odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe. Wektor musi być tak skonstruowany aby istniała możliwość selekcji tych komórek, do których wniknął. MCS (multiple cloning site miejsce wielokrotnego klonowania tzw. polilinker) Pozwala na swobodny dobór odpowiedniego enzymu restrykcyjnego do sklonowania fragmentu DNA. Wektor powinien być niezdolny do przeżycia poza komórką gospodarza, namnażać się w niewielu szczepach (mały zakres gospodarza), nie posiadać zdolności koniugacyjnych. Powinien być stosunkowo niewielki (poniżej 10 kpz)

9 Wektory plazmidowe miejsce startu replikacji Miejsce startu replikacji (oriv ) wektora plazmidowego determinuje: ilość kopi wektora w komórce zgodność z innymi wektorami plazmidowymi Plazmid Replikon (oriv) Ilość kopii na komórkę pbr322 i pochodne pmb wektory serii puc pmb pacyc i pochodne p15a psc101 i pochodne psc101 ~5 ColE1 ColE Replikony ColE1 i pmb1 są niezgodne, są natomiast zgodne z psc101 i p15a

10 MCS (polilinker) kopii na komórkę

11 Wizualna selekcja zrekombinowanych klonów Wektory (nie tylko plazmidowe) zazwyczaj posiadają również systemy pozwalające na odróżnienie komórek gospodarza który pobrał wektor zrekombinowany od takiego, który zamknął się bez połączenia z obcym fragmentem DNA. Plazmidy takie jak puc umożliwiają tzw. wizualną identyfikację klonów zrekombinowanych, dzięki wstawieniu do wektora genu kodującego enzym, który rozkłada barwny substrat. MCS znajduje się wtedy w obrębie tego genu. Jego przerwanie przez wstawienie obcego DNA sprawia że kolonie zawierające zrekombinowany i niezrekombinowany wektor rosną na płytce w różnych kolorach

12 Wizualna selekcja zrekombinowanych klonów c.d. Wektor zawiera N-końcowy fragment beta-galaktozydazy (genu lacz), wprowadza się go komórek, które syntetyzują tylko część C-końcową beta-galaktozydazy (niosących zmutowany geny lacz). Obydwa peptydy mogą asocjować ( -komplementacja) tworząc aktywne enzymatycznie białko. X-gal sztuczny substrat dla beta-galaktozydazy IPTG sztuczny induktor beta-galaktozydazy (tzw. bezinteresowny)

13 X-gal, IPTG Szczep gospodarza bakteryjnego do klonowania molekularnego nie jest przypadkowy!

14 Selekcja zrekombinowanych klonów może zachodzić przez zahamowanie namnażania się klonów komórek zawierających niezrekombinowany plazmid. Takie wektory zawierają gen letalny dla komórki gospodarza. Insercja klonowanego DNA inaktywuje ekspresję letalnego genu umożliwiając wzrost rekombinantów.

15 Wektory plazmidowe specjalnego przeznaczenia

16 I. Plazmidowe wektory ekspresyjne Co wyróżnia wektory ekspresyjne? 1. Silny, regulowany promotor rozpoznawany przez polimerazę RNA gospodarza np. Silny promotor powoduje, że w specyficznych warunkach transkrypcja jest inicjowana wiele razy na minutę. regulowany promotor oznacza że można go indukować. Przykładem może być promotor laktozowy. Transkrypcję wzmaga się przez dodanie do pożywki IPTG (analog laktozy).

17 2. Wektory ekspresyjne są wyposażone w sekwencje niezbędne do translacji mrna sklonowanego genu

18 II. Wektory do transkrypcji in vitro Zawierają promotory bakteriofagów takiej jak T3, T7 i/lub SP6 umieszczone przed miejscem wstawienia DNA. Zastosowanie: wydajna produkcja RNA (np. mrna) in vitro

19 III. Wektory do badania własności sklonowanego genu lub odcinka DNA, np. do badania aktywności promotorów Fragmenty DNA wprowadza się w tych wektorach w pobliżu genu reporterowego np. pozbawionego własnego promotora genu lacz i mierzy aktywność jego ekspresji oriv XhoI BglII EcoRI KpnI XbaI PstI orit trfa MCS lacz pmp220 ( pz) Tet

20 IV. Wektory do rekombinacji i klonowania nietypowych fragmentów DNA Nietypowych: uzyskanych inaczej niż przez trawienie cząsteczek DNA enzymami restrykcyjnymi np. fragmentów DNA, które zostały uzyskane w reakcji PCR

21 2. Wektory bakteriofagowe

22 Wektory fagowe: bakteriofag Fag zawiera ds DNA wielkości pz, 12 pz jednoniciowe lepkie końce cos Ok. 60% genomu faga jest niezbędna do jego litycznego cyklu życiowego, środkowa część 15 kpz (ok. 1/3) może być zastąpiona obcym DNA. W otoczkę faga można wpakować do 52 kpz DNA, co oznacza ze po usunięciu zbędnych 15 kpz, w takim wektorze można zmieścić obcy fragment DNA rzędu kilkunastu kpz. DNA z delecją nie może być pakowany w główki, co staje się zaletą ponieważ tylko DNA ze wstawionym obcym DNA może się zapakować w główki (dobra selekcja fagów zrekombinowanych).

23 Schemat klonowania DNA w wektorze-fagu

24 Inne wektory bakteriofagowe: pochodne bakteriofaga P1 (Sternberg 1990) podobne do faga, oparte na wersjach delecyjnych genomu faga P1. P1 ma większy niż genom co pozwala klonować większe fragmenty DNA do 125 kpz konstrukcja bibliotek genomowych

25 Wektory fagowe: bakteriofag M13 ss DNA (6407 pz), kopii na komórkę, 10 genów, Po wniknięciu do komórki jest syntetyzowana druga komplementarna nić DNA, w formie ds DNA ulega replikacji. W końcowej fazie ponownie powstają formy ssdna pakowane w osłonki i uwalniane z komórki Służy do klonowania niewielkich fragmentów DNA (zwykle poniżej 1 kpz) Seria wektorów M13mp18/19 zbudowanych na bazie faga M13 posiada możliwość -komplementacji, syntetyczny MCS Ich podstawowe zastosowanie to otrzymywanie ss DNA, które dawniej używane było w sekwencjonowaniu DNA oraz mutagenezie in vitro. Dwie orientacje MCS w M13mp18/19, zapewniały możliwość odczytania sekwencji DNA z obydwu stron

26 3. Kombinacje plazmidów i bakteriofagów a) Fagemidy Uzyskuje się je np. przez wprowadzenie do wektora plazmidowego fragmentu ori z jednoniciowego bakteriofaga M13 lub f1. Takie wektory plazmidowe nazywamy fagemidami Wektory te służą podobnie jak pochodne M13 do otrzymywanie jednoniciowych kopii ssdna wykorzystywane sekwencjonowania DNA lub syntezy znakowanego np. radioaktywnie ssdna.

27

28 b) Kosmidy wektory plazmidowe wyposażone w sekwencję cos faga ich wielkość wynosi od 5 do 8 kpz co oznacza, że można do niego sklonować od kpz.

29 Fosmidy - specyficzna odmiana kosmidów Zawierają miejsce startu replikacji z plazmidu F oraz sekwencję cos z faga. Budowa podobna do kosmidów, Znacznie mniejsza ilość kopii na komórkę i dzięki temu większa stabilność.

30 Wektory drożdżowe Drożdże jako komórki gospodarzy posiadają pewne niezaprzeczalne zalety: mają struktury komórkowe typowe dla eukariota ale są jednokomórkowe geny w nich klonowane mogą zawierać sekwencje intronowe ponieważ proces obróbki mrna jest zbliżony do tego, który występuje u wyższych eukariontów powstające białka mogą podlegać modyfikacjom potranslacyjnym. Kiedy zatem użyć drożdży jako gospodarza w klonowaniu molekularnym? 1. W przypadku klonowania eukariotycznych genów, które nie dają się sklonowować w bakteriach 2. wtedy gdy zależy nam nie tylko na prostym powieleniu DNA, ale także na uzyskaniu ekspresji genu w komórce eukariotycznej i otrzymaniu białek odpowiednio zmodyfikowanych potranslacyjnie

31 WEKTORY DROŻDŻOWE - wektory wahadłowe (ang. shuttle vector) wahadłowość to cecha typowa dla wielu wektorów eukariotycznych Wektory wahadłowe (bifunkcjonalne) mają: dwa odrębne miejsca startu replikacji (jedno z nich uruchamiane jest w eukariotycznych komórkach - drożdży, drugie w komórkach prokariotycznych E. coli) dwa typy markerów selekcyjnych: dla komórek drożdżowych jak i bakteryjnych umożliwia to wygodne utrzymywanie wektora w komórkach bakteryjnych oraz np. ekspresję sklonowanych genów w drożdżach

32 1983 Murray i Szostak sztuczny chromosom drożdżowy YAC YAC ma wielkość kb (chromosom drożdżowy od kpz) co oznacza w YAC-u można sklonować odcinek DNA do 2,5 Mpz Wektory te są w drożdżach stabilne mitotycznie nawet bez presji selekcyjnej i utrzymują się jako liniowy minichromosom (w ilości 1-2 kopii na kom.)

33 YAC składa się z części 1. prokariotycznej- (plazmidowe oriv i marker selekcyjny gen oporności na antybiotyk) Sup4 2. eukariotycznej która zawiera: odcinek ori ARS, centromer CEN, telomery i geny selekcyjne (np. his3, trp1, ura3 nie są to geny oporności na antybiotyk) przynajmniej jedno unikalne miejsce restrykcyjne do klonowania obcego DNA System do wizualnej selekcji klonów zrekombinowanych sup4 (białe i różowe) ale nie jest to alfa-komplementacja BamH1 BamH1

34 Dodatkowo w części eukariotycznej występują sekwencje umożliwiające ekspresję sklonowanego genu tzw. kompleks (kaseta) ekspresyjny, który obejmuje Promotor rozpoznawany przez polimerazę RNA gospodarza eukariotycznego (drożdżową polimerazę RNA) Terminatora transkrypcji MCS (zwykle mało rozbudowane) sztucznej sekwencji intronowej, która umożliwia dojrzewanie klonowanego DNA eukariotycznego

35 Jak używać YAC-a? Zrekombinowane YAC-i powielają się drożdżach dzięki chromosomalnym mechanizmom replikacji!!!

36 Wektory do komórek wyższych eukariontów (zwierząt i ludzi) Należy rozpatrywać je raczej w kategoriach systemów dostarczania gotowego konstruktu genetycznego lub transgenu Znajdują zastosowanie w tzw. badaniach podstawowych in vitro (linie komórkowe), terapii genowej czy transgenezie Są w większości wektorami wahadłowymi Oparte głównie na wirusach są to rekombinowane wirusy zawierające wewnątrz otoczki zrekombinowane DNA np. sekwencje terapeutyczne lub transgeny, które zastępują geny samego wirusa

37 Jakie wirusy wykorzystuje się do konstrukcji wektorów rekombinowane wektory retrowirusowe oraz lentiwirusowe (HIV) rekombinowane wektory adenowirusowe rekombinowane wektory AAV (adenoassociated virus) rekombinowany wektor wirusa opryszczki HSV Rekombinowane wektory retrowirusowe i adenowirusowe są najczęściej stosowanymi wektorami wirusowymi wykorzystywanymi w dopuszczonych protokołach terapii genowej np. nowotworów

38 Podstawowe kryteria którymi należy kierować się przy tworzeniu wektorów wirusowych np. niosących terapeutyczne DNA to bezpieczeństwo specyficzność i stabilność dostarczania genów efektywność namnażania się w liniach komórkowych (produkcyjnych) - wysokie miano (liczba cząsteczek rekombinowanego wirusa w jednostce objętości) prosty system produkcji możliwość dostarczania materiału genetycznego o dużych rozmiarach brak immunogenności Aktualnie nie dysponujemy jednym uniwersalnym nośnikiem wirusowym, a powyższe cechy charakteryzują różne systemy wektorów. W związku z tym faktem, poszczególne systemy wirusowe wykorzystuje się do odpowiednich strategii i/lub konkretnych zastosowań np. terapii genowych

39 Co w trakcie konstrukcji wektora można usunąć z wirusa a co musi w nim pozostać? Funkcje (i geny) wirusowe można podzielić na cis i trans. Cis to takie które nie mogą zostać usunięte z genomu wirusa np. miejsce startu replikacji lub sygnał "pakujący". Natomiast trans to geny których funkcje mogą z powodzeniem zostać zastąpione przez analogi pochodzące od zmodyfikowanych linii komórek pakujących. Zwykle dąży się do tego aby wszystkie geny trans usunąć z genomu wirusa i umieścić je w genetycznych elementach pomocniczych. Daje to dużo miejsca na obce geny a poza tym zwiększa bezpieczeństwo, gdyż tak powstały wirus jest niezdolny do namnażania się poza komórkami pakującymi

40 Rekombinowane wektory retrowirusowe Wektory retrowirusowe oparte są najczęściej na Mysim Wirusie Białaczki Moloney a - MoMLV (Moloney Murine Leukemia Virus). Jest to podstawowa grupa znajdująca swoje główne zastosowanie w terapii nowotworów, gdyż mają one naturalną skłonność do infekowania intensywnie dzielących się komórek LTR - gag - pol - env - (onc) - LTR gag strukturalne białka płaszcza wirusa pol odwrotna transkryptaza env glikoproteiny otoczki wirusa LTR - Long terminal repeat sekwencja promotorowo-regulatorowa na każdym z końców genomu RNA wirusa

41 Ponieważ wektor jest wahadłowy możemy go zrekombinować w bakteriach np. E. coli

42 Drugi składnik to linia komórek tzw. pakujących z prowirusem pozbawionym sekwencji psi a posiadającym geny kodujące białka otoczki wirusa i odwrotną transkryptazę (geny: gag, pol, env). DNA retrowirusa z włączonym do niego obcym genem (pierwszy składnik) wprowadza się do komórek pakujących W komórkach pakujących DNA retrowirusa zostaje przepisane na RNA a to z kolei jest pakowane jest w otoczki białkowe. Takie wiriony izoluje się i infekuje nimi komórki docelowe, w których następuje przepisanie RNA na DNA, które z kolei włączane jest do chromosomu właściwego biorcy

43 wektory wahadłowe rekombinuje się w bakteriach np. E. coli a do komórek eukariotycznych (pakujących) wprowadza się gotowe konstrukty

44 Osobną grupę wektorów retrowirusowych stanowią pochodne lentivirusów, takich jak HIV. Mogą one zakażać nie tylko komórki dzielące się lecz praktycznie wszystkie. Wektor pochodzący od HIV, po wyeliminowaniu genów pomocniczych (np. vif, vpr, vpu i nef) jest w miarę bezpiecznym i skutecznym wektorem.

45 Wektory adenowirusowe Adenowirusy to wirusy o genomie długości ok. 36 kpz zawierającym ds DNA, nie posiadające otoczki Adenowirusy mogą infekować duży wachlarz typów komórek, także nie dzielące się i są w miarę łagodne. Ekspresja genów wprowadzony za ich pomocą jest silna i stabilna ale dość krótkotrwala, ponieważ DNA wirusa znajduje się poza DNA gospodarza (nie integrują się z genomem gospodarza) i dlatego nie ulega replikacji. W kolejnych pokoleniach komórek wprowadzonego DNA jest coraz mniej. Doskonale nadają się do terapii genowej mającej na celu zniszczenie komórek (suicide genes), lecz nie są odpowiednie do dostarczania genów terapeutycznych.

46 AAV- wirusy towarzyszące adenowirusom Należą one do niepatogennych ludzkich parvowirusów, które do namnażania wymagają obecności wirusów pomocniczych (najczęściej są to adenowirusy) (wada i zaleta). Atrakcyjność tego typu wektorów polega na tym, iż nie powodują żadnych ludzkich chorób (bo przy braku adenowirusa są defektywne replikacyjnie) Mają dość dużą pojemność (tylko ok. 4% genomu wirusa jest niezbędna) mogą dostarczać DNA do niedzielących się komórek. w naturalnej formie wbudowują geny do chromosomów gospodarza co pozwala na przedłużoną ekspresję transgenu

47 Wektory bazujące na herpeswirusach Spośród herpeswirusów jako wektory są wykorzystywane dwa: Herpes simplex virus i Epstein-Barr virus. Wirusy herpes nie wbudowują swojego materiału genetycznego w genom gospodarza. Mają one powinowactwo do neuronów, dlatego bada się je głównie pod kątem ukierunkowanej terapii genowej tkanki nerwowej, m.in. w leczeniu choroby Parkinsona, złośliwych nowotworów mózgu Herpes simplex virus Połowa wielkości genomu herpeswirusów nie jest istotna dla ich wzrostu w hodowli komórkowej (pojemność wektora herpeswirusowego wynosi kb). Epstein-Barr virus ma duży genom (ok. 172 kb), a przy tym konieczne elementy stanwią w sumie ok. 4 kb. Pozwala to na wprowadzenie bardzo dużych fragmentów DNA

48 Wektory pochodne bakulowirusów eukariotyczne wektory ekspresyjne rodzina wirusów DNA chorobotwórczych dla stawonogów, głównie owadów. Genom bakulowirusów stanowi duży (128 kpz), kolisty, dwuniciowy DNA. wektor skonstruowany został z sekwencji bakteryjnych ori i genu oporności na antybiotyk a także kasety ekspresyjnej, w skład której w chodzi polilinker i sekwencje regulacyjne genu polihedryny bakulowirusa czyli promotor i terminator. komórki owadów lub całe larwy transfekuje się mieszaniną DNA bakulowirusa i zlinearyzowanego wektora niosącego zrekombinowany gen i gen markerowy umożliwiający selekcję w komórkach owadów. Wewnątrz komórki dochodzi do homologicznej rekombinacji i utworzenia zrekombinowanego wirusa. System pozwala uzyskiwać typowe dla wyższych eukariontów modyfikacje potranslacyjne eksprymowanych białek. Wydajność produkcji jest dość niska a koszt stosunkowo wysoki. Znajdują one zastosowanie przy produkcji niektórych leków.

49 Markery selekcyjne stosowane w wektorach eukariotycznych W eukariotycznych komórkach biorcy najczęściej selekcjonuje się tzw. markery dominujące, czyli geny wyrażane w każdym tle genetycznym (nie są to geny oporności na antybiotyki) Wyjątkami jeśli chodzi o markery selekcyjne będące genami oporności, które mogą być użyte w komórkach eukoriotycznych są: Kan - gen kodujący kinazę kanamycyny (możliwa do użycia w komórkach roślinnych) oporność na kanamycynę Neo bakteryjny gen oporności na neomycynę. Może on ulegać ekspresji w komórkach eukariotycznych jeśli wyposaży się go w eukariotyczne sekwencje regulatorowe Neo może być używane do selekcji komórek eukariotycznych, ponieważ produkt genu inaktywuje antybiotyk G418, który jest toksyczny dla komórek eukariotycznych. Ponadto nie występuje spontaniczna oporność na G418 w komórkach eukariotycznych.