PODSTAWY BIOTECHNOLOGII Piotr Solarczyk

Transkrypt

1 PODSTAWY BIOTECHNOLOGII Piotr Solarczyk EFEKT KOŃCOWY Po zakończeniu seminarium powinieneś umieć: wyjaśnić pojęcia plazmid, fag, wektor, wektor ekspresyjny i czółenkowy, klonowanie, transfekcja, transformacja, insert, episom, wymienić i scharakteryzować poznane wektory, scharakteryzować enzymy restrykcyjne, omówić budowę sztucznych chromosomów bakteryjnych i drożdżowych, scharakteryzować metody bezpośredniego wprowadzania DNA do komórek. Biotechnologia jest interdyscyplinarną dziedziną nauki, która obejmuje wiele kierunków technicznego wykorzystania materiałów i procesów biologicznych. Europejska Federacja Biotechnologii (EFB) opisuje tę dziedzinę jako integrację nauk przyrodniczych i inżynieryjnych w celu osiągnięcia zastosowań organizmów, komórek lub ich części oraz molekularnych analogów dla pozyskania produktów lub usług. Współczesna biotechnologia ma zastosowanie głównie w przemyśle spożywczym, chemicznym, farmaceutycznym, medycynie, rolnictwie i w ochronie środowiska. Przedstawienie podstaw biotechnologii jest niezwykle trudne ze względu na złożoność zagadnień i szybki rozwój technik biologii molekularnej. Poniższy przegląd dotyczy jedynie wybranych aspektów laboratoryjnej pracy z DNA. Pierwszym etapem pracy z materiałem genetycznym jest izolacja DNA, która polega na oddzieleniu DNA od innych struktur komórkowych oraz od cząsteczek RNA i białek (histonów). DNA można uzyskać z prawie każdego materiału biologicznego (np. z krwi, nasienia, plwociny, kału, bakterii). Do niedawna w celu izolacji DNA wykorzystywano metodę z użyciem fenolu i chloroformu, a obecnie coraz częściej korzysta się z komercyjnych zestawów. Każda procedura izolacji DNA powinna zakończyć się oceną jego ilości i jakości. Wyizolowany DNA można przechowywać w temperaturze +4 C lub - 20 C. Wyizolowany, totalny kwas nukleinowy powinien być albo hydrolizowany odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi albo powinien być bezpośrednio namnożony za pomocą PCR. Dalszym procesem, w zależności od założeń, jest klonowanie w wektorach i transformacja komórek gospodarza. Badanie powinno zakończyć się analizą i/lub ekspresją odpowiednich genów/fragmentów DNA w komórkach docelowych. Enzymy restrykcyjne Enzymy restrykcyjne (endonukleazy restrykcyjne, restryktazy) to są enzymy bakteryjne rozpoznające i hydrolizujące DNA w określonych miejscach. Restryktazy są zaangażowane w obronę komórki bakteryjnej przed wirusami. Znanych jest kilka klas restryktaz. Największe znaczenie mają enzymy II klasy. Dotychczas wyizolowono kilkaset enzymów restrykcyjnych, których nazwy pochodzą od gatunku bakterii, np. Eco RI wyizolowano z Escherichia coli ze szczepu RY 13, a Sau3A z Staphylococcus aureus. Oprócz restryktaz, istnieje szereg innych enzymów wykorzystywanych w inżynierii genetycznej. Należą do nich: - ligazy pozwalające na łączenie fragmentów DNA, - egzonukleazy umożliwiające odpowiednią "obróbkę" końców w modyfikowanych fragmentach DNA, - polimerazy, które są odpowiedzialne za powielanie (amplifikację) odpowiednich odcinków DNA (PCR - reakcja łańcuchowej polimerazy). 1

2 Sekwencje restrykcyjne to krótkie, palindromowe fragmenty 1 DNA rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne. Endonukleazy rozpoznają z reguły sekwencje o długości 4 do 8 pz, a produkty ich trawienia mają zakończenia w postaci jednoniciowego ogona na końcu 3` lub 5` ( lepkie końce). Lepkie końce umożliwiają łączenie fragmentów DNA pochodzących z różnych źródeł. Zatem jest to stosunkowo prosty sposób na wbudowanie fragmentów DNA do plazmidów lub DNA innych wektorów. Ogólna charakterystyka plazmidów i bakteriofagów Plazmid to pozachromosomowa, z reguły kolista cząsteczka DNA zdolna do samodzielnej replikacji, która występuje u prokariota i niektórych organizmów eukariotycznych. Plazmidy pełnią w komórkach funkcje pomocniczych chromosomów i są przenoszone w trakcie procesu koniugacji między komórkami bakteryjnymi. Jednym z najlepiej poznanych plazmidów jest plazmid F z E. coli. Jest to plazmid typu koniugacyjnego, ponieważ jest transferowany z komórki donora do akceptora. Szczepy bakterii zawierają różną liczbę plazmidów. Plazmidy ulegają replikacji niezależnie od macierzystego genomu bakterii, także w komórkach gospodarzy należących do innych gatunków. Chociaż plazmidy nie są one konieczne do życia bakterii, to jednak mogą: (1) powodować oporność na antybiotyki i jony metali ciężkich, (2) umożliwiać katabolizm toksycznych związków (toluen), (3) wpływać na chorobotwórczość bakterii oraz na zdolność do syntezy związków oddziaływujących na rozwój innych bakterii, (4) umożliwiać interakcje z roślinami (wiązanie azotu) oraz koniugację bakterii. Plazmidy można wyizolować niezależnie od chromosomu bakteryjnego. W pracach molekularnych, w których wykorzystuje się E. coli, stosuje się także wiele bakteriofagów (wirusy infekujące bakterie). Bakteriofagi pasożytują w organizmach prokariotycznych, dlatego wykazują znaczne podobieństwo do swoich gospodarzy. Bakteriofagi mają różne kształty - ikosaedralne 2, pałeczkowate, helikalne lub są w postaci główki z ogonem. W ich budowie wyróżnia się jedno- lub dwuniciowy DNA lub RNA, otoczony białkiem kapsydu 2. Namnażanie fagów jest szybkie, wskutek czego na jedną komórkę bakteryjną przypadają setki cząsteczek faga. W przyrodzie występuje wiele różnych typów fagów, które infekują tylko określone gatunki bakterii. Ekspresja genomu faga wymaga zawsze enzymów komórkowych bakterii, ponieważ wirus nie jest zdolny do samodzielnego powielenia się. Jednym z najlepiej poznanych fagów jest fag λ, którego można używać jako wektora do klonowania. Fag λ, o wielkości 48 kpz, naturalnie infekuje bakterie E. coli wstrzykując dwuniciowy, liniowy DNA do komórki, w której przekształca się w formę kolistą. To przekształcenie umożliwiają sekwencje cos znajdujące się na końcach liniowego DNA faga. DNA faga albo ulega replikacji i tworzy potomne cząsteczki wirusa uwalniane na drodze lizy komórki bakteryjnej (droga lityczna) albo ulega integracji z genomem gospodarza i pozostaje w nim przez długi czas (droga lizogeniczna). W cyklu litycznym ekspresji ulegają wszystkie geny wirusa, podczas gdy ekspresja i replikacja genów gospodarza jest zahamowana. Z zarażonej komórki uwalnia się ok. 100 potomnych cząstek wirusowych (wirionów). Natomiast zintegrowana forma wirusa (zwana profagiem), pozostaje w komórce gospodarza przez wiele pokoleń. Przerwanie szlaku lizogenicznego może nastąpić dopiero wtedy, gdy zainfekowana komórka zostanie narażona na bodźce chemiczne lub fizyczne (np. promieniowanie); ekspresja genów faga zachodzi w różnym czasie po infekcji; najpierw następuje ekspresja genów, tzw. natychmiastowych, a następnie opóźnionych. W końcu powstają białka strukturalne niezbędne do złożenia nowych cząstek wirusa i lizy komórki. 1 Sekwencja palindromowa - sekwencja zasad w jednej nici DNA jest identyczna jak odczytywana wspak sekwencja nici komplementarnej. 2 Wirusy o symetrii ikosaedralnej kapsyd tych wirusów ma bardzo uporządkowaną strukturę, składa się z dwudziestu trójkątnych ścian i dwunastu rogów, czyli wierzchołków. 2 kapsyd zbudowana z wielu podjednostek (kapsomerów) otoczka białkowa chroniąca DNA wirusa. 2

3 Wektory Wektor to cząsteczka DNA (wirus, plazmid, kosmid, lub sztuczny chromosom), która służy do wprowadzenia obcego materiału genetycznego do innego gospodarza. Wektor, w którym umieszcza się stosunkowo krótki fragment DNA, zawierający badany gen lub sekwencję, nazywany jest rekombinowanym DNA. Wektory stosuje się do klonowania i amplifikacji sekwencji DNA, badania mechanizmów ekspresji DNA, wprowadzania genów do komórek zwierzęcych (transfekcja) i bakteryjnych (transformacja). Każdy wektor nie powinien zakłócać funkcji życiowych komórek gospodarza. Natomiast powinien posiadać zdolność do niezależnej replikacji razem z wbudowanym fragmentem DNA. Wektor powinien być też łatwo wykrywalny w komórce za pomocą genów markerowych. Jednym z ważniejszych problemów w biotechnologii jest pojemność wektora, która decyduje o wielkości wprowadzanego DNA (wielkości klonowanego insertu). Plazmidy, które są najczęściej stosowane jako wektory, mają najmniejszą pojemność; w przypadku klonowania dłuższych insertów stosowane są bakteriofagi, kosmidy, sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) E. coli lub sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC) Saccharomyces cerevisiae (Tabela 1). Tabela 1. Pojemność wybranych wektorów. Wektor Wielkość insertu wektor ekspresyjny ok. 8 kpz plazmid (E. coli) ok. 15 kpz fag λ ok. 25 kpz kosmid ok. 45 kpz BAC ok. 500 kpz YAC ok kpz W biotechnologii stosowane są także wektory plazmidowe dla drożdży, tzw. episomalne wektory drożdżowe (YEps), które służą do klonowania i ekspresji genów w komórkach drożdży S. cerevisiae. YEps są zbudowane na bazie plazmidu 2µ naturalnie występującego u drożdży. Wektory episomalne, mimo że replikują jak plazmidy, mogą albo włączać się do chromosomu drożdży albo pozostać pozachromosomowo. Odmienne nośniki przystosowano do włączenia obcego DNA do genomu roślinnego, ponieważ praca z materiałem roślinnym wymaga zastosowania nieco innej strategii. Najczęściej wykorzystywany jest bakteryjny plazmid Ti z bakterii Agrobacterium tumefaciens, która naturalnie infekuje rośliny dwuliścienne (pomidor, tytoń, groch) oraz rośliny jednoliścienne (ryż). Podczas naturalnej infekcji, część plazmidu Ti zwana T-DNA, włączana jest do chromosomowego DNA roślinnego, co powoduje niekontrolowany wzrost komórek roślinnych (guzowatość szyjki korzenia, czyli zrakowacenie). Wektory do wprowadzania DNA do innych komórek eukariotycznych, np. utrzymywanych w hodowlach tkankowych, są konstruowane w oparciu o wirusy, które naturalnie infekują dany gatunek gospodarza. DNA wektora utrzymywany jest w komórce pozachromosomowo albo też w formie zintegrowanej z genomem gospodarza (SV40, bakulowirusy, retrowirusy, adenowirusy). Wektory plazmidowe Wektory oparte na plazmidach są stosowane jako narzędzia do poznawania genomów komórek roślin i zwierząt. Wektor plazmidowy musi zawierać region początku replikacji (ori), który pozwala na niezależne namnażanie się w komórkach. Należy jednak podkreślić, że proces niezależnego namnażania wektora zachodzi z udziałem polimerazy i innych składników cytofizjologii komórki gospodarza. Drugim ważnym miejscem w wektorze plazmidowym jest wielokrotne miejsce klonowania (wiele miejsc rozpoznawanych przez różne enzy- 3

4 my restrykcyjne, MCS). Jest to miejsce, do którego wprowadza się badany fragment DNA, czyli insert. Wektor plazmidowy musi posiadać promotor. Niektóre wektory plazmidowe wymagają sekwencji wiążącej rybosom (RBS) i kodonu inicjacji translacji, a inne - sekwencji umożliwiającej łatwiejsze oczyszczenie na drodze chromatografii (metka HisTag). Wektory, które służą do ekspresji klonowanych fragmentów DNA w komórkach, nazywamy plazmidowymi wektorami ekspresyjnymi. Wektory bakteriofagowe (fagi) Wektory bakteriofagowe pozwalają na wklonowanie większego insertu niż wektory plazmidowe; np. do cząsteczki faga λ można wprowadzać insert o wielkości 25 kpz. Na podstawie faga λ opracowano szereg innych wektorów, zwanych wektorami wymiennymi (np. EMBL3 lub λdash). Jako wektory w pracach z E. coli używa się także fagi pałeczkowate, np. M13. Cząsteczki tego wirusa zawierają kolisty, jednoniciowy DNA. Po wniknięciu faga M13 do komórki bakteryjnej syntetyzowana jest komplementarna nić i fagowy DNA powiela się już jako dwuniciowy kolisty DNA; ta forma replikacyjna (RF) występuje w około 100 kopiach na komórkę. W przeciwieństwie do faga λ, fag M13 nie powoduje lizy komórek bakteryjnych, a tylko spowalnia ich wzrost. Ponadto, oprócz formy RF, jednocześnie powstają opakowywane kapsydem cząsteczki jednoniciowego DNA, które są uwalniane z komórek w kolejnych podziałach bakterii. Użyteczną cechą wektora M13 jest to, że formę RF można oczyszczać i stosować tak jak plazmid, a jednocześnie można izolować DNA wektora z pożywki w formie jednoniciowej. Wiele wektorów plazmidowych opracowano jako hybrydowe połączenia z fagiem M13, np. wektor pbluescript, który zawiera zarówno fagowe i plazmidowe miejsce początku replikacji, lecz nie posiada genów potrzebnych do pełnego cyklu życiowego faga. Wektory hybrydowe łączą zalety łatwej obróbki i szybkiego wzrostu. Kosmidy Kosmidy są sztucznie stworzonymi wektorami, powstałymi z połączenia plazmidu i sekwencji cos faga λ (sekwencja odpowiedzialna za cyrkulizację DNA). Kosmidy z wprowadzonym insertem są pakowane w kapsydy i są wykorzystywane do zakażenia komórek bakteryjnych. W przeciwieństwie do faga λ, kosmidy nie niszczą zainfekowanych komórek. Najprostszym wektorem kosmidowym jest typowy plazmid z miejscem ori i markerem selekcyjnym, zawierającym dodatkowo sekwencję cos i odpowiednie miejsce restrykcyjne do klonowania. Po trawieniu (cięciu) wektora odpowiednim enzymem restrykcyjnym i zligowaniu 3 z docelowym insertem, kosmid pakowany jest do cząsteczek fagowych. Po wprowadzeniu większego insertu do kosmidu wydłuża się czas jego replikacji oraz zmniejsza się liczba jego kopii. Kosmidy umożliwiają klonowanie długich fragmentów DNA (ok. 45 kpz). Sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC) Wektor YAC jest wektorem bifunkcjonalnym, ponieważ jest zdolny do powielania w komórkach bakterii i drożdży. S. cerevisiae to organizm dobrze scharakteryzowany metodami fizjologicznymi i biochemicznymi, który jest hodowany w warunkach in vitro na dużą skalę, m.in. dla potrzeb przetwórstwa żywności, ponieważ nie wytwarza toksyn, a hodowle nie ulegają zakażeniom wirusowym. Sekwencje drożdżowe centromeru (CEN 4), telomeru (TEL) i miejsca początku replikacji (ARS) zostały wyizolowane i połączone z plazmidami skonstruowanymi dla E. coli. Sekwencja TEL stanowi część DNA, która w komórkach drożdży wydłużana jest przez enzym telomerazę. Sekwencja CEN 4 funkcjonuje prawidłowo podczas 3 ligacja DNA łączenie się odcinków DNA poprzez wytwarzanie wiązań fosfodiestrowych za pomocą enzymu ligazy DNA. 4

5 segregacji chromosomów S. cerevisiae w procesie mitozy. Sekwencja ARS pełni rolę miejsca początku replikacji, podobnie jak sekwencja ori u bakterii. Chociaż w wektorach YAC można klonować bardzo długie odcinki DNA, często okazuje się, że klonowane inserty zawierają nieciągłe sekwencje, przez co są niestabilne. Sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) Wektory BAC skonstruowano, aby uniknąć problemów związanych ze stosowaniem wektorów YAC. Do wektorów BAC można wprowadzić insert o długości około kpz. W porównaniu do wektorów YAC, wektory BAC są bardziej stabilne, łatwiej się nimi transformuje komórki E. coli oraz łatwiej je namnażać i izolować z komórek bakteryjnych. Wektory BAC zbudowane są na bazie plazmida F; zawierają geny istotne dla replikacji i utrzymywania się w komórce bakterii E. coli. Wektory BAC są obecnie używane w projektach mapowania genów. Wektory eukariotyczne oparte na wirusach Transfekcja jest procesem, który polega na wprowadzeniu obcego DNA do komórek eukariotycznych. Rekombinowanie organizmów wyższych stwarza więcej problemów niż transformacja bakterii. Komórki, do których może wniknąć obcy DNA w warunkach in vitro, nazwane są komórkami kompetentnymi. Wiele wektorów stosowanych do transfekcji komórek eukariotycznych skonstruowano jako wektory czółenkowe, zwane również wektorami wahadłowymi, ponieważ zawierają sekwencje potrzebne do replikacji i selekcji w E. coli oraz w komórkach eukariotycznych. Dzięki technikom biologii molekularnej możliwe jest usuwanie z genomu wirusów genów związanych z ich cyklem rozwojowym i wstawianie w ich miejsce genu terapeutycznego. Tak zmodyfikowany wirus nie ulega namnażaniu w komórce gospodarza, ale pozostawia w niej wprowadzony insert. Retrowirusy 4 potrafią zakażać wiele rodzajów komórek, lecz ulegają stabilnej integracji z DNA gospodarza, co nie zawsze jest korzystne. Adenowirusy mogą wnikać do nie dzielących się komórek, ale wywołują niepotrzebną reakcję odpornościową gospodarza. Chociaż niektóre wirusy AAV, często towarzyszące adenowirusom, nie wywołują odpowiedzi układu odpornościowego, to jednak w warunkach laboratoryjnych trudno uzyskać je w dużej liczbie. Wektory skonstruowane w oparciu o genom herpetowirusów (wirus opryszczki, HSV) mogą infekować także nie dzielące się komórki i przenosić duże fragmenty obcego DNA. Wirus HSV, pomimo chorobotwórczości, jest jednym z najważniejszych kandydatów do wykorzystania jako wektor. Bakulowirusy infekują komórki owadów i powodują nadekspresję białka - poliedryny, która gromadzi się w zakażonych komórkach. Ta cecha bakulowirusów wykorzystywana jest do nadekspresji obcych genów, dzięki czemu można produkować duże ilości białka w hodowli zainfekowanych komórek owadów. Metoda ta jest coraz częściej stosowana do produkcji białek pochodzenia zwierzęcego na dużą skalę. Do wprowadzania genów do komórek ssaków wykorzystywane są wirusy ssaków. Jednym z pierwszych użytych do tego celu był wirus SV40 infekujący wiele gatunków ssaków. Natomiast, retrowirusy, których genomy zbudowane są z RNA, planuje się do użycia w terapii genowej, ponieważ obcy DNA może być za ich pośrednictwem włączony do genomu gospodarza w stabilny sposób. Dodatkową zaletą retrowirusów jest niska immunogenność, natomiast ich wadą jest wywołanie mutacji w DNA gospodarza. Najczęściej wykorzystywanym wektorem retrowirusowym jest wirus białaczki mysiej Moloneya (MoMuLV). Istotnym ograniczeniem jest fakt, że do retrowirusów nie można wbudować insertu większego niż 1 kpz. 4 Retrowirusy posiadają genom RNA oraz kodują odwrotną transkryptazę; niektóre mają budowę ikosaedralną (np. HIV). 5

6 Inne metody wprowadzania DNA do komórki Niektóre obecnie stosowane wektory nie są precyzyjne w swoim działaniu, inne niezbyt wydajnie przenoszą DNA, a jeszcze inne pobudzają niepożądaną odpowiedź układu odpornościowego gospodarza. Stąd prowadzone są intensywne badania nad syntetycznymi nośnikami DNA. Liposomy to zamknięte pęcherzyki lipidowe, w których umieszcza się zrekombinowany DNA; zapewnia to ochronę przed nukleazami (enzymy hydrolizujące kwasy nukleinowe). Liposomy mogą być użyte do przenoszenia DNA przez błonę komórkową. Niestety wydajność tej metody jest niska. Natomiast zaletą tej metody jest fakt braku odpowiedzi immunologicznej w komórkach zwierzęcych. Jednakże jest to metoda pracochłonna i duże fragmenty DNA nie zawsze udaje się właściwie zapakować do liposomów bez uszkodzeń. Obcy DNA może być także wprowadzany do komórek eukariotycznych bez użycia wektora, czyli na drodze bezpośredniego przenoszenia genów. Istnieje kilka metod bezpośredniego transferu fragmentu obcego DNA do komórki docelowej. Elektroporacja to proces zachodzący w błonie komórkowej pod wpływem wyładowań pól elektrycznych (milisekundy), który powoduje odwracalne zmiany w błonie komórkowej. W przypadku komórek drożdży i roślin, ściana komórkowa musi być wcześniej strawiona za pomocą enzymów; dopiero wtedy powstaje delikatny protoplast zdolny do przyjęcia obcego DNA. Protoplast jest wystawiony na działanie krótkich impulsów elektrycznych rzędu mikroi milisekund o wysokim napięciu. Następnie protoplast przenoszony jest do pożywki w celu odtworzenia ściany komórkowej i namnożenia. Mikrowstrzeliwanie polega na wprowadzeniu DNA opłaszczonego na mikroskopijnych kulkach złota lub wolframu za pomocą urządzenia zwanego armatką genową. Mikroiniekcja stosowana jest do wprowadzania obcego DNA do komórek zwierząt; w tym celu trzeba wyizolować zygotę lub wczesny embrion i przy pomocy szklanej mikropipety wprowadzić obcy DNA do jądra komórki. W celu dalszego rozwoju ztransformowaną komórkę umieszcza się w zastępczej matce. Zaletą tej metody jest wysoka wydajność, lecz wadą - pracochłonność. Biotechnologia jest jedną z najszybciej rozwijających się dziedzin nauki. Niesie za sobą korzyści i niebezpieczeństwa. Zatem należy pamiętać, aby zawsze stawiać pytanie jak daleko można się posunąć aby nie naruszyć delikatnej równowagi stworzonej przez naturę. Zalecane piśmiennictwo i strony internetowe: 1. Turner P. C., McLennan A. G., Bates A. D., White M. R. H.,(przekład zbiorowy pod redakcją Zofii Szweykowskiej-Kulińskiej), Biologia molekularna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa,