PathogenFree RNA Isolation Kit Zestaw do izolacji RNA Instrukcja użytkownika Spis treści 1. Zawartość 2 1.1 Składniki zestawu 2 2. Opis produktu 2 2.1 Założenia metody 2 2.2 Specyfikacja zestawu 2 2.3 Przygotowanie i jakość próbek 2 2.4 Uwagi odnośnie elucji 3 2.5 Uwagi odnośnie kontroli jakości 3 3. Warunki przechowywania 3 4. Instrukcja bezpieczeństwa 4 5. Protokół 5 6. Załącznik 6 6.1 Rozwiązywanie problemów 6 6.2 Zamówienia 7 PathogenFree RNA Isolation Kit - zestaw do izolacji RNA, instrukcja użytkownika Strona 1 z 8
1. ZAWARTOŚĆ 1.1. Składniki zestawu Wielkość opakowania Odczynnik Zestaw na 50 izolacji Zestaw na 250 izolacji Bufor lizujący RAV1 35 ml 5 x 35 ml Bufor przemywający RAW 30 ml 2 x 75 ml Bufor przemywający RAV3 12.5 ml 3 x 25 ml (koncentrat)* H2O wolna od RNaz 5 ml 25 ml Bufor elucyjny RE** 5 ml 25 ml Nośnik RNA (liofilizowany) 1 mg 5 x 1 mg Kolumienki (z granatowymi 50 250 ringami plus probówki) Probówki (2 ml) 200 1000 *instrukcje przygotowania roztworów umieszczono w punkcie 3 **skład buforu elucyjnego RE: 5 mm Tris/HCl, ph 8.5 1.2. Materiały wymagane, a nie dostarczane z zestawem Odczynniki: Etanol 96-100% Materiały zużywalne: Probówki o pojemności 1,5ml Jednorazowe końcówki do pipety Sprzęt: Pipety nastawne Wirówka Worteks Blok grzejny lub łaźnia wodna do inkubacji w 70 C Kitel laboratoryjny, rękawiczki jednorazowe, okulary ochronne 2. OPIS PRODUKTU 2.1. Założenia metody Zestaw PathogenFree RNA Isolation Kit zapewnia szybką i wydajną izolację wirusowego RNA. Liza komórek odbywa się w trakcie inkubacji próbki z buforem lizującym RAV1, będącym silnie stężonym roztworem GITC. Uwolnienie materiału genetycznego DNA-wirusów (np. HBV) jest zwykle bardziej uciążliwe i wymaga trawienia proteinazą K. Bufor lizujący i etanol stwarzają odpowiednie warunki do wiązania kwasów nukleinowych przez membranę silikonową kolumienek. Nośnik RNA ułatwia to wiązanie, jak również ma pozytywny wpływ na odzyskiwanie wirusowego RNA. Zanieczyszczenia (sole, metabolity, rozpuszczalne struktury komórkowe) są usuwane na etapie przemywania buforami etanolowymi RAW i RAV3. Kwasy nukleinowe mogą być eluowane buforami o niskim stężeniu soli lub wodą po elucji są gotowe do użycia w kolejnych procedurach. 2.2. Specyfikacja zestawu PathogenFree RNA Isolation Kit - zestaw do izolacji RNA, instrukcja użytkownika Strona 2 z 8
Zestaw do izolacji RNA GeneProof PathogenFree RNA Isolation Kit przeznaczony jest do szybkiej izolacji czystego wirusowego RNA (np. HCV, HIV, CMV) z materiału biologicznego - surowicy, osocza, moczu, ale nie krwi pełnej. Do izolacji wirusowego DNA zaleca się stosowanie próbek pozbawionych komórek (surowica lub osocze) ze względu na fakt, że wirusowy DNA jest oczyszczany razem z DNA komórkowym. RNA otrzymany w procesie izolacji jest gotowy do użycia i może być poddawany kolejnym procedurom (RT-PCR, reakcje enzymatyczne). Limit detekcji dla poszczególnych wirusów zależy od zastosowanych procedur, np. in-house nested (RT-)PCR. Zaleca się używanie kontroli wewnętrznych, a także kontroli negatywnej i pozytywnej w celu monitorowania etapów oczyszczania, amplifikacji i detekcji. 2.3. Przygotowanie i jakość próbek Objętość próbki do 150 μl płynu Wydajność >90% Limit analizy 30-60 cp/ml Objętość elucyjna 50 μl Pojemność złoża 40 μg Czas przygotowania 30 min/ 4-6 próbek RNA można izolować z dowolnej próbki biologicznej mającej postać półpłynną lub płynną (np. surowica, mocz, płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego BAL). W celu uzyskania najwyższej wydajności izolacji na kolumienki należy nakładać homogenne, czyste i nie lepkie próbki. Przed rozpoczęciem pracy należy sprawdzić, czy próbka nie zawiera strątów (szczególną ostrożność należy zachować przy postępowaniu z próbkami starymi i mrożonymi). Nie należy oczyszczać próbek przez wirowanie czy filtrację przed lizą buforem RAV1, ponieważ wirus może być związany z cząstkami/agregatami obecnymi w próbce. W celu rozpuszczenia i strawienia szczątkowych struktur komórkowych, strątów i cząstek wirusa można wydłużyć inkubację z buforem RAV1 pamiętając jednak, że zbyt długi czas lizy może spowodować degradację RNA i wydajność reakcji ulegnie znacznemu obniżeniu. Próbki przeznaczone do izolacji DNA mogą być przechowywane przez kilka dni w temperaturze +4 C. Dłuższe przechowywanie skutkuje spadkiem wydajności izolacji. Przy dłuższym przechowywaniu zaleca się mrożenie próbek w temp. -20 C. 2.4. Uwagi odnośnie elucji czyste kwasy nukleinowe są eluowane w niskiej sile jonowej za pomocą wody wolnej od nukleaz (ph~ 7 8) lub lekko zasadowego buforu RE( 5 mm Tris-HCl, ph 8.5). Bufor RE gwarantuje lepsze warunki przechowywania dla DNA niż RNA. Podczas wspólnej izolacji RNA i DNA należy użyć wody wolnej od nukleaz o ph 6-8 podgrzanej do 70 C. elucja zgodnie z protokołem izolacji jest procesem jednoetapowym (wówczas wydajność wynosi ok. 80%); w celu zwiększenia czułości i ilości odzyskanego RNA etap ten można powtórzyć do eluatu dodaje się dodatkową objętość wody/buforu RE. W ten sposób odzyskuje się niemal 100% związanego RNA w bardziej rozcieńczonym eluacie. 2.5. Uwagi odnośnie kontroli jakości Bufory i kolumienki zawarte w zestawie zostały przebadane z użyciem rrna i RNA faga MS2. RT-PCR potwierdził nieobecność RNaz i wydajność procesu izolacji. PathogenFree RNA Isolation Kit - zestaw do izolacji RNA, instrukcja użytkownika Strona 3 z 8
3. WARUNKI PRZECHOWYWANIA Uwaga: Bufory B1, B3 i BW zawierają chlorowodorek guanidyny. Należy nosić okulary ochronne oraz jednorazowe rękawiczki! Wszystkie składniki zestawu mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej (20-25 C) i zachowują w takich warunkach stabilność przez 1 rok. Nośnik RNA po rozpuszczeniu w buforze RAV1 ma określony czas półrozpadu. Z tego powodu niektóre z zestawów zawierają kilka butelek liofilizowanego nośnika RNA, który należy rozpuszczać sukcesywnie, w zależności od zużycia. Pozwala to zapobiegać degradacji nośnika. Przed pierwszym użyciem należy rozpuścić nośnik RNA (zawartość 1 fiolki) w 1ml buforu lizującego RAV1, a następnie przenieść mieszaninę z powrotem do butelki buforu RAV1. Przechowywanie nośnika RNA w buforze RAV1: - w temperaturze pokojowej: 1-2 tygodnie. W temperaturze pokojowej nie wytrącają się sole w roztworze. - w 4 C - do 4 tygodni - w -20 C, podzielony na porcje dłuższy okres czasu Podczas przechowywania w temperaturze 4 C lub niższej mogą wytrącać się sole. W celu rozpuszczenia strątów należy przed użyciem podgrzać mieszaninę w temperaturze 40-60 C przez co najmniej 5 minut. Nie należy podgrzewać mieszaniny buforu RAV1 zawierającej nośnik RNA więcej niż 4 razy. Częste ogrzewanie, temperatura powyżej 80 C przyspieszają degradację RNA i mogą powodować mniejszą wydajność izolacji, a w konsekwencji fałszywie ujemne wyniki reakcji RT-PCR (szczególnie jeśli używana była próbka o małej zawartości RNA) Przed rozpoczęciem procesu izolacji należy przygotować bufor przemywający RAV3 dodać wskazaną objętość etanolu (96-100%) do koncentratu buforu przemywającego RAV3. Na etykiecie butelki należy zaznaczyć, że dodano etanol. Bufor RAV3 może być przechowywany w temperaturze pokojowej (20-25 C) przez 1 rok. GeneProof PathogenFree RNA Isolation Kit Koncentrat buforu przemywającego Opakowanie 50 reakcji Nr kat. IRNA050 Opakowanie 250 reakcji Nr kat. IRNA250 RAV3 Zawartość: 3 fiolki po 25 ml Zawartość: 12.5ml /Wash Buffer RAV3 (Concentrate)/ Dodać 100ml etanolu do każdej Dodać 50ml etanolu z fiolek 4. INSTRUKCJA BEZPIECZEŃSTWA Niektóre ze składników zestawu GeneProof PathogenFree RNA Isolation Kit zawierają substancje szkodliwe dla zdrowia. Podczas pracy z zestawem należy nosić okulary ochronne i jednorazowe rękawiczki. Składnik zestawu RAV1 RAW Substancja niebezpieczna Tiocyjanian guanidyny Chlorowodorek guanidyny oraz etanol >50% Symbol Xn* Xn* Opis Działa szkodliwie po połknięciu, wdychaniu i po kontakcie ze skórą. Łatwopalny. Działa szkodliwie po połknięciu. Działa drażniąco na oczy i skórę Zwroty ryzyka Zwroty bezpieczeństwa R 20/21/22 S 13 R 10-22 36/38 S 7-16 PathogenFree RNA Isolation Kit - zestaw do izolacji RNA, instrukcja użytkownika Strona 4 z 8
*Oznakowanie produktów niebezpiecznych nie jest konieczne jeśli zawartość/objętość odczynnika jest nie większa niż 125 g lub ml (certyfikat zwolnienia zgodnie z 67/548/EEC Art. 25, 1999/45/EC Art. 12 i niemieckim zarządzeniem o substancjach niebezpiecznych GefStoffV 20 (3) i TRGS 200 7.1). Szczegółowe informacje zawarto w karcie charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) Zwroty ryzyka R 10 R 20/21/22 R 22 R 36/38 Zwroty bezpieczeństwa S 7 S 13 S 16 Łatwopalny Działa drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę Działa drażniąco po połknięciu Działa drażniąco na oczy i skórę Przechowywać pojemnik szczelnie zamknięty. Nie przechowywać razem z żywnością, napojami i paszami dla zwierząt. Nie przechowywać w pobliżu źródeł zapłonu nie palić tytoniu. 5. PROTOKÓŁ Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować inkubator lub łaźnię wodną i podgrzać bufor RE (lub wodę wolną od RNAz) do temperatury 70 C. Przygotować roztwór buforu RAV3 (zgodnie z punktem 3). 1. Liza komórek Dodać 600ul buforu RAV1 (zawierającego nośnik RNA) do 150μl próbki. Wymieszać przez pipetowanie i dokładnie zworteksować. Inkubować 5 min w 70 C Czas i temperatura inkubacji są kluczowe dla lizy komórek i stabilności RNA (patrz także: Rozwiązywanie problemów). Jeśli po inkubacji mieszanina jest wciąż mętna, należy ją zwirować 1min przy 11 000 x g (oddzielenie niepożądanych cząstek zapobiegnie blokowaniu kolumienek). Zebrać supernatant i kontynuować procedurę (krok 2). 150µl próbki + 600µl RAV1 70 C, 5 min 2. Przygotowanie warunków do wiązania DNA Do czystej mieszaniny lizującej dodać 600µl etanolu (96-100%) i zworteksować 15-20 sekund. + 600µl etanolu 3. Wiązanie wirusowego RNA Kolumienki umieścić w 2ml probówkach przeznaczonych do zbierania materiału i nakropić 700µl próbki po lizie. Zwirować 1 min w 8,000 x g Jeśli używany jest materiał zakaźny, należy użyć nowej probówki 2ml. Nakropić lizat Na kolumienkę nakropić pozostałą objętość próbki po lizie, a następnie ponownie zwirować (1 min w 8,000 x g) Probówkę z przesączem wyrzucić, a kolumienkę przełożyć do nowej probówki 2ml. Nie zaleca się powtarzania etapu nakrapiania próbki na kolumnę więcej niż 2 razy. Usunąć przesącz razem z próbówką. 1 min, 8 000 x g 4. Przemywanie membrany Pierwsze przemywanie: Umieścić kolumienkę w nowej probówce 2 ml i dodać 500 µl buforu RAV3 + 500µl RAV 3 1 min, 8 000 x g PathogenFree RNA Isolation Kit - zestaw do izolacji RNA, instrukcja użytkownika Strona 5 z 8
Wirować 1 minutę przy 8 000 x g. Usunąć przesącz razem z próbówką. Drugie przemywanie: Umieścić kolumienkę w nowej probówce 2 ml i nakropić 600 µl buforu RAV3 Wirować 1 minutę przy 8 000 x g. Usunąć przesącz razem z próbówką. + 600µl RAV 3 1 min, 8 000 x g Trzecie przemywanie: Umieścić kolumienkę w nowej probówce 2 ml i nakropić 200 µl buforu RAV3 Wirować 2-5 min. przy 11 000 x g by usunąć całkowicie etanolowy bufor RAV3 Usunąć przesącz razem z próbówką. + 200µl RAV 3 2-5 min, 11 000 x g 5. Suszenie membrany Umieścić kolumienkę w nowej probówce 2 ml i wirować 1 minutę przy 11,000 x g. Alternatywnie: Inkubować kolumienkę 1 min, w temp. 70 C. Na tym etapie usuwane są resztki etanolu. 1 min, 11 000 x g 6. Elucja RNA Umieścić kolumienkę w nowej, sterylnej probówce 1,5 ml i dodać 50 µl wody wolnej od RNaz (podgrzanej w temp. 70 C) Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1-2 min. Zwirować 1 minutę w 11,000 g +50µl H20 (70 C) inkubacja 1-2 min. 1 min, 11 000 x g 6. ZAŁĄCZNIK 6.1. Rozwiązywanie problemów Problem Możliwa przyczyna Rozwiązanie problemu - nie dodano nośnika RNA Problem z nośnikiem RNA Mała zawartość lub brak RNA w eluacie Konieczne może być wstępne trawienie proteinazą K - problem z przechowywaniem buforu RAV1 z nośnikiem RNA (sekcja 3) - porównać eksperymentalnie protokoły z I bez dodatku proteinazy K - wydłużyć czas inkubacji do 10min. PathogenFree RNA Isolation Kit - zestaw do izolacji RNA, instrukcja użytkownika Strona 6 z 8
Zdegradowane wirusowe kwasy nukleinowe Zdegradowane wirusowe kwasy nukleinowe - izolacja powinna być przeprowadzona tak szybko jak to możliwe po pobraniu próbki. Można dodać inhibitor RNaz. Upewnić się, że próbki są przechowywane w odpowiednich warunkach. - upewnić się, że wszystkie bufory zostały poprawnie przygotowane i są przechowywane w odpowiednich warunkach. W razie wątpliwości przygotować nowe porcje buforów RAV1, RE i nośnika RNA. Problemy z DNA w reakcjach następczych Ogólne problemy z izolacją Zmniejszona czułość Zanieczyszczenie etanolem Zablokowana membrana - zmienić objętość eluatu dodawanego do reakcji PCR/ real-time PCR - zwrócić uwagę na temperaturę i czas inkubacji podczas etapu lizy stanowią one czynnik krytyczny dla stabilności RNA. W przypadku delikatnych cząsteczek można zastosować inkubację w temperaturze pokojowej. Dla wspólnej izolacji RNA i DNA można optymalizować reakcję dopuszczalny czas inkubacji to 5-15min, dopuszczalna temperatura: pokojowa / 56 C / 72 C - wydłużyć czasy wirowania na etapie przemywania membrany w celu dokładnego usunięcia pozostałości buforu RAV3. - zwirować lizat przed dodaniem etanolu i nakropieniem na kolumienkę. 6.2. Zamówienia Nazwa zestawu Nr kat. Wielkość opakowania PathogenFree RNA Isolation Kit IRNA050 50 izolacji PathogenFree RNA Isolation Kit IRNA250 250 izolacji Producent: GeneProof a.s. Vinicni 235, Brno, Czech Republic E-mail: info@geneproof.com Phone/Fax: +420 543 211 679 Orders: sales@geneproof.com Customer service: support@geneproof.com Wyłączny dystrybutor na Polskę: Imogena Os. Przemysława 12a/2 61-064 Poznań www. imogena.pl email: biuro@imogena.pl tel. 604 349 200 PathogenFree RNA Isolation Kit - zestaw do izolacji RNA, instrukcja użytkownika Strona 7 z 8
Tłumaczenie z języka angielskiego: Imogena 2012. Wersja 1.0. Wszystkie prawa zastrzeżone. PathogenFree RNA Isolation Kit - zestaw do izolacji RNA, instrukcja użytkownika Strona 8 z 8