MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 263-269 Olga Rek, Agnieszka Częścik, Agnieszka Trzcińska, Joanna Siennicka Komórki Raji, P3HR-1 i Namalwa jako model badania reaktywacji zakażenia wirusem Epsteina-Barr (EBV) * Zakład Wirusologii NIZP-PZH w Warszawie Kierownik: doc. dr hab. B. Litwińska Przedstawiono charakterystykę linii komórkowych wyprowadzonych z chłoniaka Burkitt a (Raji, P3HR-1 i Namalwa) dotyczącą warunków wzrostu, obecności genomu wirusa EBV, oraz ekspresji receptorów Toll-like (TLR 2, TLR3, TLR 4). Latencja jest definiowana jako obecność genomu wirusowego w komórkach gospodarza bez produkcji cząstek wirusowych. Jest elementem strategii wirusa pozwalającej na przetrwanie w zakażonym organizmie. Reaktywacje, jako konsekwencja latencji, mogą być przyczyną różnorodnych patologii. Zakażenia powodowane przez herpeswirusy są tego dobrym przykładem (10, 14, 16). Odtworzenie latencji w warunkach hodowli komórkowej nie jest łatwe, dlatego też wirus Epsteina-Barr (EBV), który w sposób czytelny prezentuje stan latencji in vitro jest dogodnym modelem do badania tego procesu (11, 18). Bezobjawowe zakażenia EBV są szeroko rozpowszechnione, tak w Polsce jak i na świecie. Seroprewalencja wśród osób dorosłych sięga około 90% (7). EBV jest czynnikiem etiologicznym wielu chorób i pierwszym wirusem, dla którego został określony bezpośredni związek z procesem nowotworzenia, między innymi z chłoniakiem Burkitt a (BL). Wyprowadzenie linii ciągłych z komórek BL pozwoliło na przeprowadzenie wielu badań dotyczących zarówno procesów nowotworzenia jak i tych, związanych z latencją wirusa. Powszechnie używane do badań linie limfoblastów wyprowadzone z komórek chłoniaka Burkitt a to Raji, P3HR-1, Daudi, Akata i Namalwa. Raji była pierwszą linią komórek wyprowadzoną z materiału pochodzącego od pacjenta z BL (14). Wkrótce potem stwierdzono, że komórki BL są zakażone, co stanowiło podstawę odkrycia wirusa EBV (3). DNA wirusa EBV obecnego w Raji posiada delecję w zakresie genu BALF2. Jest to przyczyną ograniczenia replikacji wirusa do fazy wczesnej i całkowitego zahamowania syntezy wirusowego DNA (2). Komórki P3HR-1 wykazują delecję pojedynczych fragmentów DNA EBV, co jednak nie ogranicza replikacji wirusa. Delecje te są prawdopodobnie wynikiem wielokrotnego pasażowania komórek in vitro, stwierdzono bowiem, że macierzysta linia Jijoye ich nie posiada (15). Podobnie jak P3HR-1, komórki Namalwa są zdolne do produkcji zakaźnych cząstek wirusa EBV( 4). * Badanie finansowane w ramach projektu MNiSW NN 404 00233
264 O. Rek i inni Nr 3 Jednym z problemów badań nad reaktywacją zakażenia latentnego, jest nie do końca poznany mechanizm tego procesu. Wiadomo, że aby doszło do włączenia produktywnej fazy replikacji wirusa, musi dojść do aktywacji genów bezpośrednio-wczesnych BZLF1 i BRLF1 (1, 8). Do indukcji dochodzi na skutek różnych czynników, np. substancji chemicznych takich jak estry forbolu i kwasu masłowego czy jonofory wapnia (9). Natomiast ciągle nie są znane czynniki naturalne będące induktorem cyklu produktywnego. Wydaje się, że aktywacja jądrowego czynnika transkrypcyjnego NF-κB może być ważnym elementem tego procesu, jak wykazano w mysim modelu dla wirusa cytomegalii (5). Ponieważ do aktywacji NF-κB dochodzi m. in. w wyniku pobudzenia receptorów Toll-like (TLR), podjęto badania mające na celu charakterystykę komórek Raji, P3HR-1 i Namalwa w aspekcie ich przydatności do badań nad reaktywacją zakażenia EBV przy udziale tych receptorów. MATERIAŁ I METODY K o m ó r k i. Badania prowadzono na komórkach pochodzących z kolekcji ATCC: P3HR-1 (HTB-62), Raji (CCL-86) i Namalwa (CRL-1432). Komórki hodowano w jednakowych warunkach: RPMI (Sigma, R8005) z dodatkiem 2%, 5% lub 10% cielęcej surowicy płodowej (FCS; Sigma, F6178), 1mM pirogronianu sodu (Sigma, S8636) 1,5 g/l NaHCO 3 (Biomed Lublin) i antybiotyków (streptomycyna 80 μg/ml, penicilina 100 U/ml). Hodowle prowadzono w temp. 37 o C, w 5% CO 2. Wyjściowa gęstość komórek w dniu 0 wynosiła 1 x 10 6 /ml podłoża. Hodowle pasażowano 2 razy w tygodniu, do 1 części zawiesiny komórek dodawano 1 część świeżego podłoża. Obserwacje dynamiki przyrostu komórek prowadzono przez 12 dni, dokonując pomiaru gęstości zawiesiny w liczniku komórek (Z1 Coulter Particle Counter) przez 10 kolejnych dni, z wyłączeniem sobót i niedziel. P C R - D N A E B V. Całkowite DNA z badanych komórek izolowano zestawem firmy Qiagen (QIAamp DNA Blood Mini Kits for genomic DNA purification). Obecność DNA EBV w izolowanym DNA oznaczano jakościową metodą nested PCR, stosując startery dla genu polimerazy wirusa zgodnie z procedurą opisaną przez Pozo i wsp. (13), a detekcję produktów po amplifikacji przeprowadzano w 4% żelu agarozowym. Oznaczenia wykonywano w dniu 0 oraz po 12 dniach prowadzenia hodowli. P C R - D N A T L Rs. W wyizolowanym z badanych komórek DNA, metodą PCR oznaczano obecność genów kodujących receptory TLR2, TLR3 i TLR4. Startery dla genów tych receptorów oraz procedura amplifikacji była zgodna z procedurą podaną przez producenta (InvivoGen). W a r u n k i s t y m u l a c j i T L Rs. Komórki P3HR-1, Raji i Namalwa z hodowli znajdującej się w logarytmicznej fazie wzrostu stymulowano przy użyciu Pam3CSK4, Poly(I:C) i E. coli LPS (InvivoGen), ligandów dla TLR2, TLR3 i TLR4 odpowiednio. Do hodowli o gęstości 2 x 10 5 /ml komórek dodawano wyżej wymienione substancje w stężeniu: 10 µg/ml, 25 µg/ml i 10 µg/ml płynu hodowlanego odpowiednio. Po 24h inkubacji w temp. 37 o C, w 5% CO 2 komórki odwirowywano (500g, 5min) i płukano PBS. Kontrolę negatywną stanowiły komórki hodowane w identycznych warunkach, ale nie podlegające stymulacji (NS). C y t o m e t r i a p r z e p ł y w o w a. Przy użyciu przeciwciał monoklonalnych (Mabs) sprzężonych z FITC dla TLR2, TLR3 i TLR4 (InvivoGen), metodą cytometrii przepływo-
Nr 3 Badanie reaktywacji zakażenia wirusem EBV 265 wej badano obecność ww. receptorów na komórkach P3HR-1, Raji i Namalwa, poddanych stymulacji i nie stymulowanych. Oceniano odsetek komórek wykazujących fluorescencję powyżej wartości odcięcia (komórki nieznakowane) oraz średnią intensywność fluorescencji MFI (Mean Fluorescence Intensity) jako wykładnik gęstości ekspresji receptorów na badanych komórkach. Obecność TLR3 określano po uprzedniej permeabilizacji przy użyciu FACS TM Permeabilizing Solution 2 (BD 347692). W doświadczeniu kontrolnym powtórzono znakowanie komórek opisane powyżej po wcześniejszym blokowaniu receptorów, przy użyciu tych samych przeciwciał monoklonalnych, niesprzężonych z FITC. R T P C R - m R N A T L Rs. Ekspresję genów TLR2, TLR3 i TLR4 w komórkach P3HR-1, Raji i Namalwa, poddanych i nie poddanych 24 godzinnej stymulacji, określano na poziomie mrna. Izolację mrna wykonano stosując zestaw Oligotex Diret mrna Mini Kit (Qiagen). Reakcję odwrotnej transkrypcji (z mrna do cdna) oraz reakcję amplifikacji ze starterami dla genów kodujących receptory TLR2, TLR3 i TLR4 (InvivoGen) prowadzono jednocześnie (RT-PCR) stosując zestaw QIAGEN OneStep RT-PCR (Qiagen). Reakcję RT-PCR przeprowadzono zgodnie z procedurą podaną przez producenta zestawu, stosując startery o końcowym stężeniu 0,75 µm. WYNIKI W trakcie 12-dniowego doświadczenia określono przyrost liczby komórek hodowanych w RPMI z dodatkiem 2, 5 i 10% FCS (Ryc. 1). Z początkowej liczby komórek (1x10 6 ), w zależności od dodatku FCS, uzyskano 2,3 x 10 7 ; 3,9 x 10 7 i 8,8 x 10 7 komórek Namalwa, oraz 1,4 x 10 7 ; 1,7 x 10 7 i 5,6 x 10 7 komórek Raji i 2,0 x 10 7 ; 3,2 x 10 7 ; 10,4 x 10 7 komórek P3HR-1. Różnice obserwowane w przyroście komórek hodowanych w płynie z dodatkiem 2 i 5% FCS były niewielkie. Przyrost ten był około 3-krotnie niższy w stosunku do podłoża hodowlanego zawierającego 10% FCS. Od 5 dnia hodowli w podłożu z najwyższą zawartością FCS obserwowano logarytmiczny przyrost komórek, podczas gdy przy niższym stężeniu FCS w podłożu, komórki 7 dnia wchodziły w fazę stacjonarną (Ryc. 1). Za optymalne warunki hodowli przyjęto podłoże RPMI z dodatkiem 10% FCS. Stosując metodę PCR ze starterami dla genu polimerazy EBV ustalono, że wszystkie trzy linie komórkowe wykazują obecność DNA EBV, a proces namnażania komórek nie wpływa na jego utratę. Przy użyciu starterów dla genów kodujących TLR2, TLR3 i TLR4 metodą PCR wykazano również obecność tych genów w komórkach. Odsetek komórek wykazujących obecność badanych receptorów TLR oraz wartości MFI były zróżnicowane w zależności od rodzaju komórek, oznaczanego receptora i użytego stymulatora (Ryc. 2). Analiza statystyczna wykonana testem Anova wykazała nieznamiennie wyższy odsetek komórek pozytywnych (dla wszystkich receptorów i wszystkich warunków inkubacji łącznie) w przypadku Raji (12,3%) w stosunku do Namalwa (7,5%) i P3HR-1 (6,3%). Średnie wartości MFI wyniosły 1553+/-1402, 1942+/-1369 i 2005+/-1417 odpowiednio (p>0,5). Znacząco niższy odsetek komórek (Anova, p=0,049) wykazywał obecność TLR3 (5,1%+/-4) w stosunku do TLR2 (9,8%+/-6,5) i TLR4 (11,0%+/-6,9) przy jednocześnie najwyższej wartości MFI: 3692+/-356 dla TLR3, 925+/-307 dla TLR2 i 882+/- 324 dla TLR4. Najwyższy odsetek komórek wykazywał obecność badanych receptorów po stymulacji Pam3CSK4 (12,9%) w stosunku do PolyI:C (5,9%), LPS (7,4%) oraz komórek
266 O. Rek i inni Nr 3 liczba komórek [miliony] 120 100 80 60 40 20 0 Namalwa 0 1 2 3 4 7 8 9 10 11 dzieñ hodowli 2% FCS 5% FCS 10% FCS liczba komórek [miliony] 120 100 80 60 40 20 0 P3HR-1 0 1 2 3 4 7 8 9 10 11 dzieñ hodowli 2% FCS 5% FCS 10% FCS 120 Raji Ryc. 1. liczba komórek [miliony] 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 7 8 9 10 11 dzieñ hodowli 2% FCS 5% FCS 10% FCS Dynamika przyrostu komórek Namalwa, P3HR-1 oraz Raji w podłożu RPMI z różną zawartością cielęcej surowicy płodowej (FCS). Komórki pasażowano w 2, 4, 7 i 9 dniu hodowli niestymulowanych (8,4%), jednak różnice te nie były statystycznie znamienne. W doświadczeniu polegającym na blokowaniu receptorów przed znakowaniem Mabs sprzężonymi z FITC nie obserwowano obniżenia liczby komórek wykazujących obecność badanych TLR.
Nr 3 Badanie reaktywacji zakażenia wirusem EBV 267 % komórek 30 25 20 15 10 5 NS Pam3 Poly I:C LPS 0 TLR2 TLR3 TLR4 TLR2 TLR3 TLR4 TLR2 TLR3 TLR4 Ryc. 2. Odsetek komórek wykazujących pozytywną fluorescencję po znakowaniu przeciwciałami monoklonalnymi dla receptorów TLR. Po 24 godzinnej stymulacji, metodą RT-PCR sprawdzano ekspresję badanych receptorów. Na poziomie mrna wykryto ekspresję dla receptora TLR4 w przypadku komórek Namalwa stymulowanych Pam3CSK4. Obecność mrna dla TLR4 potwierdzono również w komórkach P3HR-1 stymulowanych Pam3CSK4 oraz LPS. W przypadku komórek Raji, na poziomie mrna, nie potwierdzono ekspresji żadnego z badanych receptorów, zarówno z, jak i bez stymulacji. DYSKUSJA Ekspresja receptorów Toll-like jest zróżnicowana zarówno pod względem typu komórek jak i rodzaju stymulacji. Receptory TLRs są związane głównie, chociaż nie wyłącznie, z komórkami immunologicznie czynnymi. Powierzchniowa ekspresja TLRs jest raczej niska i na monocytach waha się od kilkuset do kilku tysięcy cząsteczek na komórkę (dla porównania wartość ta dla CD44 wynosi 3x10 5 ) (6). Niektóre z receptorów Toll-like (np. TLR1) są wszechobecne stwierdza się ich występowanie na prawie wszystkich typach komórek; natomiast obecność innych TLRs ogranicza się do pewnego rodzaju komórek (np. TLR3 na komórkach dendrytycznych) (17). Przedstawiona w tej pracy charakterystyka dotyczyła komórek chłoniaka Burkitt a, a więc komórek które prezentują fenotyp niedojrzałych limfocytów B. Co do obecności TLRs na limfocytach B dane pochodzące z piśmiennictwa nie są zgodne. Janssens i Beyaert (6) piszą, że TLR4 występuje na różnych typach komórek takich jak makrofagi, komórki dendrytyczne, komórki endotelialne, ale nie na limfocytach. Z kolei Xie i wsp. (19) pisze, że limfocyty B wykazują szeroki zakres ekspresji receptorów Toll-like od TLR1 do TLR9, i że komórki te odpowiadają na działanie substancji będących agonistami zarówno TLR2 jak i TLR3 i TLR4. Żeromski i wsp. (21) stwierdzili obecność zarówno TLR2 jak i TLR4 na limfocytach B pochodzących od dzieci z zakażeniem HCV, chociaż odsetek komórek pozytywnych nie był wysoki (0,78%-1,69% w przypadku TLR2; dla TLR4 brak danych). W świetle wyników innych autorów, obserwowany przez nas odsetek komórek wykazujących fluorescencję, przyjmowaną za wynik dodatni wydał się nam wysoki. W związku z czym wykonano powtórne znakowanie po uprzednim blokowaniu
268 O. Rek i inni Nr 3 tymi samymi przeciwciałami monoklonalnymi, ale niesprzężonymi z FITC. Fakt, że nie obserwowano obniżenia liczby komórek pozytywnych można wiązać z niespecyficznym wiązaniem się przeciwciał, co jednak nie wyklucza obecności TLRs na badanych komórkach. W celu rozwiązania tego problemu wykonano oznaczenia ekspresji receptorów na poziomie mrna. Zarember i Godowski (20) badając obecność mrna receptorów Toll-like 1-10 w różnych tkankach i subpopulacjach komórek krwi pochodzących od zdrowych dawców potwierdzili ekspresję TLR2, TLR3 i TLR4 na komórkach CD19+ (limfocytach B). W obecnym badaniu, ekspresję na poziomie mrna w badanych komórkach (Namalwa i P3HR-1, ale nie Raji) wykryto jedynie dla TLR4 po stymulacji Pam3 i LPS, co jest zgodne z obserwacją, że ekspresja tego receptora ulega podwyższeniu w wyniku działania cytokin prozapalnych i produktów bakteryjnych (12). O. Rek, A. Częścik, A. Trzcińska, J. Siennicka Raji, P3HR-1 and Namalwa cells as a model for the study of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation SUMMARY The aim of the study was to characterize Raji, P3HR-1 and Namalwa cell lines in the aspect of their usefulness for the research on virus Epstein-Barr (EBV) reactivation, with the participation of Toll-like receptors (TLR). During a 12-day experiment, optimal conditions of cultivation (RPMI with 10% FCS at 37ºC in 5% CO 2 ) were determined. In these conditions cells showed logarithmic growth. The presence of the DNA EBV was confirmed by the PCR method, showing that 12-day long maintenance of cells does not cause the loss of the virus. The presence of genes encoding TLR2, TLR3 and TLR4 was also confirmed by PCR. The TLRs expression at the mrna level in cells subjected to 24h stimulation with TLR2, TLR3 and TLR4 agonist (Pam3CSK4, Poly(I:C) and LPS, respectively) was determined by the RT PCR method. The presence of TLR4 mrna was confirmed in the case of Namalwa cells stimulated by Pam3CSK and LPS, and P3HR cells stimulated by Pam3CSK4. In the case of Raji cells the expression of none of the receptors was confirmed at the mrna level in cells with and without stimulation. PIŚMIENNICTWO 1. Adamson AL, Darr D, Holley-Guthrie E, Johnson RA et al. Epstein-Barr virus immediate-early proteins BZLF1 and BRLF1 activate the ATF2 transcription factor by increasing the levels of phosphorylated p38 and c-jun N-terminal kinases. J Virol 2000; 74: 1224-33. 2. Decausin G, Leclerc V, Ooke T. The lytic cycle of Epstein-Barr virus in non-producer Raji line can be rescued by the expression of e 135 kda protein encoded by BALF2 ORF deleted cells. J Virol 1995; 69: 7309-14. 3. Epstein MA & Barr YM. Characteristics and mode of growth of tissue culture strain (EB1) of human lymphoblasts from Birkitt s lymphoma. J Natl Cancer Inst 1965; 34: 231-40. 4. Henault M, Lee LN, Evans GF, Zuckerman SH. The human Burkitt lymphoma cell line Namalwa represents a homogenous cell system characterized by high levels of Toll-like receptor 9 and activation by CpG oligonucleotides. J Immunol Methods 2005; 300: 93-9.
Nr 3 Badanie reaktywacji zakażenia wirusem EBV 269 5. Hummel M, Abecassis MM. A model for reactivation of CMV from latency. Journal of Clinical Virology 2002; 25: S123-S136. 6. Janssens S, Beyaert R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 2003; 637-46. 7. Johannsen EC, Schooley RT, Kaye KK. Epstein-Barr Virus (Infectious Mononucleosis). W: Principles and practice of infectious diseases. Mandell GL, Benett GL, Dolin R. 6th edn. Elsevier, 2005; 1801-15. 8. Kalla M, Schmeinck A, Bergbauer M, Pich D et al. AP-1 homolog BZLF1 of Epstein-Barr virus has two essential functions dependent on the epigenetic state of the viral genome. Proc Natl Acad Sci 2010; 107: 850-5. 9. Kieff E, Levine J. Homology between Burkitt herpes viral DNA and DNA in continuous lymphoblastoid cells from patients with infectious mononucleosis. Proc Natl Acad Sci USA 1974; 71: 355-8. 10. Lu JH, Tang YL, Yu HB, Zhou JH et al. Epstein-Barr virus facilitates the malignant potential of immortalized epithelial cells: from latent genome to viral production and maintenance. Lab Invest 2010; 90: 196-209. 11. Matusali G, Arena G, De Leo A, Di Renzo L et al. Inhibition of p38 MAP kinase pathway induces apoptosis and prevents Epstein Barr virus reactivation in Raji cells exposed to lytic cycle inducing compounds. Molecular Cancer 2009; 8:18. 12. Muzio M, Bosisio D, Polentarutti N, D Amico G, Stoppacciaro A, Mancinelli R, van t Veer C, Penton-Rol G, Ruco P, Allavena P, Montovani A. Differential expression and regulation of Toll- -like receptors (TLR) in human leukocytes: selective expression of TLR3 in dendritic cells. J. Immunol 2000; 164: 5998-6004. 13. Pozo F, Tenorio A. Detection and typing of lymphotropic herpesviruses by multiplex polymerase chain reaction. J Virol Methods 1999; 79: 9-19. 14. Pulvertaft RJ. Phytohaemagglutinin in relation to Burkitt s tumor (African lymphoma). Lancet 1964; 14: 552 4. 15. Rabson M et al. Non-immortalizing P3J-HR-1 Epstein-Barr virus: a deletion mutant of its transforming parent, Jijoye. J Virol 1982; 44: 834-44. 16. Reeves M, Sinclair J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Curr Top Microbiol Immunol 2008; 325: 297-313. 17. Tokarz-Deptuła B, Niedźwiedzka P, Deptuła W. Receptory Toll-podobne nowe znaczniki w immunologii. Alergia Astma Immunologia 2006; 11: 23-8. 18. Watanabe A, Maruo S, Ito T, Ito M et al. Epstein-Barr virus-encoded Bcl-2 homologue functions as a survival factor in Wp-restricted Burkitt lymphoma cell line P3HR-1. J Virol. 2010; 84: 2893-901. 19. Xie P, Kraus ZJ, Stunz LL, Bishop GA. Roles of TRAF molecules in B lymphocyte function. Cytokine Growth Factor Rev. 2008; 19: 199-207. 20. Zarember KA, Godowski PJ. Tissue expression of human Toll-like receptors and differential regulation of Toll-like receptor mrnas in leukocytes in response to microbes, their products, and cytokines. The Journal of Immunology 2002; 168: 554-61. 21. Żeromski J, Mozer-Lisewska I, Kaczmarek M. Ekspresja receptorów Toll-podobnych na krwinkach białych krwi obwodowej u dzieci z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu C. Przegląd epidemiologiczny 2006; 60: 657-63. Otrzymano: 2 VIII 2010 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii NIZP-PZH