11. OZNACZANIE ILOŒCIOWE W HPLC

Transkrypt

1 Oznaczane lo cowe w HPLC.qxp :58 Page OZNACZANIE ILOŒCIOWE W HPLC Rafa³ Kartanowcz Celem rozdzelana meszanny substancj na poszczególne sk³adnk, b¹dÿ tylko wybranych substancj od nnych, jest najczêœcej ch loœcowe oznaczene, tj. ustalene zwartoœc lub masy analtu w bardzo du ej próbce. Wysokosprawna chromatografa ceczowa (HPLC) jest wykorzystywana do oznaczena zawartoœc sk³adnków g³ównych, t.j. wystêpuj¹cych w próbce na pozome stê eñ w zakrese od 1 do 100 %, sk³adnków poœrednch - od do 1% oraz substancj obecnych w analzowanej próbce pon ej 0.001%, tj. sk³adnków œladowych. Oznaczene loœcowe w HPLC polega na ustalenu zale noœc pomêdzy sygna³em detektora, czyl powerzchn¹ pod pkem lub ewentualne wysokoœc¹ pku, a stê enem lub mas¹ sk³adnka, którego zawartoœæ zamerzamy oznaczyæ. W praktyce mamy do dyspozycj cztery metody oznaczana: metodê wzorca zewnêtrznego (metodê krzywej kalbracyjnej ang. external standard ), metodê wzorca wewnêtrznego (ang. nternal standard ), metodê dodatku wzorca (metodê fortyfkacj) oraz metodê prostej normalzacj lub normalzacj ze wspó³czynnkam korekcyjnym (ang. normalzaton ) METODA WZORCA ZEWNÊTRZNEGO (METODA KRZYWEJ KALIBRACYJNEJ) Istot¹ metody wzorca zewnêtrznego jest wyznaczene zale noœc pomêdzy powerzchn¹ (wysokoœc¹) pku dla ka dej z oznaczanych substancj ch stê enem lub mas¹. W tym celu przygotowuje sê roztwory kalbracyjne, tzn. roztwory substancj oznaczanej albo meszanny analzowanych substancj w klku ró nych stê enach (np. 1.0, 2,0, 3.0, 4.0 mg/ml). Ka dy z przygotowanych roztworów, dozowany jest do kolumny chromatografcznej. Na podstawe powerzchn lub wysokoœc pków, na podstawe uzyskanych chromatogramów wyznacza sê przebeg krzywej kalbracyjnej, b¹dÿ oblcza sê wartoœc wspó³czynnków w równanu kalbracyjnym dla ka dej z oznaczanych substancj. Nastêpne, dozowane do kolumny rozdzelane s¹ próbk, w których oznaczona ma byæ zawartoœæ substancj. Uzyskane powerzchne pków substancj oznaczanych w neznanej próbce, umo lw¹ oznaczene ch zawartoœc, tj. stê ena (masy). W praktyce wykonuje sê to metod¹ grafcznej nterpolacj na wykrese krzywej kalbracyjnej, w oparcu o równane krzywej kalbracyjnej lub z wykorzystanem równana (1). Ax C albo (1) x = Cx = Ax rf R f gdze: C x - oznaczona zawartoœæ sk³adnka x, A x - powerzchna pku, R f, r f - wspó³czynnk odpowedz, tj. loraz powerzchn pku stê ena substancj o znanym stê enu w roztworze wzorcowym albo odwrotne. Gdy równane kalbracyjne wyra one jest funkcj¹ typy f(x) = a 1 x, 166

2 Oznaczane lo cowe w HPLC.qxp :58 Page 167 Rys Wykres krzywej kalbracyjne otrzymanej metod¹ wzorca zewnêtrznego. Rys Chromatogramy roztworów wzorcowych substancj A, B, C o stê enach 1.0, mg/ml. to wspó³czynnk odpowedz jest wspó³czynnkem kerunkowym a 1 tej prostej, dla których wykonano kalbracjê. Na rysunku przedstawono odpowedno: typow¹ krzyw¹ kalbracyjn¹ uzyskan¹ metod¹ wzorca zewnêtrznego oraz chromatogramy roztworów wzorcowych. Stosowane tej metody kalbracj wymaga, aby zarówno roztwory wzorcowe jak analzowane próbk by³y rozdzelane ( chromatografowane ) w tych samych warunkach temperatu- 167

3 Oznaczane lo cowe w HPLC.qxp :58 Page 168 ry, objêtoœcowego natê ene przep³ywu eluentu, typu wymarów kolumny chromatografcznej, z regu³y tej samej kolumny, sk³adu eluentu oraz takego samego programu elucj. Ponadto trzeba braæ te pod uwagê nastêpuj¹ce czynnk: Równane kalbracyjne jest najczêœcej zale noœc¹ prostolnow¹ typu y = a 1 x + a 2, ale nekedy do opsu przebegu krzywej kalbracyjnej wykorzystuje sê nne funkcje: y = a1x, 2 y = a1x + xa2 + a3 3 2 y = a1x + a2x + xa3 + a4 n y = a x 1 2 gdze: y - powerzchna pku(wysokoœæ), x - stê ene (masa) substancj, a 1,2,3,4 - wspó³czynnk, n - wyk³adnk poteg. Dozowane do kolumny chromatografcznej pownno byæ powtarzalne. Oznaczane zawartoœc substancj w próbkach neznanych mo e byæ wykonywane tylko w zakrese stê eñ, w jakm zosta³a wykona kalbracja, dotyczy to tak e nnych metod tj. metody wzorca wewnêtrznego czy fortyfkacj. Ekstrapolacja przebegu krzywej kalbracyjnej poza zakres wykonanej kalbracj, mo e byæ Ÿród³em nedok³adnych wynków oznaczeñ ze wzglêdu na nelnowy przebeg odpowedz detektora METODA WZORCA WEWNÊTRZNEGO Jest to metoda polegaj¹ca na dodanu do próbk znanej loœc sk³adnka, tzw. wzorca wewnêtrznego (IST), który jest jednak nny od substancj oznaczanych ne mo e byæ obecny w analzowanych próbkach przed jego dodanem. W celu uzyskana krzywej kalbracyjnej, do klku roztworów wzorcowych o ró nych stê enach substancj oznaczanej, dodaje sê najczêœcej sta³¹ znan¹ loœæ wzorca wewnêtrznego. Na podstawe uzyskanych chromatogramów roztworów wzorcowych, wykreœla sê zale noœæ stê ena analtu w funkcj stosunku powerzchn pku analtu wzorca wewnêtrznego. Na rysunku 11.3 przedstawono krzyw¹ kalbracyjn¹ dla substancj oznaczanej metod¹ wzorca wewnêtrznego. Rys Wykres krzywej kalbracyjnej otrzymanej przy zastosowanu technk wzorca wewnêtrznego. 168

4 Oznaczane lo cowe w HPLC.qxp :58 Page 169 W celu oznaczena zawartoœc substancj metod¹ wzorca wewnêtrznego (o znanej mase lub objêtoœc), dodaje sê znan¹ loœæ wzorca wewnêtrznego do próbk badanej. Nastêpne z chromatogramu oblcza sê stosunek powerzchn pku analtu wzorca wewnêtrznego. Zawartoœæ substancj oznaczanej wyznacza sê metod¹ grafcznej nterpolacj. Oblcza sê j¹ z równana krzywej kalbracyjnej lub z wykorzystanem zale noœc (2) (3) - w sytuacj, kedy krzywa kalbracyjna jest zale noœc¹ lnow¹ typu f(x) = a 1 x: Ax / Ast Cx = (2) R f R f = A / A c st ( ) (3) gdze: C x - oznaczona zawartoœæ sk³adnka x, A x - powerzchna pku analtu x, A st - powerzchna pku wzorca wewnêtrznego, R f - wspó³czynnk odpowedz, A, A st() - powerzchna pku analtu wzorca wewnêtrznego w roztworze kalbracyjnym, - stê ene analtu w roztworze kalbracyjnym. c Na rysunku 11.4 przedstawono chromatogram meszanny wzorcowej substancj oznaczanych oraz wzorca wewnetrznego. W praktyce, aby unezale næ wynk od stopna rozceñczena próbk spowodowanego dodawanem roztworu wzorca wewnêtrznego, kalbracja jest wykonywana w oparco o stê ena substancj wzorcowych, a oznaczene zawartoœc analtów, w oparcu o masê próbk o masê dodanego wzorca wewnêtrznego. Wzorzec wewnêtrzny pownen spe³naæ nastêpuj¹ce wymagana: mus byæ rozdzelony od nnych sk³adnków wystêpuj¹cych w próbce czas retencj pownen byæ zbl ony do czasu retencj analtu(ów) Rys Chromatogram meszanny substancj oznaczanych A, B, C, D oraz wzorca wewnêtrznego (IST). 169

5 Oznaczane lo cowe w HPLC.qxp :58 Page 170 ne wystêpuje w próbkach perwotnych w³aœcwoœc fzyko-chemczne s¹ podobne do analtu. Jest to szczególne stotne na etape przygotowana próbek (oczyszczana, wzbogacana czy derywatyzacj) pownen byæ mo lwe wysokej czystoœc stablny chemczne odpowedÿ detektora dla wzorca wewnêtrznego pownna byæ zbl ona do odpowedz substancj oznaczanych Metoda ta ma zastosowane szczególne w przypadku metod analtycznych wymagaj¹cych z³o onej, weloetapowej procedury przygotowana próbk (zolacja, wzbogacane, derywatyzacja tp.), co mo e powodowaæ straty analtów. Dodane wzorca wewnêtrznego do badanej próbk jeszcze przed przyst¹penem do przegotowana próbk do analzy chromatografcznej pozwala na skorygowane tych strat. Stosowane metody wzorca wewnêtrznego pozwala równe na unezale nene otrzymywanych wynków od wahañ loœc dozowanej próbk. Ogranczanem w stosowanu tej metody mo e byæ bardzo bogata matryca, w której znajduj¹ sê analty. Trudne mo e byæ wtedy dobrane odpowednej substancj jako wzorca wewnêtrznego. W praktyce metoda ta jest neco bardzej pracoch³onna n metoda krzywej kalbracyjnej METODA DODATKU WZORCA Metoda ta polega na dodanu do próbk znanych loœc (najkorzystnej znanej masy) substancj oznaczanych (analtów) np. 0.1, 0.2, 0.3, mg/ml, zwykle jest to od 50 do 150% oczekwanej zawartoœc oznaczanej substancj. Na podstawe uzyskanych chromatogramów, wykreœla sê krzyw¹ kalbracyjn¹, tj. zale noœæ powerzchn pku analtu w funkcj loœc analtu dodanej do próbk (rys. 11.5). Nastêpne przeprowadza sê grafczn¹ ekstrapolacjê krzywej kalbracyjnej do punkt przecêca z os¹ odcêtych odczytuje sê wartoœæ Cx. Innym sposobem okreœlena zawartoœc substancj oznaczanej w próbce bez dodatku wzorca jest grafczne wyznaczene przebegu nowej ln kalbracyjnej typu f(x) = a 1 x, o tym samym wspó³czynnku nachylena prostej, co krzywa kalbracyjna. Przeprowadza sê wówczas grafczn¹ nterpolacjê, b¹dÿ oblcza sê stê ene analtu w próbce bez dodatku substancj oznaczanej z równana (4), na przyk³ad: Cx=22.5/120=0.19. Rys Wykres krzywej kalbracyjnej otrzymanej przy zastosowanu metody dodatku wzorca. 170

6 Oznaczane lo cowe w HPLC.qxp :58 Page 171 a = c x = a 2 ( x 0) 1 (4) gdze: a 1 - wspó³czynnk kerunkowy prostej, a 2 - wartoœæ w punkce przecêca sê prostej z os¹ rzêdnych. Nale y ne zapomnaæ o uwzglêdnenu stopna rozceñczena w przypadku dodawana wzorca w postac rozceñczonego roztworu! Zalet¹ metody dodatku wzorca jest wykonane kalbracj w takch warunkach, e analty znajduj¹ sê w rzeczywstej matrycy. Szczególne, kedy jest bardzo trudne b¹dÿ nemo lwe otrzymane matrycy (placebo), w której ne znajdowa³aby sê substancja oznaczana, np. w przypadku próbek klncznych œrodowskowych. Szczególn¹ cecha tej metody jest jej wysoka odpornoœæ na sytuacjê nepe³nego rozdzelena analtu oraz, gdy pk substancj oznaczanej ne jest rozdzelony do ln podstawowej, od nnych substancj, których pk s¹ jednak znaczne mnejsze w stosunku do substancj oznaczanej. Na rysunku 11.6 przedstawono przyk³ad takego chromatogramu, na którym pk substancj oznaczanej zaznaczono symbolem 1. W wy ej wymenonych sytuacjach tylko metoda dodatku wzorca pozawala na oznaczene zawartoœc substancj w próbce. Wykonane oznaczena zawartoœc substancj metod¹ dodatku wzorca jest jednak pracoch³onne. Rys Chromatogram meszanny substancj, w której analt (1) ne jest w rozdzelony do ln bazowej od nnych substancj METODA PROSTEJ NORMALIZACJI Metoda prostej normalzacj ne jest metod¹ kalbracj. Ne stosuje sê w nej odnesena do znanej loœc wzorca. Jednak e metoda ta umo lwa oszacowane wzglêdnych loœc substancj np. zawartoœc zaneczyszczeñ w badanej próbce. Na podstawe chromatogramu oblcza sê sumaryczn¹ powerzchnê pków, któr¹ traktuje sê jak 100%. Nastêpne oblcza sê udza³ powerzchn okreœlonego pku wzglêdem sumy powerzchn wszystkch lub tylko wybranych pków na chromatograme. Otrzymanej wartoœc 171

7 Oznaczane lo cowe w HPLC.qxp :58 Page 172 Rys Chromatogram meszanny substancj, na którym podano udza³y procentowe sk³adnków otrzymane metod¹ prostej normalzacj. dla danej substancj przypsuje sê procentow¹ zawartoœc wzglêdem nnych substancj obecnych w meszanne. Oblczena wykonuje sê zgodne z pon szym równanem (5): A c = 100 (5) ΣA gdze: c - udza³ % substancj wzglêdem nnych pków na chromatograme, A - powerzchna pku, ΣA - suma powerzchn wszystkch lub wybranych pków na chromatograme Na rysunku 11.7 chromatogram meszanny substancj oznaczanych oraz ch udza³y procentowe w próbce uzyskanê metod¹ prostej normalzacj. Metoda prostej normalzacj opera sê na za³o enu, e wspó³czynnk odpowedz dla ka dego sk³adnka próbk s¹ take same, tzn. take same stê ena ró nych substancj odpowadaj¹ takm samym powerzchnom ch pków chromatografcznych. Tak¹ charakterystyk¹ cechuje sê detektor FID (p³omenowo-jonzacyjny) stosowany w chromatograf gazowej do oznaczana wêglowodorów. W chromatograf ceczowej metoda uproszczonej normalzacj jest stosowana bardzo rzadko. Wynka to st¹d, e detektory stosowane w HPLC charakteryzuj¹ sê zró ncowan¹ czu³oœc¹ wzglêdem substancj. Stosowane detektora typu UV-VIS metody prostej normalzacj jest ne celowe, ponewa nawet substancje nale ¹ce do tego samego szeregu homologcznego charakteryzuj¹ sê zró ncowanym molowym wspó³czynnkam absorbancj (ε). Zatem odpowedÿ detektora UV-VIS zale y od stê ena substancj jak molowego wspó³czynnka absorbancj Korzystne mo e byæ stosowane metody prostej normalzacj, gdy wykorzystywany jest detektor refraktometryczny lub detektor œwat³a rozproszonego. Detektory te wykazuj¹ zbl on¹ odpowedÿ dla ró nych substancj o zbl onej strukturze mase cz¹steczkowej, szczególne dla substancj nale ¹cych do tej samej grupy zw¹zków chemcznych. 172

8 Oznaczane lo cowe w HPLC.qxp :58 Page METODA NORMALIZACJI ZE WSPÓ CZYNNIKAMI KOREKCYJNYMI Metoda ta, podobne jak metoda prostej normalzacj, polega na okreœlenu wzglêdnej powerzchn pku substancj badanej wzglêdem wybranych b¹dÿ wszystkch pków na chromatograme z uwzglêdnenem wspó³czynnków korekcyjnych, uwzglêdnaj¹cych zró ncowan¹ odpowedÿ detektora dla ró nych sk³adnków próbk. Wspó³czynnk korekcyjne wykorzystuje sê w celu oznaczena rzeczywstego udza³u procentowego poszczególnych substancj w próbce analzowanej zgodne z równanem (6). A R f c = 100 (6) Σ( A R ) gdze: c - udza³ %-owy substancj, A - powerzchna pku, ΣA - suma powerzchn wszystkch lub wybranych pków na chromatograme, - wspó³czynnk odpowedz (wspó³czynnk korekcyjny) dla substancj R f, W celu wyznaczena wspó³czynnków korekcyjnych postêpuje sê w sposób nastêpuj¹cy. Na podstawe chromatogramu meszanny o znanych zawartoœcach substancj badanych oblcza sê pola powerzchn pków, a nastêpne wzglêdny udza³ procentowy poszczególnych substancj metod¹ prostej normalzacj. W dalszej kolejnoœc oblcza sê wartoœæ wspó³czynnka korekcyjnego dla okreslonej substancj korzystaj¹c z równana (7). c ( znane) R f = (7) c ( oblczone) f gdze: c (znane) - zawartoœæ sk³adnka w roztworze wzorcowym, c (oblczone) - udza³ sk³adnka w rozworze wzorcowym oblczony metod¹ prostej normalzacj. Na przyk³ad, dla substancj A, B, C, D, przedstawonych na chromatograme na rysunku 7 wyznaczone wspó³czynnk korekcyjne wynosz¹: R fa = 1, R fb = 1.1, R fc = 1.1, R fd = 1.2, st¹d uzyskane zawartoœc po uwzglêdnenu wspó³czynnków korekcyjnych poszczególnych sk³adnków wynosz¹: A , B , C , D [%]. 173