Ukończono projekt poznania ludzkiego genomu (2003) oraz projekty poznania genomów wielu zwierząt modelowych Co wynika z tej informacji?

Transkrypt

1 Ukończono projekt poznania ludzkiego genomu (2003) oraz projekty poznania genomów wielu zwierząt modelowych Co wynika z tej informacji? -znamy całkowitą sekwencję (kolejność nukleotydów) -funkcja wielu genów jest nieznana

2 Sposoby badania funkcji genów: -analiza spontanicznych mutacji -analiza mutacji wywołanych sztucznie -nokaut (knock-out) -knockin -pułapki na geny (gene-trap) -wywołanie nadekspresji (transgeneza)

3 Mutacje spontaniczne powstają samoistnie w czasie prowadzenia hodowli. Mutacja ms (mosaic) na mysim chromosomie X Delecja w chromosomie Y u myszy

4 Wywoływanie mutacji: 1. Środki mutagenne: - promieniowanie UV, - związki radioaktywne - chemikalia

5 Wady: Niska częstość mutacji Przypadkowość mutacji. Większość mutacji ma miejsce w obszarach niekodujących. Większość mutacji nie manifestuje swojej obecności. Otrzymywanie fenotypów spoza kręgu zainteresowań.

6 Nokaut celowane przerwanie ciągłości genu poprzez wprowadzenie konstruktu na drodze homologicznej rekombinacji. Allel typu dzikiego Konstrukt Neo skrzydło skrzydło Allel zmutowany Neo Uszkodzony gen

7 Budowa konstruktu do nokautu genetycznego 5 homolog Neo 3 homolog TK Promotor + neo ORF + polia Promotor + TK ORF + polia

8 Przed rekombinacją homologiczną ATG Ex1 Ex2 Ex3 5 homolog TK 3 homolog Neo Konstrukt Neo Po rekombinacji homologicznej Ex2 Ex3

9 Niespecyficzne wbudowanie wektora TK Po dodaniu gancyklowira komórki giną

10 Innoser.nl

11 aa 129/Sv AA AA Agouti F1 ze skrzyżowania chimery z osobnikiem aa C57Bl czarne aa aa AA AA aa AA Chimera

12 Konstrukt do nokautu składany jest w oparciu o wektor plazmidowy

13 Strategia wykrywania komórek po homologicznej rekombinacji Southern blot A Shamsadin i in.1999

14 Southern Blot

15 +/+ +/- -/- Shamsadin i in.1999 Southern-blot

16 Przykład fenotypu w lini myszy ze znokautowanym genem cyrytestyny Oocyt z osłonką przejrzystą Osłonka przejrzysta Oocyt bez osłonki przejrzystej Plemniki samca +/+ Plemniki samca -/- Shamsadin i in.1999

17 Nokaut warunkowy Jeżeli klasyczny nokaut daje fenotyp letalny Jeżeli chcemy zbadać efekt wyłączenia genu w konkretnym typie komórek Uszkodzenie genu można ograniczyć do określonych komórek, tkanek, narządów lub określonych stadiów rozwojowych

18 Innoser.nl

19 loxp (ang. locus of crossover in P1): - 34 pz - specyficznie rozpoznawana przez Cre-rekombinazę - Cre pozyskiwana jest z faga P1 ATAACTTCGTATA -NNNTANNN-TATACGAAGTTAT flippase recognition target (FRT) - 34 pz - specyficznie rozpoznawana przez FLP-rekombinazę - FLP izolowana z drożdży GAAGTTCCTATTC-TCTAGAAA-GTATAGGAACTTC

20 Przed homologiczną rekombinacją ATG Ex1 Ex2 Ex3 ATG 5 homolog Cel Neo 3 homolog TK Konstrukt ATG Ex1 Neo Ex2 Ex3 Po homologicznej rekombinacji Zmutowany allel działa dopóki rekombinaza Cre nie wytnie sekwencji spomiędzy loxp

21 Przed rekombinacją homologiczną ATG Ex1 Ex2 Ex3 5 homolog Cel Neo 3 homolog TK Konstrukt ATG Ex1 Neo Ex2 Ex3 Po rekombinacji homologicznej Neo Ex2 Ex3 ATG Ex1 Ex2 Ex3 W komórkach ES traktowanych rekombinazą Cre

22 Innoser.nl

23 Promotory przed rekombinazą Cre: - Indukowalne - Tkankowo specyficzne - Specyficzne w określonym stadium rozwoju

24

25 Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny lub fizjologii w 2007 roku za osiągnięcia w odkryciu podstaw specyficznych modyfikacji genetycznych myszy. Sir Martin J. Evans Mario R. Capecchi Oliver Smithies

26 Ograniczenia metody knock-out: -musimy znać gen docelowy - musimy znać krytyczne miejsca genu docelowego (aktywne domeny, miejsce startu trankrypcji, translacji itp.) Nie można stosować tej metody do badania funkcji nieznanych genów.

27 Pułapki na geny (gene-trap) to metoda podobna do nokuatu z tym, że konstrukt nie zawiera żadnych sekwencji specyficznych genowo. Można ją stosować do badania nowych, nieznanych genów. Konstrukty używane w gene-trap: "łapiące" sekwencje wzmacniające (enhancer-trap, ET), pułapki na promotory (promotor-trap, PT) pułapki na geny (gene-trap, GT)

28 Schemat metody gene-trap

29

30 Quantitative Southern-blot

31

32

33 Mamy już fenotyp, a więc znamy już funkcję badanego genu. W genomie mutanta mamy marker pozwalający szybko znaleźć uszkodzony gen. Łatwo zidentyfikować rodzaj wprowadzonego uszkodzenia.

34 Transgeneza Wywołanie nadekspresji określonego genu Cele badawcze Poznanie roli mutacji genetycznych Poznanie molekularnych mechanizmów kontroli ekspresji genów Poznanie biochemicznych/molekularnych przyczyn chorób człowieka Tworzenie modeli do testowania nowoczesnych metod terapii Produkcja białek wykorzystywanych w medycynie czy przemyśle

35 Ittner i Gotz, 2007, Nature protocols, vol 2, No 5

36

37 W przeciwieństwie do homologicznej rekombinacji integracja wektora do transgenezy zachodzi przypadkowo Może być integracja wielokrotna Przy wyprowadzaniu linii nie można krzyżować ze sobą osobników uzyskanych z różnych komórek (tzw. founder)

38 Transgeniczne myszy z ekspresją genu GFP (promotor aktyny)

39 Ekspresja zmutowanego białka Tau człowieka w hipokampie myszy Model choroby Alzheimera Ittner i Gotz, 2007, Nature protocols, vol 2, No 5

40 Promotory: - Tkankowo/komórkowo specyficzne - Indukowalne

41 System indukowalnej ekspresji Cre/loxP - Rekombinaza Cre może być aktywna pod kontrolą indukowalnego promotora np. estrogenowego (stymulacja tamoksyfenem) - W konstrukcie ekspresyjnym zawierającym badany gen wprowadzamy sekwencję blokującą ekspresję oflankowaną sekwencjami loxp - Aby system działał oba wektory muszą być obecne w komórce

42 Indukcja Cre/loxP FRÉDÉRIC JAISSER JASN 2000;11:S95-S by American Society of Nephrology

43 System regulowanej ekspresji Tet-off/Tet-on Tet represor (TetR) z E. coli negatywnie reguluje aktywność operonu oporności na tetracyklinę (i jej pochodne) poprzez wiązanie się do operatora transpozonu Tn10 przy braku tetracykliny. Stanowi to podstawę opracowania systemów kontrolowanej ekspresji w komórkach ssaków opartych o aktywność białka regulacyjnego kodowanego przez TetR (po odpowiednich modyfikacjach)

44 System Tet-off - Pierwsze 207 aa zostały podłączone do 127 aa domeny aktywatorowej białka VP16 izolowanego z wirusa Herpes. Dzięki temu białko fuzyjne nabrało cech aktywatora transkrypcji. - To białko o masie 37 kda nazwane jest transaktywatorem kontrolowanym przez tetracyklinę (tetracycline-controlled transactivator, tta). - Białko to kodowane jest przez ptet-off plazmid regulatorowy. W plazmidzie tym jest także gen oporności na neomycynę, który pozwala na wyselekcjonowanie komórek transgenicznych i uzyskanie stabilnej transfekcji.

45 System Tet-off - Drugim ważnym składnikiem jest plazmid zawierający badany gen oraz sekwencje regulowane przez rta, czyli zawierający element odpowiadający na tetracyklinę (tetracycline-response element, TRE). - Plazmid zawierający TRE jest wyposażony w minimalny promotor (np. CMV pozbawiony enhancera) zapewniający minimalną ekspresję wklonowanego genu w nieobecności tta. - Aby system działał oba plazmidy muszą być obecne w komórce - Po połączeniu tta z tetracykliną lub jej pochodną np. doxocykliną nie może ono połączyć się z TRE

46

47 System Tet-on - Białko TetR zosatło zmodyfikowane przez zamianę czterech aa i stworzono odwrócony represor Tet ("reverse" Tet repressor, rtetr) - Białko to kodowane jest przez ptet-on plazmid regulatorowy. W plazmidzie tym jest także gen oporności na neomycynę, który pozwala na wyselekcjonowanie komórek transgenicznych i uzyskanie stabilnej transfekcji.

48 System Tet-on - Drugim ważnym składnikiem jest plazmid zawierający badany gen oraz sekwencje regulowane przez rta, czyli zawierający element odpowiadający na tetracyklinę (tetracycline-response element, TRE). - Plazmid zawierający TRE jest wyposażony w minimalny promotor (np. CMV pozbawiony enhancera) zapewniający minimalną ekspresję wklonowanego genu w nieobecności tta. - Aby system działał oba plazmidy muszą być obecne w komórce - Po połączeniu rtetr z tetracykliną lub jej pochodną np. doxocykliną może ono połączyć się z TRE

49

50 Porównanie systemów Cre/lox i Tet-off/on - Włączenie/wyłączenie - Specyfika - Wydajność

51 Anioł i inni, 2002

52

53 Przyszłość: Znamy już genom, przyszłość to analiza funkcji, wzajemnych interakcji i regulacji genów. Rozwój baz danych np. Sanger Center, Jackson Laboratory, KOMP itp., gdzie czekają gotowe myszy ze zmutowanymi genami. Nowe metody indukowanego włączania/wyłączania genów.

54 Poznanie funkcji genów umożliwia: Badanie przyczyn ludzkich chorób dziedzicznych. Opracowanie modeli zwierzęcych dla ludzkich chorób dziedzicznych. Opracowanie strategii zapobiegania występowania objawów u ludzi obarczonych chorobą dziedziczną. Stosowanie terapii genowej.

55 2014 lek na gorączkę krwotoczną (wirus Ebola) - Produkowany w myszach, testowany na małpach (rezus) - Wyleczeni: Kent Brantly (33 lata) i Nancy Writebol (59 lat)