Inhibicja enzymatyczna

Inhibicja enzymatyczna Każdą substancję, która zmniejsza szybkość reakcji katalizowanej przez enzym można uważać za inhibitor. Hamowanie aktywności enzymów jest jednym z głównych sposobów regulacji metabolizmu komórki i jedną z najważniejszych procedur diagnostycznych stosowanych przez enzymologów. Analiza inhibicji enzymatycznej daje sugestie co do specyficzności enzymów, budowy centrum aktywnego enzymu i kinetyki reakcji. W życiu codziennym inhibitory enzymów spotykamy w postaci leków, antybiotyków, środków konserwujących, toksyn i trucizn. Inhibitory działają na różne sposoby, poniżej omówimy najprostsze przykłady mechanizmów inhibicji. Inhibicja kompetycyjna Inhibitor kompetycyjny (współzawodniczy) to substancja, która łączy się z wolnym enzymem w sposób, który nie pozwala na związanie substratu przez cząsteczkę enzymu. Oznacza to, że inhibitor i substrat wyłączają się wzajemnie, najczęściej z powodu współzawodnictwa o to samo miejsce w cząsteczce enzymu. Inhibitor kompetycyjny może być niemetabolizowalnym analogiem lub pochodną substratu, alternatywnym substratem lub produktem reakcji. Klasycznym przykładem inhibitora współzawodniczego jest kwas malonowy, który hamuje aktywność dehydrogenazy bursztynianowej (oksydoreduktaza występująca w cykl Krebsa). Ponieważ kwas malonowy ma tylko jedną grupę metylenową to nie może ulec reakcji utlenienia jak bursztynian. Może tylko połączyć się z enzymem w kompleks EI, a kompleks może zdysocjować do wolnych E i I. Innym klasycznym przykładem tego rodzaju inhibicji jest hamowanie przez amid kwasu sulfanilowego biosyntezy kwasu foliowego z jego prekursora kwasu p-aminobezoesowego. Istnieją przykłady inhibicji współzawodniczej powodowanej przez związki niepodobne strukturalnie do substratów, jest to inhibicja zwrotna. Inhibitor (efektor, modulator, regulator) łączy się z enzymem w miejscu innym niż centrum (miejsce aktywne). To połączenie indukuje zmiany konformacji enzymu (w trzecio- lub czwartorzędowej jego strukturze) co zniekształca miejsce wiązania substratu, a zatem uniemożliwia jego wiązanie. Heksokinaza katalizuje powstawanie glukozo-6-fosforanu z glukozy i ATP. Hamowanie tej reakcji przez fruktozę lub mannozę jest przykładem inhibicji kompetycyjnej przez substraty alternatywne. Glukoza, fruktoza i mannoza są wszystkie substratami heksokinazy i mogą przyłączać się do tego samego centrum aktywnego i być przemieniane w produkt (heksozo-6-fosforan). W rezultacie fosforylacja każdej z tych heksoz jest hamowana przez każdą z pozostałych dwóch. Równanie na szybkość reakcji w obecności inhibitora kompetycyjnego na podstawie założenia szybkiej równowagi ma postać przedstawioną poniżej: Taką samą postać równania otrzymamy na podstawie założenia stanu stacjonarnego, tylko że K m zastąpi K s. Równanie na szybkości reakcji w obecności inhibitora kompetycyjnego w formie odwrotnościowej (wykres Lineweavera-Burka) wygląda następująco (K m w miejscu K s ): 1

Z postaci równania widać, że nachylenie wykresu zwiększa się o współczynnik [1+([I]/ K i )], który powiększa wartość K m, ale przecięcie na osi 1/v pozostaje 1/V max. Segal IH (1976) Ta prawidłowość jest widoczna na powyższym wykresie. Każdemu stężeniu inhibitora odpowiada inna prosta. W miarę jak rośnie stężenie inhibitora, przecięcie z osią 1/[S] przesuwa się w stronę początku układu współrzędnych co znaczy, że K m app stale wzrasta. Stałą inhibicji K i można obliczyć albo z nachylenia wykresu albo z przecięcia z osią 1/[S]. Gdy 1/v = 0, to przecięcie z osią 1/[S] wynosi 1/K m app, gdzie K m app = K m (1+ [I]/K i ). Nachylenie wykresu w obecności inhibitora kompetycyjnego wynosi: nachylenie 1/S = K m /V max [1+ ([I]/K i )]. Inhibicja niekompetycyjna Spośród przykładów tego typu inhibitorów warto zwrócić uwagę na kwas acetylosalicylowy (aspiryna). Kwas acetylosalicylowy hamuje niekompetycyjnie dehydrogenazę 2-oksoglutaranową (kompleks enzymatyczny działający w cyklu Krebsa), natomiast kwas salicylowy hamuje ten enzym kompetycyjnie. Wpływ obydwu tych związków badano na oddychanie mitochondriów serca, poszukując przyczyn ochronnego działania aspiryny na układ sercowo-naczyniowy. Innym przykładem inhibicji niekompetycyjnej jest hamowanie aktywności niektórych izoform cyklazy adenylowej (AC5 i AC6) przez jony wapnia w stężeniach mniejszych od 1 µm. Substratem cyklazy adenylowej jest ATP, a produktem obok pirofosforanu jest cykliczny AMP, wtórny przekaźnik sygnałów w komórkach. Wspomniane izoformy występują w sercu i naczyniach krwionośnych i uważa się je za regulatory rytmu serca. Klasyczny inhibitor niekompetycyjny nie ma wpływu na wiązanie substratu, zaś wiązanie substratu nie ma wpływu na wiązanie inhibitora. Substrat i inhibitor wiążą się odwracalnie, losowo i niezależnie, w różnych miejscach. Powstały kompleks jest katalitycznie nieaktywny. 2

Klasyczną inhibicję niekompetycyjną można opisać tylko w warunkach szybkiej równowagi. Wówczas K m = K S. jest pozorną V max przy danym [I]. Ze wzoru widać, że skutkiem działania inhibitora niekompetycyjnego jest obniżenie V max. W warunkach kinetyki stanu stacjonarnego gdy K m K S, równanie na szybkość maksymalną reakcji zawierałoby składniki występujące w potęgach. konsekwencji czego wykres odwrotnościowy (stosowany do wyznaczenia typu inhibicji) byłby nieliniowy. Równanie odwrotnościowe przedstawia się następująco: Z postaci równania widać, że zarówno nachylenie jak i przecięcie z osią 1/v na wykresie odwrotnościowym są zwiększone o współczynnik (1+[I]/ K i ) w porównaniu do wykresu kontrolnego. Jeśli nachylenie jak i przecięcie z osią 1/v zwiększają się o ten sam współczynnik to przecięcie z osią 1/[S] pozostanie niezmienione, równe 1/K m. Segal IH (1976) Dla każdego stężenia inhibitora można wykreślić nową prostą. W miarę jak rośnie [I] zwiększa się nachylenie kolejnych prostych, a także punkt przecięcia z osią 1/v. Zatem, wraz 3

ze wzrostem stężenia inhibitora V max i stale obniża się. K i można obliczyć z nachylenia albo z przecięcia z osią 1/v. Inhibicja akompetycyjna Jako przykład inhibitora akompetycyjnego można wymienić lit, który jest stosowany w leczeniu depresji maniakalnej. Lit hamuje monofosfatazę inozytolową, która katalizuje hydrolizę fosforanu inozytolu. Hamowanie rozkładu monofosforanu inozytolu powoduje wzrost jego stężenia w komórce kosztem wolnego inozytolu, potrzebnego do resyntezy fosfatydyloinozytolu, pierwszego związku kaskady fosfoinozytolowej. Uważa się, że nadmierna aktywność kaskady fosfoinozytolowej jest istotną przyczyną depresji maniakalnej. Inny inhibitor akompetycyjny, kwas mykofenolowy hamuje reakcję katalizowaną przez dehydrogenazę inozynomonofosforanu, co powoduje zmniejszenie puli nukleotydów guaninowych i niewielkie podniesienie poziomu nukleotydów adeninowych. W rezultacie takiej nierównowagi w dostarczaniu składników do syntezy kwasów nukleinowych, cykl komórkowy zostaje zahamowany. Kwas mykofenolowy jest lekiem cytostatycznym i immunosupresyjnym. Kwas mykofenolowy Klasyczny inhibitor akompetycyjny to taki, który wiąże się odwracalnie do kompleksu enzym-substrat tworząc nieaktywny kompleks ESI. Inhibitor nie wiąże się do wolnego enzymu. Ten sposób inhibicji jest rzadko spotykany w reakcjach jednosubstratowych. Warto o nim wspomnieć, bo jest prostym przykładem sekwencyjnego dodawania dwóch ligandów w ustalonym porządku. Akompetycyjna inhibicja jest powszechna w reakcjach wielosubstratowych z powodu wspomnianego wyżej. Zarówno kinetyka szybkiej równowagi jak i stanu stacjonarnego dają takie samo równanie szybkości reakcji, więc K S może być zastąpione przez K m. Równanie szybkości reakcji w obecności inhibitora kompetycyjnego wygląda następująco: 4

Innymi słowy inhibitor akompetycyjny obniża V max i K m o ten sam współczynnik. Równanie odwrotnościowe szybkości reakcji hamowanej inhibitorem akompetycyjnym wygląda tak jak poniżej: Nachylenie wykresu wynosi K m / V max, ale punkt przecięcia z osią 1/v jest podniesiony o współczynnik (1+[I]/ K i ). W rezultacie krzywe plus inhibitor i kontrolna są równoległe. W miarę jak rośnie [I], przecięcie z osią 1/v podnosi się dając serię równoległych prostych. Inhibicja mieszana Segal IH (1976) Jest formą inhibicji niekompetycyjnej. Taką inhibicję obserwuje się w przypadku hamowania przez jony kadmu arginazy z nerek i wątroby szczura (inhibicja mieszana niekompetycyjna), czy hamowania syntazy tymidylanowej przez analogi metylenotetrahydrofolianu. Proste na wykresie odwrotnościowym przecinają się po lewej stronie osi 1/v, a nie jak w przypadku inhibicji niekompetycyjnej na osi 1/v. Odczynniki i materiały 0,04 M bufor octanowy ph 4,7 0,2 M (200 mm) roztwór sacharozy w 0,04 M buforze octanowym ph 4,7 0,1 M (100mM) roztwór CuSO 4 1,0 % kwas 3,5-dinitrosalicylowy Odpowiednio rozcieńczona inwertaza o aktywności dającej w reakcji z kwasem 3,5- dinitrosalicylowym po 10 min inkubacji z 50 mm sacharozą absorbancję 0,4 0,6. 5

Wykonanie ćwiczenia W celu zbadania z jakim typem inhibicji enzymatycznej mamy do czynienia, gdy jony Cu 2+ hamują aktywność inwertazy, należy sporządzić wykres odwrotności szybkości reakcji (1/v) od odwrotności stężenia substratu (1/s) przy braku inhibitora i przy rosnących stężeniach inhibitora. W rezultacie na wykresie będziemy mieć 4 proste. Żeby przygotować dane do wykresu należy przeprowadzić doświadczenie, w którym szybkość reakcji hydrolizy sacharozy będzie mierzona w warunkach kontrolnych i w obecności kilku stężeń inhibitora. Ilość zhydrolizowanej sacharozy będziemy oznaczać przy użyciu kwasu 3,5-dinitrosalicylowego, który nie reaguje z jonami miedzi. Do 20 probówek ponumerowanych A1, A2, A3, A4; B1, B2, B3, B4; C1, C2, C3, C4; D1, D2, D3, D4; A0, B0, C0, D0, odmierzyć składniki mieszaniny reakcyjnej według podanego schematu: probówki stężenie sacharozy 200 mm sacharoza (ml) bufor octanowy ph 4,7 (ml) stężenie CuSO 4 (mm) 100 mm CuSO 4 (μl) A1 8,0 mm 0,080 ml 0,920 ml A2 0,890 ml 1,5 mm 30 μl A3 0,860 ml 3,0 mm 60 μl A4 0,830 ml 4,5 mm 90 μl B1 12,5 mm 0,125 ml 0,875 ml B2 0,845 ml 1,5 mm 30 μl B3 0,815 ml 3,0 mm 60 μl B4 0,785 ml 4,5 mm 90 μl C1 25,0 mm 0,250 ml 0,750 ml C2 0,720 ml 1,5 mm 30 μl C3 0,690 ml 3,0 mm 60 μl C4 0,660 ml 4,5 mm 90 μl D1 50,0 mm 0,500 ml 0,500 ml D2 0,470 ml 1,5 mm 30 μl D3 0,440 ml 3,0 mm 60 μl D4 0,410 ml 4,5 mm 90 μl A0 8,0 mm 0,080 ml 0,920 ml B0 12,5 mm 0,125 ml 0,875 ml C0 25,0 mm 0,250 ml 0,750 ml D0 50,0 mm 0,500 ml 0,500 ml Po odmierzeniu, wszystkie składniki mieszaniny reakcyjnej należy wymieszać i wstawić probówki na 5 min do łaźni wodnej (30 C) w celu wyrównania temperatury. Po tym czasie kolejno w odstępach 20 lub 30 sekundowych, do każdej probówki z wyjątkiem probówek kontrolnych (A0, B0, C0, D0), dodać po 1 ml odpowiednio rozcieńczonego roztworu inwertazy i dalej inkubować. Po 10 minutach od dodania enzymu do pierwszej probówki, rozpocząć przerywanie reakcji dodając kolejno po 2 ml kwasu 3,5-dwunitrosalicylowego w 6

odstępach czasowych takich samych jak przy rozpoczęciu reakcji. Do probówek kontrolnych (A0, B0, C0, D0) po 10 minutowej inkubacji również dodać kwas 3,5-dwunitrosalicylowy, a dopiero potem po 1 ml roztworu enzymu. Wszystkie probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej i ogrzewać przez 10 min. Wyjąć probówki, ochłodzić, a następnie do każdej dodać 20 ml wody destylowanej i wymieszać. Mierzyć absorbancję prób przy λ = 540 nm zerując aparat na próbę kontrolną A0 dla szeregu A1, A2, A3, A4, B0 dla szeregu B itd. Opracowanie wyników Odczytać z krzywej wzorcowej liczbę μg cukrów redukujących powstałych w każdej probówce w wyniku hydrolizy sacharozy przez inwertazę. Obliczyć jakiej ilości μmoli sacharozy odpowiadają te wartości. Wyrazić szybkość początkową (v 0 ) reakcji hydrolizy sacharozy w μmolach sacharozy/min. Wyniki pomiaru absorbancji i znalezione wartości wpisać do poniższej tabeli: absorbancja prób stężenie substratu (S) odwrotność stężenia - 1/S A1 8,0 mm 0,125 B1 12,5 mm 0,080 C1 25,0 mm 0,040 D1 50,0 mm 0,020 A2 8,0 mm 0,125 B2 12,5 mm 0,080 C2 25,0 mm 0,040 D2 50,0 mm 0,020 A3 8,0 mm 0,125 B3 12,5 mm 0,080 C3 25,0 mm 0,040 D3 50,0 mm 0,020 A4 8,0 mm 0,125 B4 12,5 mm 0,080 C4 25,0 mm 0,040 D4 50,0 mm 0,020 μg cukrów redukujących (v 0 ) μmole sacharozy/min odwrotność szybkości - 1/v 0 Na podstawie tabeli przygotować wykres przedstawiający zależność odwrotności szybkości reakcji (1/v 0 ) katalizowanej przez inwertazę (bez inhibitora i przy różnych jego stężeniach) od odwrotności stężenia substratu 1/ S. Na podstawie przebiegu prostych określić rodzaj inhibicji, jaki powodują jony Cu 2+ gdy oddziałują z inwertazą. W celu wyznaczenia wartości K i dla hamowania aktywności enzymu przez Cu 2+ przygotować wykres zależności 1/v 0 od stężenia inhibitora. Przecięcie otrzymanej prostej z osią X daje wartość -K i. Literatura Cieśla J, Gołos B, Dzik JM, Pawełczak K, Kempny M, Makowski M, Bretner M, Kulikowski T, Machnicka B, Rzeszotarska B, Rode W (1995) Thymidylate synthases from Hymenolepis diminuta and regenerating rat liver: purification, properties, and inhibition by substrate and cofactor analogues. Biochim Biophys Acta 1249: 127-136. 7

Fauroux CM, Freeman S (1999) Inhibitors of inositol monophosphatase. J Enzyme Inhib 14: 97-108. Halloran PF (1996) Molecular mechanisms of new immunosuppressants. Clin Transplant 10:118-123. Mou TC, Masada N, Cooper DM, Sprang SR (2009) Structural basis for inhibition of mammalian adenylyl cyclase by calcium. Biochemistry 48: 3387-3397. Nulton-Persson AC, Szweda LI, Sadek HA (2004) Inhibition of cardiac mitochondrial respiration by salicylic acid and acetylsalicylate. J Cardiovasc Pharmacol 44: 591-595. Segal IH (1976) Biochemical Calculations str 246-272. John Wiley & Sons Tormanen CD (2006) Inhibition of rat liver and kidney arginase by cadmium ion. J Enzyme Inhib Med Chem 21: 119-123. 8