(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 28.08.2001, PCT/SE01/01823 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 204385 (21) Numer zgłoszenia: 362374 (22) Data zgłoszenia: 28.08.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 28.08.2001, PCT/SE01/01823 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 07.03.2002, WO02/18542 PCT Gazette nr 10/02 (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 1/20 (2006.01) A23C 19/032 (2006.01) A23C 9/12 (2006.01) C12R 1/245 (2006.01) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Izolowane probiotyczne szczepy Lactobacillus paracasei i mleczarski produkt spożywczy (30) Pierwszeństwo: 01.09.2000,SE,0003100-5 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 18.10.2004 BUP 21/04 (73) Uprawniony z patentu: PROBI AB,Lund,SE (72) Twórca(y) wynalazku: Martin Antonsson,Svedala,SE Göran Molin,Lund,SE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.01.2010 WUP 01/10 (74) Pełnomocnik: Sulima Zofia, Rzecznik Patentowy, Sulima Grabowska Sierzputowska, Biuro Patentów i Znaków Towarowych Sp.j. PL 204385 B1

2 PL 204 385 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są izolowane szczepy Lactobacillus paracasei i mleczarski produkt spożywczy, a zwłaszcza ser probiotyczny, który można wytwarzać z użyciem tych szczepów. Ser szwedzki wytwarza się z pasteryzowanego mleka krowiego, które poddaje się fermentacji za pomocą startowej hodowli bakterii kwasu mlekowego. Zakwaszone mleko zsiada się pod działaniem podpuszczki (chymozyna), a następnie skoagulowane mleko rozbija się i miesza. Mieszaninę serwatki i ziarenek sera łagodnie podgrzewa się. Serwatkę oddziela się, a ziarenka sera sprasowuje do postaci sera, który soli się i poddaje dojrzewaniu; kolejność oddzielenia serwatki i sprasowania zależy od rodzaju sera. Podczas dojrzewania spontanicznie rośnie wtórna flora, głównie bakterii kwasu mlekowego. Szwedzki ser twardy i półtwardy podczas dojrzewania jest zdominowany przez spontanicznie rosnącą wtórną mikroflorę, często nazywaną niestarterowymi bakteriami kwasu mlekowego, NSLAB. Ta spontaniczna flora zastępuje dodaną hodowlę startową i rośnie w wybranych warunkach dojrzewającego sera. Uważa się, że NSLAB przedostają się do mleczarni z surowym mlekiem po przeżyciu pasteryzacji, albo z innymi składnikami stosowanymi w produkcji sera. NSLAB najczęściej znajdywane w szwedzkim i norweskim serze należą do rodzaju Lactobacillus, a zwłaszcza gatunku Lactobacillus paracasei, patrz Lindberg, A.-M., i in., Bacterial flora of Norwegian and Swedish semihard cheese after ripening, with special reference to Lactobacillus, Netherlands Milk & Dairy Journal 50 (1996) 563- -572. NSLAB zaczynają rosnąć po kilku dniach dojrzewania i osiągają poziom około 10 6-10 7 cfu (jednostek tworzących kolonie)/g po miesiącu dojrzewania i ten poziom utrzymuje się przez co najmniej pięć miesięcy. W serze cheddar zachodzi taki sam rozwój NSLAB zdominowanych przez pałeczki kwasu mlekowego. Przykładami gatunków opisanych w przypadku sera cheddar są Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum i Lactobacillus brevis, ale zazwyczaj dominującymi gatunkami są Lactobacillus casei lub Lactobacillus paracasei. Ze względu na to, że NSLAB nie są kontrolowane, prawdopodobne jest, że niektóre wahania w jakości sera wynikają ze zmian składu NSLAB. Aby kontrolować proces dojrzewania i wzrostu spontanicznej flory NSLAB, jako dodatki w wytwarzaniu sera zastosowano czyste kultury szczepów, np. Lactobacillus. Wspomniane dodatki ogólnie mogą wpływać na zapach i smak produktu w postaci sera; wpływ ten nie jest przewidywalny i należy go badać metodą prób i błędów. Mikroorganizmy probiotyczne w produktach mleczarskich były intensywnie badane w ostatnim dziesięcioleciu. Potencjalne sprzyjające zdrowiu działanie produktów mleczarskich zawierających organizmy probiotyczne, takie jak Lactobacillus i Bifidobacterium spp., stymulowało te badania. Probiotyczne bakterie opisuje się jako żywe drobnoustroje stanowiące dodatek do pożywienia, który korzystnie wpływa na istotę żywą, gospodarza przez poprawę jego równowagi mikrobiologicznej, które po spożyciu w pewnej ilości wywierają korzyści zdrowotne, Fuller, R., Probiotics in man and animal, Journal of applied Bacteriology, 66 (1989) 365-378. Pożądane cechy wyboru funkcjonalnych probiotyków podsumowano i opisano w Klaenhammer, T. R. i in., Selection and design of probiotics, International Journal of Food Microbiology 50 (1999) 45-47. Stwierdzono, że kryteria wyboru dzielą się na cztery podstawowe kategorie, takie jak odpowiedniość, przykładowo nietoksyczność; przydatność technologiczna, przykładowo żywotność; konkurencyjność, która oznacza zdolność do przeżycia w jelicie; oraz właściwości użytkowe i funkcjonalność. Zrozumienie mechanizmów, według których kryteria te wpływają na funkcjonalność in vivo, będą stanowiły główne wyzwanie na przyszłość. Wcześniejsze badania wykazały, że Bifidobacteria, a także wiele probiotycznych szczepów Lactobacillus może dobrze przeżyć w twardych serach, takich jak ser cheddar i ser gouda. Gomes, A. M., i in., Incorporation and survival of Bifidobacterium sp. strain Bo and Lactobacillus acidophilus strain Ki in a cheese product, Netherlands Milk & Dairy Journal 49 (1995) 71-95, ujawnili wytwarzanie probiotycznego sera gouda z zastosowaniem połączenia szczepu Bifidobacterium i szczepu L. acidophilus jako hodowli startowej. Stwierdzono, że obydwa gatunki przeżyły stosunkowo dobrze, ale właściwości sensoryczne uległy niekorzystnej zmianie. Dinkar i in., Growth and viability of Bifidobacterium bifidum in Cheddar cheese, J Dairy Sci 77: 2854-2864, 1994, ujawnili wprowadzenie Bifidobacterium bifidum do sera cheddar. Osiągnięto dobrą żywotność (10 7 cfu/g) bez ujemnego wpływu na jakość sera po sześciu miesiącach dojrzewania, gdy bakterie wprowadzano jako dodatek w późniejszym etapie wytwarzania sera, takim jak mielenie lub solenie. Po tym badaniu wykonano próbę, w której skuteczność kilku probiotycznych szczepów Lactobacillus, L. salivarius i L. paracasei, badano w serze cheddar w okresie ośmiu miesięcy dojrzewania; Gardiner i in., Development of a probiotic Cheddar cheese containing human-derived Lactobacillus paracasei strains, Applied and Environmental Microbiology, 292-2199, czerwiec 1998. Wywnioskowa-

PL 204 385 B1 3 no, że probiotyczne szczepy L. paracasei były szczególnie odpowiednie jako dodatki, gdyż rosły w dużej liczbie w serze i wpływały na proteolizę, ale nie na właściwości sensoryczne. Wynalazek dotyczy izolowanego probiotycznego szczepu Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, lub jego odmiany o zasadniczo odpowiadającym profilu REA. Wynalazek dotyczy również izolowanego probiotycznego szczepu Lactobacillus paracasei 02A, DSM 13432, lub jego odmiany o zasadniczo odpowiadającym profilu REA. Szczepy według wynalazku są przeznaczone do stosowania jako dodatek w produkcji sera. Wynalazek dotyczy ponadto mleczarskiego produktu spożywczego, charakteryzującego się tym, że zawiera szczep określony powyżej w ilości 10 6-10 9 cfu/g, a korzystnie >10 7 cfu/g. Produkt według wynalazku korzystnie stanowi twardy lub półtwardy ser o polepszonym smaku i zawiera szczep Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434. Produkt według wynalazku korzystnie stanowi twardy lub półtwardy ser o polepszonym smaku i zawiera szczep Lactobacillus paracasei 02A, DSM 13432. Produkt według wynalazku korzystnie stanowi jogurt i zawiera szczep Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, w mieszaninie ze zwykłymi kulturami jogurtowymi. Produkt według wynalazku korzystnie stanowi jogurt i zawiera szczep Lactobacillus paracasei 02A, DSM 13432, w mieszaninie ze zwykłymi kulturami jogurtowymi. Nowe probiotyczne szczepy Lactobacillus paracasei można stosować jako dodatki w produkcji sera, przy czym szczepy te wykazują korzystną zdolność przeżywalności w serze, a także zdolność nadawania serowi dobrego smaku/zapachu. Szczep Lactobacillus paracasei, który może być stosowany jako probiotyk w produktach mleczarskich, cechuje się tym, że przeżywa przejście przez żołądek i jelita oraz umożliwia otrzymanie produktu serowego o przyjemnym smaku przy jego stosowaniu jako dodatku w produkcji sera. Szczep Lactobacillus paracasei 8700:2 zdeponowano w DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Brunszwik, Niemcy, 10 kwietnia 2000 i nadano mu numer dostępu DSM 13434. Fig. 1 przedstawia profil REA tego szczepu, przy czym jest to profil uzyskany drogą analizy z użyciem endonukleaz restrykcyjnych, dla całkowitego DNA chromosomalnego po przecięciu enzymami restrykcyjnymi HindlII (ścieżka C), ClaI (ścieżka B) oraz EcoRI (ścieżka A). STD odnosi się do wzorca wielkości, który stanowi połączenie High Molecular Marker (Life Technologies) oraz DNA Molecular Weight Marker VI (Rouche Molecular Biochemicals, Boehringer Mannheim). Szczep Lactobacillus paracasei 02A zdeponowano w DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Brunszwik, Niemcy, 10 kwietnia 2000 i nadano mu numer dostępu DSM 13432. Fig. 2 przedstawia profil REA tego szczepu, przy czym jest to profil uzyskany drogą analizy z użyciem endonukleaz restrykcyjnych, dla całkowitego DNA chromosomalnego po przecięciu enzymami restrykcyjnymi Hindlll (ścieżka C), ClaI (ścieżka B) oraz EcoRI (ścieżka A). STD odnosi się do wzorca wielkości, który stanowi połączenie High Molecular Marker (Life Technologies) oraz DNA Molecular Weight Marker VI (Rouche Molecular Biochemicals, Boehringer Mannheim). Analizę REA przeprowadzono według Johansson i in., International Journal of Systematic Bacteriology (1995) 10, 670-675. Figura 3 przedstawia profil RAPD szczepu 02A (ścieżka 2) i szczepu 8700:2 (ścieżka 3). Ścieżki 1 i 4 przedstawiają DNA Molecular Weight Marker VI (Rouche Molecular Biochemicals, Boehringer Mannheim). Analizę RAPD prowadzono w sposób opisany poniżej w części dotyczącej materiałów i metod. Wspomniane już figury rysunku wymieniono poniżej. Figura 1 przedstawia obraz profilu REA szczepu Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434. Figura 2 przedstawia obraz profilu REA szczepu Lactobacillus paracasei 02A, DSM 13432. Figura 3 przedstawia zdjęcie profili RAPD dwóch szczepów L. paracasei 8700:2 i 02A. Nowe szczepy według wynalazku można stosować jako probiotyki w dowolnym produkcie mleczarskim, takim jak fermentowane produkty mleczarskie, jogurt, lody, pasta do smarowania, świeży ser, twarde i półtwarde sery wytwarzane z cielęcą podpuszczką oraz z zawartością tłuszczu 5-50%, miękki ser oraz twaróg i produkty oparte na twarogu, z zawartością tłuszczu 0,1-40%, a także ser biały, ewentualnie z fermentowaną polewą lub żywymi bakteriami w masie twarogowej. Korzystne jest zastosowanie szczepu według wynalazku jako dodatku w produkcji sera.

4 PL 204 385 B1 Mleczarski produkt spożywczy według wynalazku zawiera jeden lub oba nowe szczepy według wynalazku. Zawartość probiotycznego szczepu w produkcie spożywczym powinna wynosić 10 6-10 9 cfu/g, korzystnie powyżej 10 7 cfu/g. W korzystnej postaci produkt według wynalazku stanowi twardy lub półtwardy ser o polepszonym smaku/zapachu, zawierający szczep Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, albo twardy lub półtwardy ser o polepszonym smaku/zapachu, zawierający szczep Lactobacillus paracasei 02A, DSM 13432. W innej postaci produkt według wynalazku stanowi jogurt zawierający szczep Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, lub Lactobacillus paracasei 02A, DSM 13432, w mieszaninie ze zwykłymi kulturami jogurtowymi. P r z y k ł a d y Testy przesiewowe probiotycznych szczepów w modelu serowym 15 różnych szczepów Lactobacillus pochodzenia jelitowego (11 szczepów Lactobacillus rhamnosus, 3 szczepy Lactobacillus paracasei i 1 szczep Lactobacillus plantarum), zbadano w próbie przesiewowej w modelu serowym monitorując zdolność do rośnięcia i przeżycia w serze oraz wpływ na smak sera. Różne szczepy uzyskano z jelit ludzkich z zastosowaniem metody opisanej w Molin, G. i in., Numerical taxonomy of Lactobacillus spp. associated with healthy and diseased mucosa of the human intestines, Journal of Applied Bacteriology 74 (1993) 314-323. W wyniku tego testu do dalszych badań wybrano 4 szczepy; szczepy przedstawiono w tabeli 1 poniżej. Szczep 02A 04C T a b e l a 1 Organizm L. paracasei L. plantarum 8700:2 L. paracasei 8589:2 L. paracasei Test przesiewowy probiotycznych szczepów w serze 30+ z okrągłymi dziurami W teście tym zbadano właściwości użytkowe trzech szczepów Lactobacillus paracasei i jednego szczepu Lactobacillus plantarum, wszystkich izolowanych z ludzkiej śluzówki jelita, jako dodatków do sera z okrągłymi dziurami z co najmniej 30% tłuszczu w suchej masie. Badane szczepy przedstawiono w tabeli 1 powyżej. Materiały i metody Wytwarzanie sera Sery wytwarzano w 400 litrowej kadzi, zgodnie ze zwykłą procedurą, z pasteryzowanego (73 C, 15 s) mleka krowiego (Skånemejerier, Hörby, Szwecja). Wytwarzane sery były półtwarde, z okrągłymi dziurami oraz zawartością tłuszczu 30% w suchej masie. Mleko do produkcji sera zaszczepiono 10 6 cfu/ml badanych szczepów. Badane szczepy dodawano do mleka po (30 minut) od zaszczepienia mlekową hodowlą startową, z rozmrożonego zamrożonego buforu. Z każdej partii wyprodukowano cztery sery o masie około 10 kg, z których trzy dojrzewały w 12 C, a jeden początkowo dojrzewał w 16 C przez 14 dni, a następnie w 12 C. Sery dojrzewały w folii z tworzywa sztucznego. Wytwarzanie sera przeprowadzono w czterech powtórzeniach. Co tydzień wytwarzano cztery partie, trzy partie z różnymi dodatkami i jedną kontrolną partię, bez dodatków. Porządek wytwarzania losowo dobierano w każdym tygodniu. Łącznie wytworzono 22 partie, 6 porcji kontrolnych i 4 porcje z każdą z 4 dodawanych kultur. Analiza sera Z dwóch odrębnych partii wyprodukowanych z różnymi dodatkami i dwóch kontrolnych partii pobrano próbki po 5 miesiącach dojrzewania, po jednym serze z każdej partii. Z pozostałych 4 partii kontrolnych i podwójnych partii z różnymi dodatkami pobrano próbki po 6 miesiącach dojrzewania (2 sery z każdej partii, które dojrzewały w różnej temperaturze początkowej). Sery zbadano pod względem ich właściwości sensorycznych, właściwości mikrobiologicznych oraz właściwości fizyko-chemicznych. Mikrobiologiczna analiza sera Próbkę 10 g aseptycznie pobrano ze środka sera i homogenizowano z 90 ml 2% roztworu cytrynianu sodu w aparacie Stomacher (Seward Medical Limited, London SE1 1PP, UK) przez 2,5 minuty. Po zwykłym rozcieńczeniu i wysianiu zliczono całkowitą liczbę żywych bakterii tlenowych i beztle-

PL 204 385 B1 5 nowych po inkubacji na agarze Brain Heart Infusion (BHI; Difco, Sparks, USA) w 28 C po 4 dniach. Żywe pałeczki kwasu mlekowego policzono po inkubacji na agarze Rogosa (Merck, Darmstadt, Niemcy) w warunkach beztlenowych w 28 C po 4 dniach. Izolowanie mikroorganizmów z sera Z każdej próbki losowo pobrano po siedem kolonii. Dwie pobrano z posiewu na całkowite zliczenie żywych bakterii (agar BHI), a trzy z selekcyjnego posiewu na zliczenie żywych pałeczek kwasu mlekowego (agar Rogosa). Zastosowano płytki, na których można było policzyć kolonie, z liczbą kolonii na płytkę nie mniejszą niż 20. Analiza mikrobiologiczna Analiza REA DNA chromosomalny przygotowano do analizy z użyciem endonukleaz restrykcyjnych (REA) zgodnie z procedurą Johansson i in., 1995, patrz powyżej. Chromosomalny DNA oddzielono od kowalencyjnie zamkniętego kolistego plazmidowego DNA (większość plazmidowego DNA) na podstawie gęstości pławnej barwnika przy wirowaniu w gradiencie CsCl z bromkiem etydyny. Niewielkie ilości DNA plazmidowego w postaci liniowej i otwartej kolistej nadal mogły być obecne w preparatach, ale w nieznacznym stopniu wpływały na ostateczny wynik. Stężenie chromosomalnego DNA zmierzono we fluorymetrze (Model TKO 100, Hoefer Scientific Instruments, San Fransisco, USA). DNA (0,75 mg) osobno strawiono w 37 C przez 4 godziny z 10 jednostkami Hindlll, CLAI lub ECORI (Boehringer). Elektroforezę i skanowanie żeli wykonano w sposób opisany w Johansson i in. Zastosowano poziome zanurzone bloki żelu z 0,9% agarozy o wymiarach 150-235 mm. Jako wzorce wielkości zastosowano 0,2 mg markera DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (zawierającego fragmenty DNA o masie cząsteczkowej 8,5-48,5 kb (Bethesda Research Laboratories, BRL) razem z 0,5 mg markera VI masy cząsteczkowej DNA, zawierającego fragmenty DNA o masie cząsteczkowej 0,2-2,2 kb (Boehringer Mannheim). Elektroforezę prowadzono przy stałym napięciu 40 V przez 18 godzin w 8,5 C. Podczas trwania elektroforezy zastosowano obieg buforu. Następnie żele wybarwiono przez 20 minut w bromku etydyny (2 mg/ml), odbarwiono w destylowanej wodzie, wizualizowano przy 302 nm za pomocą transluminatora UV (UVP Inc., SanGabriel, USA) i wykonano zdjęcie. Przy takim sposobie prowadzenia elektroforezy otrzymuje się dobrze rozmieszczone i względnie dobrze rozdzielone prążki aż do masy cząsteczkowej 1,8 kb. Wzory REA na negatywach zdjęć zeskanowano do komputera za pomocą poziomego skanera przy rozdzielczości 200 dpi. Następnie obrazy żeli konwertowano do formatu BioNumerics (Applied Maths, Kortrijk, Belgia). Normalizację i całą dalszą analizę żeli przeprowadzono w programie BioNumerics 1.0. Ścieżki na żelach analizowano za pomocą współczynnika Pearsona korelacji według momentu mieszanego oraz metody nieważonego kojarzenia grup przez średnie arytmetyczne (UPGMA). Dane dla trzech trawień, czyli HIND III, CLA I oraz Eco RI połączono dla każdego szczepu za pomocą BioNumerics 1.0. Analiza RAPD Wszystkie izolaty typowano metodą losowo amplifowanego polimorficznego DNA, czyli RAPD (Quednau i in., 1998, Current Microbiology, 36, 332-336). Surowe ekstrakty komórkowe przygotowano z nocnych hodowli inkubowanych w 28 C w 1 ml BHI dla izolatów z płytek agarowych BHI oraz 1 ml podłoża dla Lactobacillus, LCM, dla izolatów z płytek agarowych Rogosa. Komórki z czystych hodowli przemyto dwukrotnie w 1 ml jałowej wody Milli-Q (Millipore S.A., Molsheim, Francja) i rozbito w probówkach typu Eppendorfa za pomocą szklanych kulek, 2 mm średnicy, stosując mikser Eppendorfa (5432; Eppendorf, Hamburg, Niemcy). Zastosowany starter miał sekwencję 5'-ACGCGCCCT-3' i stężenie 15 mm w mieszaninie reakcyjnej. W wyniku procedury RAPD na żelu otrzymano osobne prążki w ilości odpowiedniej dla aktualnie typowanych pałeczek kwasu mlekowego, jak to poprzednio potwierdzono dla Lactobacillus plantarum (Johansson, M. L. i in., Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) for typing of Lactobacillus plantarum strains, Letters in Applied Microbiology, 21 (1995) 155-159). Wzory prążków na żelach analizowano za pomocą współczynnika Pearsona korelacji według momentu mieszanego oraz metody nieważonego kojarzenia grup przez średnie arytmetyczne (UPG- MA; Romesburg, 1984) z użyciem programu Gel Compar 4.2 (Applied Maths, Kortrijk, Belgia). Komputerową analizę klasterową profili RAPD połączono z porównaniem wizualnym. Ocena sensoryczna Sery po 5 miesiącach oceniało 7 osób (6 fachowców i 1 członek personelu Wydziału Technologii Żywności na Uniwersytecie w Lund), w skali odczuć zmysłowych (przetransponowanej na skalę 0-10 po analizie) obejmującej wiele cech (jakość: powierzchnia, zapach, początkowa tekstura, wtórna tekstura, smak oraz intensywność: zapachu, smaku, posmaku) oraz ogólna jakość. Po 6 miesiącach sery

6 PL 204 385 B1 zostały ocenione przez 4 fachowców, w skali odczuć zmysłowych odnośnie powierzchni, tekstury, zapachu, smaku i ogólnej jakości oraz intensywności 11 powiązanych cech. Sery miały temperaturę 16 C, oznakowane były losowym numerem trzycyfrowym i podawano je w losowej kolejności. Wyniki Wytwarzanie sera Wartości ph serów podczas wytwarzania były podobne we wszystkich badanych grupach. Zgodnie z oczekiwaniem skład serów różnił się pomiędzy grupami, ze względu na trudność wytwarzania sera w tej skali. Analiza mikrobiologiczna sera W przypadku serów zbadanych po pięciu miesiącach dojrzewania, sery wytwarzane z dodatkiem zawierały o około 1 logarytm cfu/g więcej żywych bakterii w porównaniu z serami kontrolnymi. Wartości podano w poniższej tabeli 2. Ser T a b e l a 2 Liczba żywych bakterii w serze po pięciu miesiącach dojrzewania Liczba żywych bakterii, logarytm (cfu/g sera) Wszystkie tlenowe Wszystkie beztlenowe Lactobacillus Kontrola 6,85 ± 0,33 7,27 ± 0,02 6,81 ± 0,00 + 04C 7,50 ± 0,25 7,74 ± 0,27 7,42 ± 0,02 + 8589:2 8,20 ± 0,01 8,20 ± 0,02 7,62 ± 0,00 + 8700:2 7,98 ± 0,04 7,56 ± 0,50 7,49 ± 0,05 + 02A 7,72 ± 0,04 7,65 ± 0,43 7,58 ± 0,00 Izolaty ze wszystkich badanych serów po 5 miesiącach dojrzewania (10 serów, 70 izolatów) podzielono na 12 różnych typów RAPD. Izolaty z kontrolnego sera podzielono na 7 różnych typów RAPD, a izolaty z serów wytwarzanych z dodatkiem 04C były pięciu różnych typów RAPD, a izolaty z serów wytwarzanych z dodatkiem 02A były czterech różnych typów RAPD. Izolaty z serów wytwarzanych z dodatkami 8700:2 i 8589:2 odpowiednio były trzech typów RAPD. Wszystkie sery zawierały izolaty jednego wspólnego typu RAPD. Wszystkie zastosowane dodawane kultury znaleziono w odpowiednich powtórzeniach porcji serów, po pięciu miesiącach dojrzewania. Dodawane kultury 04C, 8589:2 i 02A wyizolowano z agaru selektywnego tylko dla Lactobacillus (04C: dwa z sześciu izolatów; 8589:2: trzy z sześciu izolatów; 02A cztery z sześciu izolatów). W serze kontrolnym, znaleziono jeden izolat tego samego typu RAPD co w 04C, a w innym kontrolnym serze znaleziono jeden izolat tego samego typu RAPD co w 02A. Dodatek 8700:2 ponownie wyizolowano z kolonii na płytce agarowej do całkowitego zliczenia (dwa z ośmiu izolatów) oraz z agaru selektywnego dla Lactobacillus (sześć z sześciu izolatów). W serach badanych po sześciu miesiącach dojrzewania całkowita liczba żywych bakterii dla wszystkich badanych grup była podobna (log (cfu/g sera) 8,0-8,4) w serach dojrzewanych w 12 C. W serach początkowo dojrzewanych w 16 C całkowita liczba żywych bakterii była ogólnie niższa niż w serach dojrzewanych w 12 C, szczególnie w serze kontrolnym (log (cfu/g sera) 7,4-7,5). Liczba bakterii na płytkach selektywnych względem pałeczek kwasu mlekowego w serach dojrzewanych w 12 C była ogólnie wyższa w serach wytwarzanych z dodatkami (log (cfu/g sera) 7,6-7,8) niż w kontrolnych (log (cfu/g sera) 7,3 Lg). Na liczbę bakterii na płytkach selektywnych względem pałeczek kwasu mlekowego po sześciu miesiącach dojrzewania nie wpłynęła podwyższona początkowa temperatura dojrzewania. Ocena sensoryczna Po pięciu miesiącach dojrzewania sery kontrolne miały znacząco niższą ocenę pod względem tekstury (początkowej i wtórnej) w porównaniu z serami wytwarzanymi z dodatkami. Powierzchnia miała znacząco niższą ocenę w kontroli oraz w serze wytwarzanym z dodatkiem 8700:2, w porównaniu z serami wytwarzanymi z dodatkami 8589:2 oraz 02A. Sery wytwarzane z dodatkami 8700:2 i 02A miały znacząco wyższą ocenę pod względem jakości smaku oraz ogólnej jakości w porównaniu z serami kontrolnymi. Pośród serów wytwarzanych z dodatkiem hodowli, sery wytwarzane z 8700:2 miały

PL 204 385 B1 7 najwyższą ocenę ogólnej jakości oraz najniższą ocenę intensywności posmaku. Sery wytwarzane z 02A miały najwyższą ocenę jakości i intensywności smaku. Wszystkie analizowane sery otrzymały bardzo podobną ocenę jakości i intensywności zapachu (danych nie przedstawiono). W tabeli 3 poniżej przedstawiono wartość ph podczas wytwarzania, zawartość tłuszczu w suchej masie oraz wilgotności w nietłuszczowej masie stałej z jednego sera z dwóch partii dla każdej badanej grupy (średnia ± odchylenie standardowe). Skala oceny sensorycznej była następująca: 1 = zła jakość, niska intensywność; 10 = dobra jakość, wysoka intensywność; średnia ± odchylenie standardowe. Po sześciu miesiącach dojrzewania nie znaleziono istotnych różnic pomiędzy serami z różnych grup testowych. Jednakże zaobserwowano główne tendencje, takie, że podwyższona początkowa temperatura dojrzewania obniżyła jakość tekstury i poprawiła smak, w szczególności dla serów wytwarzanych z dodatkami. T a b e l a 3 Kontrola 1 04C 8589:2 02A 8700:1 ph po sprasowaniu 6,01 ± 0,05 6,04 ± 0,04 5,91 ± 0,02 5,93 ± 0,06 6,01 ± 0,05 ph po soleniu 5,39 ± 0,00 5,40 ± 0,00 5,36 ± 0,03 5,36 ± 0,02 5,36 ± 0,03 Tłuszcz w suchej masie (%) Wilgoć w nietłuszczowej masie stałej (%) 34,25 ± 0,60 33,65 ± 0,60 32,30 ± 0,70 31,95 ± 0,17 33,20 ± 0,63 63,40 ± 0,07 60,15 ± 0,11 58,65 ± 0,74 60,05 ± 0,32 59,80 ± 0,70 Powierzchnia 2 3,42 ± 0,50 *a 5,69 ± 1,76 6,72 ± 0,83 *b 7,20 ± 0,94 *b 4,09 ± 0,60 *a Początkowa tekstura 2 3,98 ± 0,43*c 7,04 ± 0,98 *d 6,66 ± 0,88 *d 7,16 ± 0,81 *d 6,86 ± 0,89 *d Wtórna tekstura 2 3,91 ± 0,81 *e 6,15 ± 0,85 *f 5,80 ± 0,74 *f 6,72 ± 0,79 *f 6,47 ± 0,81 *f Jakość smaku 2 4,25 ± 0,86 *g 5,39 ± 0,71 5,45 ± 0,67 6,19 ± 0,61 *h 6,44 ± 0,63 *h Intensywność smaku Intensywność posmaku 4,98 ± 0,83 5,84 ± 0,84 5,77 ± 0,62 5,96 ± 0,52 6,08 ± 0,69 3,52 ± 1,38 3 2,16 ± 0,92 4 2,70 ± 0,91 4 2,08 ± 0,65 4 1,58 ± 0,81 4 Ogólna jakość 3,78 ± 0,86 *i 5,34 ± 0,65 5,06 ± 0,74 6,03 ± 0,49 *j 6,49 ± 0,60 *j 1) Nie zastosowano dodatku 2) Znaczące różnice (p=0,05) pomiędzy grupami wskazano różnymi literami 3) kwaśny i gorzki 4) gorzki Test właściwości probiotycznych Kontrolowano także zdolność szczepów do przeżycia przejścia przez jelita gdy dostarczane były w serze i porównano ze spontanicznie rosnącą wtórną mikroflorą. Badanie podawania Podawanie doustne Sery zaszczepione szczepami 02A i 8700:2 wybrano do badania podawania. Tego wyboru dokonano w oparciu o lepszy smak szczepionych serów oraz zdolność badanych szczepów do wzrostu i przeżycia w serze podczas dojrzewania. Kultury były obecne w serze w ilości powyżej 10 7 cfu/g sera. Ochotników do podawania doustnego podzielono na 3 grupy: 1) konsumentów kontrolnego sera bez wprowadzanych dodatków; 2) konsumentów sera szczepionego 8700:2 oraz 3) konsumentów sera szczepionego 02A. Grupa 1 składała się z ośmiu ochotników (czterech mężczyzn i cztery kobiety, wiek 43-51 lat), grupa 2 składała się z dziesięciu ochotników (pięciu mężczyzn i pięć kobiet, wiek 25-55 lat), a grupa 3 składała się z jedenastu ochotników (sześciu mężczyzn i pięć kobiet, wiek 26-60 lat). Badanie realizowano przez pięć tygodni. Podczas tygodnia 3 i 4 podawano codziennie 150 g sera, co odpowiada dziennej dawce badanego szczepu wynoszącej >0,5 10 9 cfu. Podczas badania osobom zabro-

8 PL 204 385 B1 niono spożywać produkty zawierające bakterie probiotyczne i antybiotyki. Próbki odchodów zebrano na początku podawania (tydzień 2), po dwóch tygodniach podawania (tydzień 4) oraz tydzień po końcowym podaniu (tydzień 5). Izolacja mikroorganizmów z odchodów Po standardowym rozcieńczeniu i wysianiu odchodów, liczbę żywych pałeczek kwasu mlekowego analizowano na agarze Rogosa inkubowanym w warunkach beztlenowych w 37 C przez 3 dni. Trzy kolonie losowo pobrano z każdej próbki i typowano. Zastosowano płytki, na których można było policzyć kolonie, z liczbą kolonii na płytkę nie mniejszą niż 20. Typowanie izolatów Wszystkie izolaty typowano metodą losowo amplifowanego polimorficznego DNA (RAPD; Quednau i in., 1998, supra) Ponowna izolacja Profile RAPD izolatów z serów wytwarzanych z dodatkami porównano z profilami RAPD dodatku i izolatów z serów odniesienia. Gdy izolaty z sera z dodatkiem były tego samego typu jak dodatek, dodatek uznawano za ponownie wyizolowany. Profile RAPD z izolatów z odchodów od każdej osoby porównano z profilem RAPD dodatku, z izolatów z serów wytwarzanych z tym dodatkiem oraz z izolatów z serów odniesienia. Gdy izolaty tego samego typu RAPD co dodatek znaleziono w odchodach po podaniu sera, a nie znaleziono przed podaniem, wnioskowano, ze dodatek przeżył przejście przez jelita. Także gdy izolaty tego samego typu RAPD co dodatek znaleziono w odchodach po tygodniu od podania sera, ale nie znaleziono przed podaniem, wnioskowano, ze dodatek kolonizował ludzkie jelito. Analiza statystyczna Analizę zmian i znaczących różnic w liczbie żywych bakterii oraz punktów sensorycznych przeprowadzono obliczając przedziały ufności z zastosowaniem rozkładu t. Ocenę statystyczną istotności różnic liczby żywych bakterii w odchodach w trzech badanych punktach czasowych wykonano za pomocą testu sumy rang Wilcoxona stosując SPSS 6.0 (SPSS Inc, Chicago, USA). Wyniki podawania doustnego Szczep 02A znaleziono w odchodach sześciu spośród jedenastu ochotników, bezpośrednio po zakończeniu podawania. Odpowiednia wartość dla szczepu 8700:2 wynosiła 10 na dziesięciu ochotników. Ani 02A ani 8700:2 nie znaleziono w odchodach któregokolwiek z ochotników w tych dwóch grupach w tydzień po zakończeniu podawania. Żaden ze spontanicznie pojawiających się typów RAPD w serach kontrolnych lub w serach wytwarzanych z dodatkiem nie został znaleziony w odchodach ochotników. Jednakże izolaty takiego samego typu RAPD co w 02A znaleziono w odchodach dwóch ochotników, którym podawano ser kontrolny, bezpośrednio po zakończeniu podawania. Także izolaty takiego samego typu RAPD co w 04C znaleziono po tygodniu od zakończenia podawania w odchodach dwóch ochotników. Tym dwóm ochotnikom podawano kontrolny ser lub ser wytwarzany z dodatkiem 02A. Liczba żywych pałeczek kwasu mlekowego w odchodach wzrosła we wszystkich grupach po spożyciu sera. Wzrost ten był statystycznie istotny dla grup spożywających ser zawierający dodaną hodowlę. Po zakończeniu podawania liczba żywych pałeczek kwasu mlekowego spadła dla grup spożywających sery zawierające dodaną hodowlę, znacząco dla grupy 3, podczas gdy wzrosła dla grupy spożywającej ser kontrolny. Poniższa tabela 4 przedstawia zliczenie w warunkach selektywnych pałeczek kwasu mlekowego dla trzech grup w tym badaniu. Grupa po 1 Ser kontrolny T a b e l a 4 2 Ser + 8700:2 3 Ser + 02A 2 tygodniach 5,81 ± 0,74 4,87 ± 0,38 5,94 ± 0,48 4 tygodniach 6,08 ± 0,60 6,72 ± 0,80 6,64 ± 0,46 5 tygodniach 6,97 ± 0,74 5,59 ± 0,92 5,74 ± 0,54 Wniosek Powyższe doświadczenia wykazały, że dwa szczepy Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434 oraz Lactobacillus paracasei 02A, DSM 13432, dobrze zachowują się jako dodawane hodowle do

PL 204 385 B1 9 wytwarzania sera i mogą być ponownie izolowane z sera po pięciu miesiącach dojrzewania. Szczepy także wywierają pozytywny efekt na właściwości sensoryczne, co oznacza, że potrafiły one zdominować spontanicznie rosnącą wtórną mikroflorę. Badanie podawania pokazało, że dwa szczepy wydają się spełniać wymaganie konkurencyjności, jako przeżycia przejścia przez żołądek i jelita, a zatem spełniają kryteria wyboru jako potencjalnego szczepu probiotycznego. Zastrzeżenia patentowe 1. Izolowany probiotyczny szczep Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, lub jego odmiana o zasadniczo odpowiadającym profilu REA. 2. Izolowany probiotyczny szczep Lactobacillus paracasei 02A, DSM 13432, lub jego odmiana o zasadniczo odpowiadającym profilu REA. 3. Szczep według zastrz. 1 albo 2, do stosowania jako dodatek w produkcji sera. 4. Mleczarski produkt spożywczy, znamienny tym, że zawiera szczep określony w zastrz. 1 albo 2, w ilości 10 6-10 9 cfu/g, a korzystnie >10 7 cfu/g. 5. Produkt według zastrz. 4, znamienny tym, że stanowi twardy lub półtwardy ser o polepszonym smaku i zawiera szczep Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434. 6. Produkt według zastrz. 4, znamienny tym, że stanowi twardy lub półtwardy ser o polepszonym smaku i zawiera szczep Lactobacillus paracasei 02A, DSM 13432. 7. Produkt według zastrz. 4, znamienny tym, że stanowi jogurt i zawiera szczep Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, w mieszaninie ze zwykłymi kulturami jogurtowymi. 8. Produkt według zastrz. 4, znamienny tym, że stanowi jogurt i zawiera szczep Lactobacillus paracasei 02A, DSM 13432, w mieszaninie ze zwykłymi kulturami jogurtowymi.

10 PL 204 385 B1 Rysunki

PL 204 385 B1 11

12 PL 204 385 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)