Sekwencjonowanie wczoraj i dziś

Transkrypt

1 Sekwencjonowanie wczoraj i dziś dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

2 Cel sekwencjonowania dostarcza wielu cennych informacji o strukturze i funkcji genów, znajomość pełnej sekwencji DNA badanych organizmów umożliwia zrozumienie molekularnych mechanizmów ich funkcjonowania i ewolucji umożliwia szukanie mutacji

3 Naukowcy zakończyli sekwencjonowanie pełnego genomu neandertalczyka, wymarłego około 30 tys. lat temu bliskiego krewniaka człowieka Zgodnie z przewidywaniami genomy człowieka i neandertalczyka są w 99,5% identyczne (człowieka i szympansa - w 98%). Archeologia molekularna - Historia człowieka czyk-powraca/

4 Pochodzenie człowieka Analiza fragmentów jądrowego i mitochondrialnego DNA ze szczątków ą paleontologicznych i archeologicznych pozwala badać pochodzenie człowieka

5 Historia rozwoju metod sekwencjonowania DNA 1953 opracowanie modelu podwójnej helisy DNA przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka 1972 opracowanie sposobów izolacji materiału do dalszych badań. Rozwój technologii rekombinacji umożliwiający izolację dowolnych fragmentów DNA i ich replikację Allan Maxam i Walter Gilbert ogłaszają publikację pt.: Sekwencjonowanie DNA przez chemiczną degradację. W tym samym czasie Sanger opublikował też metodę sekwencjonowania DNA przez syntezę katalizowaną enzymatycznie Fred Sanger i Walter Gilbert otrzymali Nagrodę Nobla utworzono Gen bank publicznie dostępną bazę danych sekwencji DNA Andre Marion i Samuel Eletr utworzyli firmę Applied Biosystems, która w tym okresie zdominowała automatyczne sekwencjonowanie DNA 1982 Akiyoshi Wada zbudował roboty sekwencyjne dla firmy Hitachi kompletna sekwencja wirusa Epstein Barr, 170 kb zsekwencjonowano 5Mb genom bakterii. 2001, 15 lutego Konsorcjum HUGO opublikowało sekwencję genomu ludzkiego w Nature. 2001, 16 lutego firma Celera Genomics opublikowała sekwencję genomu ludzkiego w Science.

6 Metoda Maxama Gilberta (1977) Polega na użyciu związkówchemicznych do specyficznego rozczepienia DNA Przeprowadza się 4 niezależne reakcje, w których wykorzystuje się 4 różne odczynniki specyficzne dla poszczególnych zasad: 1. reakcja G DMS piperydyna 2. reakcja G+C G+C kwas mrówkowy, piperydyna 3. reakcja T+C hydrazyna, piperydyna 4. reakcja C hydrazyna y + NaCl, piperydyna pp y

7 Metoda Sangera metodaterminacji terminacji wydłużaniałańcucha łańcucha (tzw. metoda dideoksy) Wykorzystuje polimerazę DNA, która ma zdolność do syntezy wiernej, komplementarnej kopii jednoniciowego DNA matrycowego oraz używa 2 3 dideoksynukleotydów jako substratów

8 Enzymy używane w sekwencjonowaniu powinny charakteryzować się: 1. wysoką procesywnością 2. brakiem aktywności egzonukleazy Brakiem aktywności egzonukleazy 3 5

9 Enzymem wykorzystywanym do reakcji wydłużania startera początkowo był fragment polimerazy DNA Klenowa (brak aktywności egzonukleolitycznej 5 3 ) Fragment Klenowa polimerazy z E.coli zastąpiono naturalną lub modyfikowaną polimerazą DNA z faga T7 wprowadzenie dideoksynukleotydów jest mniej zakłócone przez lokalne sekwencje nukleotydów, prążki o wyrównanej intensywności

10 Zastosowanie polimerazy z termofilnej jbkt bakterii Thermus aquaticus (Taq DNA polimeraza) pozwala na prowadzenie reakcji terminacji łańcucha w temperaturze C, co minimalizuje artefakty spowodowane II go rzędową strukturą DNA Tabor i Richardson w 1995r zamienili resztę fenyloalaniny l Taq DNA polimerazy na resztę tyrozyny (termostabilny enzym sekwencyjny nie rozróżnia dideoksynukleotydów od deoksynukleotydów).

11 Matryca w postaci ss DNA DNA sklonowany na wektorze plazmidowym DNA sklonowany na wektorze M13 DNA sklonowany na fagmidzie Zastosowanie PCR do otrzymania jednoniciowegodna

12 produkty PCR do sekwencjonowania B B Matryca DNA PCR z jednym biotynylowanym starterem Biotynylowany produkt PCR streptawidyna B P M P Paramagnetic particle Wychwycenie przez streptawidynę ę sprzężoną ę ą z kuleczkami magnetycznymi Denaturacja alkaliczna B P M P Sekwencjonowanie obu nici DNA

13 Starter wyznacza sekwencjonowany region na matrycowym DNA 1. Starter uniwersalny (do amplifikacji fr. o dł. 750 pz) DNA wektora 3 5 DNA wektora DNA wstawki DNA przeznaczone do sekwencjonowania może być wklonowany w jedno ze zgrupowanych miejsc klonowania w regionie i lac wektorów M13 serii mp co pozwala na używanie ciągle tego samego startera, ułatwia również izolację pojedynczych nici DNA do sekwencjonowania 2. Starterywewnętrzne 3 5

14 Detekcja Żel sekwencyjny 6 20%; 7 molarny mocznik (zapobiega tworzeniu się struktur II rzędowych): duża ż rozdzielczość, dil rozdział diłjd jednoniciowych ii (zdenaturowanych) fragmentów DNA elektroforeza przebiega przy natężeniu prądu wystarczającym do podgrzania żelu do ok.70 C, co przeciwdziała powstawaniu II rz. struktur. Autoradiografia Nieizotopowe metody identyfikacji: chemiluminescencyjne, chromogeniczne, fluorogeniczne

15 W mieszaninie reakcyjnej powstaje zbiór częściowo zsyntetyzowanych cząsteczek z których każda zawiera taki sam koniec 5, ale różni się długością od strony końca 3. Rys. T.A. Brown Genomy PWN 2001

16 Automatyczne sekwencjonowanie z wykorzystaniem dideoksyrybonukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (1987 r Prober i wsp.) Wydruk z sekwenatora, sekwencja w postaci serii szczytów, z których każdy odpowiada innemu nukleotydowi Rys. T.A. Brown Genomy PWN 2001

17 Nowe sekwenatory Rozdział w kapilarach, a nie w żelu poliakryloamidowym 96 kanałów 96 sekwencji (2 godziny); 1000 sekwencjowań w ciągu doby Sk Sekwencjonowaniecykliczne cykliczne Sears i wsp Wyróżnia się dwiema cechami, których nie ma metoda tradycyjna: materiałem wyjściowym jest dsdna (np. produkty PCR) nie ma konieczności ś i klonowania przed sekwencjonowaniem wystarcza niewielka ilość DNA

18 Produkt PCR + wyznakowany starter +dntp + polimeraza Taq Preparatywny PCR namnożenie wybranego fragmentu genu przy użyciu ż pary specyficznych starterów ddna dsdna Mieszanina reakcyjna 1 starter ddatp ddatp ddttp ddctp ddgtp Zamiast startera barwnikami fluorescencyjnymi można ż wyznakować ć dideoksynukleotydy dda dda dda dda Sekwencjonowanie cykliczne asymetryczny PCR (liniowy) denaturacja przyłączanie i startera wydłużanie startera cykli terminacja Denaturacja produktów Elektroforeza i odczyt sekwencji Porównywanie z sekwencją z dostępnych baz danych takich jak GenBank i EMBL.

19 Pirosekwencjonowanie 1 ATACCTATAAC GG A Polimeraza DNA + dntp PPi +APS 2 sulfurylaza ATP 4 apyraza + 3 lucyferaza dndps + dnmps + fosforan i ADP + AMP + fosforan Lucyferyna oxylucyferyna Etap 1: w obecności enzymów (polimerazy DNA, apyrazy, lucyferazy, sulfurylazy ATP) i substratów (adenozyno 5 -fosfosiarczanu APS i D-lucyferyny), sekwencyjny starter jest przyłączany do matrycy DNA uzyskanej w wyniku PCR i wydłużany przez polimerazę DNA. Podczas inkorporacji każdego z nukleotydów, nieorganiczny pirofosforan PPi jest usuwany w równomolarnych ilościach. Etap 2: w obecność APS, sulfurylaza ATP odwraca PPi do ATP. Etap 3: wytworzone ATP na etapie 2 jest wykorzystywane przez lucyferazę do katalizy konwersji lucyferyny do oxylucyferyny, która emituje światło w ilości proporcjonalnej do ilości zużytego ATP. Etap 4. Podczas reakcji polimeryzacji, apyraza degraduje niewintegrowane dntp. Apyraza również degraduje nadmiar ATP wytworzonych z wyniku działania sulfurylazy ATP.

20 Pirosekwencjonowanie i starter Matrycowy DNA datp degradacja dttp degradacja dgtp Chemiluminescencja = G dctp datp degradacja Chemiluminescencja = GA

21 GGATATTG Dodawanie nukleotydu Przykład pirogramu sekwencyjnego. Podczas postępu w syntezie DNA, wydłużana jest nić komplementarna. Software produkuje piki na grafie zwanym pirogramem. Jest on proporcjonalny do ilości wbudowanych dntp podczas syntezy. Na rycinie pokazano ano przykładową ą sekwencję encję docelową ą GGATATTG. Wyższe piki przy pierwszym G i drugim T świadczą, że mamy podwójne G i T. Software automatycznie dodaje kontrole, aby ocenić jakość matrycy. W tym pirogramie, dwie reszty cytozyny reprezentują taka kontrolę. Jeżeli matrycowe DNA jest skontaminowane to obserwuje się ę piki na tych resztach. E: enzym; S: substrat.

22 Kolekcja izolatów Izolacja DNA Amplifikacja PCR fragmentów genów pz Sekwencjonowanie (dideoxy) Kolekcja danych Nowe sekwencje alleli i weryfikacja ST Określenie sekwencji nukleotydowej Zgromadzenie danych sekwencji nukleotydowych Profile alleliczne i identyfikacja typu sekwencji (ST) Przydział ST do kompleksu klonalnego Analiza danych Badanie populacji Badania epidemiologiczne Analiza Sekwencji ML Diagram badawczy MLST

23 Sekwencje nukleotydowe dla każdego z fragmentów genu są traktowane jako allele, tworząc profil alleliczny, czy typ sekwencji ST (ang. Sequence Type) dla badanego szczepu. Izolaty o tym samym profilu allelicznymsą ą zaliczane do tej samej grupy klonalnej. Wariantem metodymlstjestsekwencjonowanie sekwencjonowanie wielu regionówmiędzy międzygenowych. Pozwala to na osiągnięcie wyższego stopnia zróżnicowania niż w przypadku sekwencjonowania genów podstawowego metabolizmu komórkowego.

24 Multilocus Sequence Typing (MLST) dla S.aureus Chromosomalne DNA Amplifikacja wewnętrznych fragmentów siedmiu housekeeping ggenes arcc aroe glp gmk pta tpi yqil Sekwencja 7 fragmentów Każda różnica w sekwencji w danym locus daje różną liczbę alleli Liczba alleli MLST loci daje alleliczny profil izolatów Porównuje się profile alleliczne izolatów z centralna bazą danych na internecie

25 MLST Maiden M C J, Bygraves J A, Feil E, Morelli G, Russell J E, Urwin R, Zhang Q, Zhou J, Zurth K, Caugant D A, Feavers I M, Achtman M and Spratt B G (1998) Multilocus sequence typing: A portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: Urwin R, Maiden MC. (2003) Multi locus sequence typing: a tool for global epidemiology. i Trends Microbiol. Oct;11(10): David M. Aanensen* and Brian G. Spratt (2005) The multilocus sequence typingnetwork: network: mlst.net netnucleicacidsresearch Research, Vol. 33, Maiden MC. Multilocus sequence typing of bacteria.annu Rev Microbiol. 2006;60:561 88