Wprowadzenie do cytometrii przepływowej: metody znakowania komórek

Transkrypt

1 Fakultet: Cytometria zastosowanie w badaniach biologicznych Wprowadzenie do cytometrii przepływowej: metody znakowania komórek Nadzieja Drela Zakład Immunologii WB UW ndrela@biol.uw.edu.pl

2 Przygotowanie komórek do znakowania

3 1. Zawiesina komórek (bez fragmentów tkanek, błon komórkowych, zlepionych komórek). Komórki z hodowli nieadherentnych i krwi obwodowej stwarzają najmniej problemów 2. Komórki z hodowli adherentnych (trawienie enzymatyczne). Trawienie receptorów, zmniejszenie ich ekspresji, zmniejszenie dostępności do epitopów 3. Izolowanie komórek z narządów metodami mechanicznymi, enzymatycznymi lub obiema jednocześnie

4 1. Próbki kliniczne zwykle krew obwodowa, wymaga lizy erytrocytów (wodą, chlorkiem amonu, detergentem) 2. Antygeny powierzchniowe znakowane są na komórkach nieutrwalonych standardowe procedury 3. Znakowanie wewnątrzkomórkowe wymaga utrwalania i permeabilizacji komórek. Brak jest standardowej procedury: a/ utrwalanie 70% etanolem w 4 st. C; b/ utrwalanie absolutnym metanolem w -80 st.c; c/ 1% formaldehyd w 4 st.c, następnie metanol w -20 st.c; d/ 1% formaldehyd w obecności detergentu (saponina) w 0-4 st.c, następnie metanol w -20 st.c (lub bez tego etapu)

5 Zasady barwienia komórek Barwienie z użyciem przeciwciał sprzężonych z fluorochromami Barwienie z użyciem cząsteczek innych niż przeciwciała sprzężonych z fluorochromami Barwienie wolnymi barwnikami fluorescencyjnymi

6 Zastosowanie przeciwciał w cytometrii przepływowej

7 Schematyczna budowa przeciwciał

8 Odpowiedź pierwotna i wtórna

9 Zastosowanie przeciwciał wykorzystuje ich zdolność do wiązania antygenów: Podstawą jest reakcja Ag:Ab Antygeny występują w organizmach żywych powszechnie i służą do specyficznej identyfikacji komórek

10 Przeciwciała poliklonalne

11 Przeciwciała monoklonalne

12 Porównanie surowicy poliklonalnej i przeciwciał monoklonalnych Surowica poliklonalna Ag Ag Przeciwciała monoklonalne Ag Rysunek :Ewa Kozłowska

13 Porównanie surowicy poliklonalnej i przeciwciał monoklonalnych Przeciwciała poliklonalne są specyficzne dla wielu epitopów tego samego antygenu, zatem są heterogenne i utrudniają standaryzację znakowania i analizy Przeciwciała monoklonalne wiążą takie same epitopy, zatem można uzyskać powtarzalność znakowania

14 Określanie fenotypu komórek - immunofenotypowanie Identyfikacja komórek na podstawie znaczników/markerów powierzchniowych Do tego celu używamy Ab monoklonalnych przeciwko markerom różnicującym komórki analiza Znakowanie/inkubacja

15 Znakowanie bezpośrednie Znakowanie pośrednie

16 Który sygnał jest silniejszy?

17 Jak wybieramy przeciwciała

18 Która metoda jest lepsza?

19 Znakowanie markerów powierzchniowych CD8 CD4 CD8 CD4 CD4

20 Która metoda jest lepsza?

21 Fałszywe pozytywne wyniki

22 Czy można stosować obie metody jednocześnie? 1. Inkubacja z nieznakowanym I rz. przeciwciałem. Płukanie 2. Inkubacja ze znakowanym II rz. Ab. Płukanie 3. Inkubacja z surowicą myszy (blokuje niewysycone miejsca II rz. przeciwciała) 4. Inkubacja ze znakowanym I rz. Ab. Płukanie 5. Analiza

23 Przeciwciało/biotyna/awidyna 1. Biotyna, wit. H, wit. B7 2. Awidyna, białko obecne w jajach, wykazuje powinowactwo do biotyny, 1 cz. awidyny wiąże 4 cz. biotyny 3. Streptoawidyna, białko bakteryjne (Streptomyces avidinii), wiąże niekowalencyjnie biotynę Reakcja biotyna-awidyna; biotyna-streptoawidyna specyficzna, nieodwracalna

24 1. Nieznakowane Ab I-rzędowe + Ab II-rzędowe sprzężone z fluorochromem 2. Ab I rz. + Ab II rz. Biotyna + streptawidyna/fluorochrom 3. Amplifikacja systemu 2

25 Wybór odpowiedniego stężenia przeciwciała

26 1. Zwykle rozcieńczamy Ab: szereg dwukrotnych rozcieńczeń np. 1:50, 1:100, 1:200 itd. 2. Inkubujemy komórki z takimi samymi rozcieńczeniami kontroli izotypowej 3. Chcemy oceniać ekspresję badanego markera używamy stężenie saturujące 4. Chcemy ocenić obecność pozytywnych i negatywnych komórek używamy mniejszego stężenia (przeważają względy finansowe)

27 Kontrola izotypowa Rodzaj kontroli negatywnej wykluczający niespecyficzne wiązanie przeciwcial wynikające głównie z wiązania z receptorami Fc. Przykład: mysie przeciwciała IgG2a silnie wiązane są przez leukocyty człowieka.

28 Znakowanie komórek z zastosowaniem cząsteczek innych niż Ab sprzężonych z fluorochromami

29 Aneksyna V Białko komórkowe o słabo poznanej funkcji. Wykazuje powinowactwo do fosfatydyloseryny.

30 Oznaczanie komórek apoptotycznych

31 Znakowanie wolnymi barwnikami fluorescencyjnymi

32 Oznaczanie zawartości DNA DAPI, PI, 7-AAD bezpośrednio łączą się z DNA DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol) UV, przenika przez błony żywych i utrwalonych komórek, 358 nm/461 nm PI 535 nm/617 nm, nie przepuszczalny dla błon żywych komórek (w komórkach roślinnych znakuje ścianę komórkową) 7-AAD, (7-aminoactinomycin D), duże powinowactwo do regionów GC, nie przenika przez błony żywych komórek, 546 nm/647 nm Hoechst bis-benzimidazole, przenika przez nienaruszone błony komórek, UV, 345 nm/ 485 nm

33 Analiza cyklu komórkowego

34 Analiza potencjału błonowego JC-1 (5,5,6,6 -tetrachloro-1,1,3,3 tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide)

35 A -Hc Ctrl R2 R3 R4 ASM R2 R3 R4 Analiza potencjału błonowego R % R3-7.51% R4-0.06% R % * R % * R4-0.07% B +Hc R2 R3 R4 R2 R3 R4 R % # R % # R4-6.21% # R % * # ^ R % * # ^ R4-7.19% # ^

36 Zastosowanie CFDA-SE do znakowania komórek

37 Analiza proliferacji

38 Analiza proliferacji G3 G3 G3 G3 G3 G2 G2 G1 G1 G2 G3 G3 G2 G1 G2 G3 G3 G2 G3 G3 G3 Ewa Kozłowska

39 Jeszcze raz zastosowanie przeciwciał..ale na nośniku

40 Oznaczanie stężenia cytokin

41 Wybór fluorochromów 1. Typ i liczba laserów i detektorów 2. Zestaw filtrów optycznych (filtry pasmowe zwiększają czułość detekcji fluorochromu, ale zwiększają ryzyko spillover ) Wirtualne testowanie: Bdbiosciences.com.spectra

42 Źródła światła i fluorochromy (Aria) Laser Wavelength Min. Power Commonly Used Fluorochromes (nm) (mw) Coherent 488 nm (blue) 13 FITC, PE, PE-TxRed, PE-Cy7, Sapphire PerCP, PerCPCy5.5, PI Solid State JDS Uniphase 633 nm (red) 11 APC, APC-Cy7 HeNe Air Cooled Point Source 407 nm (violet) 10 Alexa Fluor, Cascade blue, Violet Solid State Pacific blue, DAPI, Hoeschst, (optional) AmCyan

43 Układ optyczny: laser niebieski

44 Układ optyczny: czerwony i fioletowy

45 Wybór fluorochromu Bright = zapewniają dobrą czułość

46 BD Biosciences Application Note

47 Bright ale minimalizacja spillover (spectral overlap, nakładanie spektrum emisji) Te dwie zasady często się wykluczają BD Biosciences Application Note

48 BD Biosciences Application Note

49 Przykład: CD8 bright/cd62l dim CD62L PE/CD8 FITC FITC-PE PE-FITC

50

51 Jeszcze jedna zasada doboru fluorochromów: Stosuj bright fluorochrom dla dim Ab Stosuj dim fluorochrom dla bright Ab ale. Unikaj spillover silnie świecącej populacji do detektora wykrywającego słabo świecącą populację, czyli do detektora wykrywającego z dużą czułością.

52 Fluorochromy tandemowe: APC-Cy7 PE-Cy7 Degradują pod wpływem światła, utrwalania (formaldehydem) i ogrzewania. Wówczas emitują fluorescencję w zakresie barwnika głównego (APC, PE), co skutkuje fałszywym wynikiem pozytywnym. Zatem: stosuj stabilne pochodne, używaj zalecanych buforów do utrwalania, przechowuj próby w ciemności i odpowiedniej temperaturze, zwykle 4 st. C.

53 Zasady doboru fluorochromów do analizy wielokolorowej: 1. Wybieraj najsilniej świecące fluorochromy 2. Minimalizuj spillover 3. Stosuj silne fluorochromy do słabych przeciwciał i odwrotnie: słabe fluorochromy do silnych przeciwciał 4. Unikaj spillover silnie świecącej populacji do detektorów wykrywających słabo świecące populacje 5. Stosuj procedury zapobiegające degradacji fluorochromów tandemowych

54 Spektra emisji fluorochromów: spillover

55 Spillover

56 Najczęściej używane zestawy barwników BD Biosciences Application Note

57 Kompensacja A. Zła kompensacja B. Prawidłowa kompensacja C. Niedokompensowane D. Przekompensowane

58 Kompensacja kiedy jest nieprawidłowa? A. Zła kompensacja spektra emisji fluorochromów na siebie zachodzą B. Prawidłowa kompensacja C. Niedokompensowane za mało sygnału FITC odjęto z kanału PE D. Przekompensowane za dużo sygnału FITC odjęto z kanału PE

59 Spillover

60 Kompensacja w praktyce

61 Przykłady prawidłowej kompensacji Correct Compensation Under Compensation Over Compensation

62 Jakich markerów używamy do kompensacji? Small errors in compensation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C). Use bright markers to setup proper compensation.

63 Barwniki tandemowe CD8 PE-Cy7 CD3 PE-Cy5 Time Sample Left in Light 0 hours PE (FL2) 2 hours 22.5 hours

64 Kompensacja konjugatów tandemowych jest charakterystyczna dla serii

65 Obraz zależny od kompensacji i rodzaju skali A. Zła kompensacja spektra emisji fluorochromów na siebie zachodzą B. Prawidłowa kompensacja off-line C. Prawidłowa kompensacja jak B, ale inna skala osi D. Prawidłowa kompensacja na skali bieksponencjalnej

66 Kompensacja przy użyciu kulek kalibracyjnych

67 ulticolor/spectrum_viewer/index.jsp

68 Dziękuję za uwagę