Techniki odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA

Transkrypt

1 Techniki odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA 1. Metoda chemicznej degradacji DNA (metoda Maxama i Gilberta 1977) 2. Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA - klasyczna metoda Sangera (Sanger i wsp. 1977) Obydwie metody sprowadzają się do uzyskania puli (zbioru) cząsteczek DNA zakończonych określonym nukleotydem A, C, G lub T, różniących się długością o 1 nt 3. Metody sekwencjonowania odmienne od tradycyjnych (tj. klasycznej metody Sangera) Metody określane jako NGS next generation sequencing: np. takie w których nie używa się ddntp np. pirosekwencjonowanie

2 1. Metoda chemicznej degradacji DNA w metodzie cząsteczki DNA zakończone określonym nukleotydem otrzymuje się przez działanie odczynnikami specyficznie tnącymi nić DNA w miejscu określonego nukloetydu Wyjściowym materiałem jest dsdna, które przed rozpoczęciem degradacji znakuje się na końcu 5. Uzyskujemy pulę cząsteczek z wyznakowaną zawsze tą samą nicią. Dodaje się ograniczoną ilość siarczanu dimetylu, tak że w poszczególnych cząsteczkach metylowana jest losowo tylko jedna G DNA jest ciągle nienaruszone. Dodaje się piperydyny usunięcie zmetylowanego pierścienia G i przecina ssdna przed miejscem pozbawionym zasady azotowej. Uzyskuje się pulę cząsteczek, wyznakownych na końcu 5 a różniących się długością na końcu 3

3 Metoda chemicznej degradacji DNA Rodzaj zasad azotowych Odczynnik do modyfikacji zasady Odczynnik do usunięcia zmodyfikowanej zasady Odczynnik do przecięcia nici DNA G Siarczan dimetylu Piperydyna Piperydyna A+G Kwas Kwas Piperydyna C+T Hydrazyna Piperydyna Piperydyna C Hydrazyna + alkalia Piperydyna Piperydyna A>C Alkalia Piperydyna Piperydyna Istnieje trudność w uzyskiwaniu chemicznej reakcji specyficznie degradującej w pozycji A i T. Dlatego przeprowadza się zwykle cztery równoczesne reakcje dla; G, A+G, C i C+T. Nie ma to wpływu na wierność odczytywanej sekwencji.

4 Metoda chemicznej degradacji DNA Produkty degradacji poddaje się elektroforezie w żelu poliakrylamidowym Ponieważ są one wyznakowane radioaktywnie przeprowadza się autoradiografię w celu ich wizualizacji Autoradiogram czytamy od dołu

5 2. Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA metoda Sangera (metoda dideoksy) do uzyskania cząsteczek DNA zakończonych określonym nukleotydem A, C, G lub T stosuje się syntezę cząsteczek DNA in vitro Materiałem wyjściowym (w oryginalnej metodzie) było jednoniciowe - ssdna fragment DNA do sekwencjonowania trzeba było sklonować do wektora, który umożliwia otrzymanie ssdna np. fagowego M13 lub fagemidu) Opiera się na wykorzystaniu ddntp (3 dideoksynukleotydów, pozbawionych grupy hydroksylowej na końcu 3 ), które polimeraza DNA może wbudowywać w syntetyzowaną nić DNA Wbudowanie ddntp sprawia, że łańcuch DNA nie może być dalej wydłużany, czyli ddntp działa jak terminator syntezy DNA.

6 Jak długi fragment (czyli ile nukleotydów) można było przeczytać w pojedynczej reakcji? Na standardowym 6% żelu poliakrylamidowym można odczytać kolejność kilkuset nukleotydów (ok. 650 nt) Dodatkowe zabiegi zwiększające wydajność odczytu Na żelu 8% możliwe jest odczytanie sekwencji leżących bliżej startera (zakres pz) Na żelu 4% możliwe jest odczytanie sekwencji leżących dalej od startera ( pz)

7 Modyfikacje metody Sangera umożliwiające automatyzację procesu sekwencjonowania DNA wybór optymalnej polimerazy DNA zamiana 33 P na 35 S do znakowania dntp (ostrzejsze prążki, lepsze odczyty sekwencji wczesne lata 80-te) wprowadzenie do znakowania dntp barwników fluorescencyjnych zastosowanie ddntp znakowanych różnymi barwnikami fluorescencyjnymi automatyczny sekwenator DNA LI-COR (koniec lat 80-tych)

8 Polimeraza do sekwencjonowania musi spełniać trzy warunki: 1. Wysoka procesywność zdolność syntezy odpowiednio długiego odcinka DNA i oddysocjowanie dopiero po włączeniu ddntp 2. Brak aktywności egzonukleazy 5-3 (lub nieznaczna taka aktywność) zdolność zastępowania istniejącego łańcucha DNA zjawisko niekorzystne w sekwencjonowaniu, ponieważ usuwanie nukleotydów z końca 5 nowosyntetyzowanego łańcucha skraca go uniemożliwiając odczytanie prawidłowej sekwencji z wzoru prążków po autoradiografii 3. Brak aktywności egzonukleazy 3-5 (lub nieznaczna taka aktywność) aktywności korektorskej polimeraza pozbawiona tej aktywności nie usuwa wbudowanych ddntp kończących łańcuch po ich włączeniu Fragment Klonowa pochodna pol DNA I E. coli, pozbawiona aktywność exo 5-3 WADA: ma niską procesywność Sekwenaza: zmodyfikowana polimeraza faga T7 (1987) wysoka procesywność, brak aktywności egzonukleolitycznej, dodatkowy atut to duża szybkość przeprowadzonej reakcji.

9 Modyfikacje metody Sangera umożliwiające automatyzację procesu sekwencjonowania DNA wybór optymalnej polimerazy DNA zamiana 33 P na 35 S do znakowania dntp (ostrzejsze prążki, lepsze odczyty sekwencji wczesne lata 80-te) wprowadzenie do znakowania dntp barwników fluorescencyjnych zastosowanie ddntp znakowanych różnymi barwnikami fluorescencyjnymi+ reakcja PCR do syntezy cząsteczek DNA automatyczny sekwenator DNA LI-COR (koniec lat 80-tych)

10 Sekwencjonowanie automatyczne (cykliczne ) Zasada reakcji pozostaje bez zmian opiera się na syntezie DNA z użyciem ddntp Zmiana dotyczy sposobu przeprowadzenia syntezy DNA: wykorzystuje się reakcję PCR i termostabilną polimerazę Taq (a właściwie jej zmodyfikowaną wersję, w której Phe z centrum aktywnego zastąpiono Tyr, co znacznie zmniejszyło dyskryminację ddntp przez polimerazę Otrzymaną pulę cząsteczek zakończonych określonym nukleotydnem analizuje się albo przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym albo elektroforezę kapilarną Zalety w stosunku do metody oryginalnej metody Sangera: Możliwość stosowania dsdna jako matrycy, np. plazmidowego, genomowego DNA łatwość przygotowania matrycy (nie trzeba klonować odcinka DNA przed sekwencjonowaniem do jakiegokolwiek wektora) Dzięki zastosowaniu reakcji PCR sekwencjononowania wystarcza bardzo mała ilość matrycowego DNA

11 Reakcja cyklicznego sekwencjonowania przebiega podobnie do reakcji PCR, ale wykorzystuje się w niej tylko jeden starter syntetyzowana jest tylko jedna nić analizowanej cząsteczki matrycowego dsdna - asymetryczny PCR (często jest on dodatkowo dwustopniowy dla podniesienia wierności amplifikacji) Cztery różne kolory fluoroforów, którymi wyznakowane są ddntp, oznacza układ: 1 matryca=1 reakcja a to daje możliwość analizy większej ilości próbek na jednym żelu Każdy z ddntp wyznakowany jest innym fluoroforem, co umożliwia prowadzenie reakcji w jednej próbówce 1 matryca = 1 reakcja

12 Do sekwencjonowania genomów potrzebna jest wysoka przepustowość użytych technik Problem: czy można odczytać sekwencje odcinka DNA długości kilkuset kpz w jednej reakcji enzymatycznej? 1. Sekwencjonowanie klonów biblioteki genomowej z dużymi wstawkami poprzez podklowanie fragmentów restrykcyjnych do zwykłych wektorów np. plazmidowych

13 2. Sekwencjonowanie z wykorzystaniem wędrówki starterów (primer walking) fragment genomowego DNA

14 2. Sekwencjonowanie z wykorzystaniem wędrówki starterów (primer walking)

15 3. Metody określane jako NGS next generation sequencing: Co je wyróżnia? nie używa się ddntp ogromna przepustowość (ang. highthroughput) w większości oparte na syntezie cząsteczek DNA

16 Pirosekwencjonowanie sekwencjonowanie przez syntezę DNA Nie używa się ddntp, w czasie reakcji rejestruje się kolejność wbudowywania nukleotydów w trakcie syntezy nowej nici Wbudowanie nukleotydu rejestruje się jako błysk chemiluminescencji indukowany przez pirofosforan, który uwalnia się z dntp.

17 Pirosekwencjonowanie schemat reakcji

18 Principle of Pyrosequencing Pyrosequencing is sequencing by synthesis, a simple to use technique for accurate and consistent analysis of DNA sequences. Step 1 A sequencing primer is hybridized to a single stranded, PCR amplified, DNA template, and incubated with the enzymes, DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase and apyrase, and the substrates, adenosine 5 phosphosulfate (APS) and luciferin. Step 2 The first of four deoxynucleotide triphosphates (dntp) is added to the reaction. DNA polymerase catalyzes the incorporation of the deoxynucleotide triphosphate into the DNA strand, if it is complementary to the base in the template strand. Each incorporation event is accompanied by release of pyrophosphate (PPi) in a quantity equimolar to the amount of incorporated nucleotide. Step 3 ATP sulfurylase quantitatively converts PPi to ATP in the presence of adenosine 5 phosphosulfate. This ATP drives the luciferase-mediated conversion of luciferin to oxyluciferin that generates visible light in amounts that are proportional to the amount of ATP. The light produced in the luciferase-catalyzed reaction is detected by a charge coupled device (CCD) camera and seen as a peak in a pyrogram. Each light signal is proportional to the number of nucleotides incorporated. Step 4 Apyrase, a nucleotide degrading enzyme, continuously degrades unincorporated dntps and excess ATP. When degradation is complete, another dntp is added. Step 5 Addition of dntps is performed one at a time. It should be noted that deoxyadenosine alpha-thio triphosphate (datpαs) is used as a substitute for the natural deoxyadenosine triphosphate (datp) since it is efficiently used by the DNA polymerase, but not recognized by the luciferase. As the process continues, the complementary DNA strand is built up and the nucleotide sequence is determined from the signal peak in the pyrogram.

19 The Genome Sequencer FLX System uses a revolutionary technology.

20

21

22

23 Benefits: NGS 5500 SOLiD System Powerful benchtop system Up to 15 Gb/day with 99.99% accuracy (1 genome - 30x coverage for human genome; 12 exomes, 6 transcriptomes ~100x 150x coverage for exome; whole transcriptome) Simplified sequencing Streamlined workflows and easy-to-use software Rapid run time Run a sample in as little as 24 hours Flexible Independent lanes enable multiple applications in a single run

24 Podstawowe zastosowania platform typu NGS: 1. Sekwencjonowanie DNA

25 Podstawowe zastosowania platform NGS: 2. Liczenie cząsteczek DNA