PL B1. POLITECHNIKA ŁÓDZKA, Łódź, PL BUP 11/12

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. A23L 1/30 ( ) A23L 1/0522 ( ) A61K 31/718 ( ) (54) Preparat o właściwościach prebiotycznych (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 11/12 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 02/16 (73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA ŁÓDZKA, Łódź, PL (72) Twórca(y) wynalazku: KAMILA JOCHYM, Radomsko, PL JANUSZ KAPUŚNIAK, Korwinów, PL RENATA BARCZYŃSKA, Siemianowice Śląskie, PL ZDZISŁAWA LIBUDZISZ, Łódź, PL KATARZYNA ŚLIŻEWSKA, Łódź, PL

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest preparat o właściwościach prebiotycznych, selektywnie stymulujący wzrost i aktywność wybranych szczepów bakterii o działaniu probiotycznym i jednocześnie stanowiący słabo przyswajalne źródło węgla dla niepożądanej mikroflory jelitowej. Dietozależne choroby cywilizacyjne powodowane błędami żywieniowymi, polegającymi na małej różnorodności diety i nadmiernym spożywaniu pokarmów o wysokiej wartości energetycznej kreują rzeczywiste zapotrzebowanie społeczne na żywność sprzyjającą zdrowiu, leczącą lub przeciwdziałającą chorobom, a także opóźniającą procesy starzenia. Osoby cierpiące na otyłość, niedokrwienną chorobę serca, nadciśnienie tętnicze, czy osteoporozę oczekują na składniki żywności, które poprawią ich zdrowie, samopoczucie, a przede wszystkim ochronią przed skutkami tych chorób. Ogromne możliwości w tym względzie daje zastosowanie opornych na trawienie enzymami amylolitycznymi, wysokocząsteczkowych, rozpuszczalnych dekstryn. Większość handlowo dostępnych preparatów prebiotycznych stanowią oligosacharydy. Okazuje się jednak, że poza stymulowaniem wzrostu korzystnych dla człowieka jelitowych bakterii fermentacji mlekowej, w tym probiotyków, stymulują także wzrost mikroflory o nieznanej funkcji, w tym również toksynotwórczej. W tej sytuacji konieczne jest zastosowanie innych substancji prebiotycznych o wysokiej selektywnej stymulacji bakterii fermentacji mlekowej o właściwościach prebiotycznych i nie fermentowanych lub fermentowanych w ograniczonym stopniu przez inne bakterie jelitowe. Taką selektywność stymulacji rozwoju mikroflory jelitowej zapewniają produkty skrobiowe. I tak znany jest preparat skrobiowy o właściwościach prebiotycznych, o nazwie handlowej Fibersol, otrzymywany ze skrobi kukurydzianej w drodze pirolizy, a następnie hydrolizy enzymatycznej mającej na celu zamianę typowych dla skrobi wiązań -1,4-glikozydowych na wiązania 1,2- i 1,3- i glikozydowe. Znany jest także preparat skrobiowy o właściwościach prebiotycznych, o nazwie handlowej Nutriose, który stanowi dobrze rozpuszczalna dekstryna otrzymywana ze skrobi pszennej lub kukurydzianej poprzez dekstrynizację prowadzoną w ściśle kontrolowanych warunkach, a następnie frakcjonowanie z wykorzystaniem chromatografii żelowej. Preparat o właściwościach prebiotycznych, otrzymany ze skrobi, według wynalazku stanowi produkt jednoczesnej dekstrynizacji i sieciowania skrobi ziemniaczanej w obecności kwasu cytrynowego użytego w ilości do 0,1% wagowych suchej masy skrobi oraz kwasu nieorganicznego, korzystnie chlorowodorowego jako katalizatora, w temperaturze C w czasie do 4 godzin, charakteryzujący się rozpuszczalnością 63%, ph 5, zawartością cukrów redukujących 17%, średnim DP 25, średnią długością łańcucha (CL) 10,5 oraz zawartością frakcji opornych, wyznaczoną metodą Englysta, równą 60%. Preparat według wynalazku otrzymuje się z łatwo odnawialnego i dostępnego surowca jakim jest skrobia ziemniaczana. Preparat ten stanowi dobrze przyswajalne źródło węgla dla szczepów bakterii o działaniu probiotycznym tj. szczepów bakterii z rodziny Lactobacillus i Bifidobacterium, stymulujące ich wzrost i aktywność. Wysoka liczba komórek bakterii probiotycznych Lactobacillus i Bifidobacterium jest bardzo ważna i korzystna dla człowieka, ponieważ bakterie te hamują wzrost patogennych szczepów, chronią przewód pokarmowy przed działaniem szkodliwych bakterii oraz biorą udział we wzmocnieniu systemu odpornościowego. Preparat według wynalazku stanowi jednocześnie słabo przyswajalne źródło węgla dla niepożądanej mikroflory jelitowej tj. szczepów bakterii z rodziny Clostridium, Escherichia, Enterococcus. Preparat według wynalazku może być stosowany w produktach takich, jak wszelkie produkty mleczne, odżywki dla niemowląt oraz produkty spożywcze dla dzieci i osób dorosłych. Przedmiot wynalazku ilustrują poniższe przykłady. P r z y k ł a d I. Preparat otrzymany ze skrobi ziemniaczanej stanowiący produkt jednoczesnej dekstrynizacji i sieciowania skrobi ziemniaczanej w obecności kwasu cytrynowego użytego w ilości 0,1% wagowych suchej masy skrobi oraz kwasu chlorowodorowego jako katalizatora, w temperaturze 130 C w czasie 4 godzin, o następujących parametrach: o rozpuszczalności 63%, ph 5%, o zawartości cukrów redukujących 17%, średnim DP 25 średniej długości łańcucha (CL) 10,5, zawartość frakcji opornych w preparacie wyznaczoną metodą Englysta wynosi 60% użyto do hodowli bakterii pro biotycznych i bakterii izolowanych z kału.

3 PL B1 3 Przeprowadzono hodowlę bakterii probiotycznych Lactobacillus rhamnosus Shirota, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium animalis DN , izolowanych z produktów probiotycznych oraz bakterii Clostridium, Escherichia, Enterococcus wyizolowanych z przewodu pokarmowego trzech zdrowych, rocznych oraz ośmioletnich dzieci. Do hodowli bakterii probiotycznych oraz bakterii izolowanych z przewodu pokarmowego zastosowano podłoże zawierające NaCl, K 2 HPO 4, KH 2 PO 4, L-cysteina, MgSO 4 x 7H 2 O, NaHCO 3, Hemine, Pepton K, MnSO 4 x 4H 2 O, Tween, witaminę K, sole żółci, w którym źródło węgla stanowił preparat o właściwościach określonych powyżej. Hodowle bakterii inkubowano w temperaturze 37 C, zależnie od szczepu w warunkach tlenowych bakterie Lactobacillus, Escherichia, Enterococcus w warunkach beztlenowych bakterie Clostridium, Bifidobacterium. Dla celów porównawczych prowadzono także hodowlę bakterii na pożywce bez preparatu według wynalazku. Liczba bakterii probiotycznych w fazie stacjonarnej wynosiła od 8, do 8, jtk/ml, przy czym najlepszy wzrost wykazywał szczep Lactobacillus rhamnosus. Na poniższych wykresach przedstawiono dynamikę wzrostu bakterii probiotycznych w funkcji czasu inkubacji, przy czym wykres A ilustruje dynamikę bakterii na podłożu zawierającym preparat według wynalazku, zaś wykres B na podłożu bez tego preparatu.

4 4 PL B1 Liczba bakterii izolowanych z kału dzieci w fazie stacjonarnej wynosiła od 7, do 8, jtk/ml. Po przedłużeniu czasu hodowli do 168 godzin bakterie izolowane z przewodu pokarmowego dzieci wykazywały znacznie niższą żywotność niż bakterie probiotyczne. Najsłabiej w obecności preparatu według wynalazku rosły szczepy Enterococcus oraz Clostridium. Na poniższych wykresach przedstawiono dynamikę wzrostu bakterii izolowanych z przewodu pokarmowego w funkcji czasu inkubacji, przy czym wykres A ilustruje dynamikę wzrostu bakterii na podłożu zawierającym preparat według wynalazku, zaś wykres B na podłożu bez tego preparatu. P r z y k ł a d II. Przeprowadzono identyfikację produktów fermentacji preparatu według wynalazku, scharakteryzowanego w przykładzie I, przez probiotyczne bakterie Lactobacillus casei DN , Lactobacillus rhamnosus Shirota, Lactobacillus rhamnosus Lakcid, Bifidobacterium animalis DN oraz Bifidobacterium bifidum Bb12 oraz bakterie jelitowe Escherichia, Enterococcus, Clostridium. Ilość i rodzaj produktów przemian metabolicznych preparatu określono po 24 godzinach hodowli bakterii. Hodowle odwirowano na wirówce Centrifuge type MPW-365 przy szybkości obr./min w czasie 10 minut, a płyn znad osadu przefiltrowano na filtrach 0,22 µl, firmy Millipore. Identyfikację produktów fermentacji przeprowadzono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), w której zastosowano następujące warunki analizy: kolumna HPX-87H o wymiarach 300 x 78 mm

5 PL B1 5 (firmy BioRAD), prekolumna Cation-H Refill Cartridges (firmy BioRAD), detektor RI i UV, faza ruchoma 0,005 M H 2 SO 4, czas przepływu cieczy przez układ 0,6 ml/min, nastrzyk 0,1 µl, temperatura analizy 60 C. Stwierdzono, że bakterie probiotyczne tworzyły w wyniku fermentacji preparatu duże ilości kwasu mlekowego oraz krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA), tj. kwasu octowego, propionowego i mrówkowego. Kwasy te w organizmie człowieka pełnią ważną rolę obniżają ph jelitowe, stymulują rozwój nabłonka jelitowego, hepatocytów (kwas propionowy) oraz tkanek obwodowych (kwas octowy). SCFA mogą również wpływać na gospodarkę mineralną organizmu człowieka, pobudzając absorpcję z jelita grubego jonów wapnia, magnezu i żelaza. Bakterie probiotyczne wytwarzały kwas mlekowy, octowy oraz propionowy. Głównym produktem fermentacji był kwas mlekowy, którego stężenie wynosiło 71,1 79,9 mg/100 ml. Jedynie bakterie Lactobacillus casei DN wytwarzały mniej tego kwasu 52,2 mg/100 ml. Największe ilości kwasu octowego wytworzyły bakterie Bifidobacterium (45,0 48,4 mg/100 ml), natomiast bakterie Lactobacillus wytworzyły około 14 15,6 mg/100 ml tego kwasu. W wyniku fermentacji prowadzonej przez Lactobacillus i Bifidobacterium wytwarzany był również kwas propionowy w ilości około 2 mg/100 ml. Kwas mrówkowy produkowany był tylko przez Bifidobacterium w ilości około 30 mg/100 ml. Na poniższym wykresie przedstawiono stężenia produktów fermentacji preparatu przy udziale bakterii probiotycznych Lactobacillus casei DN , Lactobacillus rhamnosus Shirota, Lactobacillus rhamnosus Lakcid, Bifidobacterium animalis DN oraz Bifidobacterium bifidum Bb12. Bakterie jelitowe produkowały te same metabolity, ale w różnych stężeniach. Bakterie Escherichia i Enterococcus wyizolowane z przewodu pokarmowego 8-letnich dzieci z reguły produkowały wyższe ilości kwasów w stosunku do wytwarzanych przez bakterie wyizolowane od rocznych dzieci. Natomiast bakterie Clostridium wyizolowane z przewodu pokarmowego 8-letnich dzieci produkowały mniejsze ilości kwasów w stosunku do wytwarzanych przez bakterie wyizolowane od rocznych dzieci. Największe ilości kwasu mlekowego (81 mg/100 ml) produkowały bakterie Escherichia i Enterococcus wyizolowane od 8-letniego dziecka. Kwas octowy produkowany był w mniejszych ilościach niż kwas mlekowy przez bakterie Enterococcus w ilości od 3,3 mg/100 ml, natomiast przez bakterie Escherichia w ilości do 16,7 mg/100 ml. Wyjątek stanowiły bakterie Clostridium, które tworzyły kwas octowy w ilości 64,8 mg/100 ml. Kwas mrówkowy produkowany był tylko przez Escherichia i Enterococcus w ilości odpowiednio 82,9 i 60,3 mg/100 ml). Dodatkowo wszystkie bakterie jelitowe produkowały kwas bursztynowy w stężeniach od 1,1 mg/100 ml przez Enterococcus do 4,8 mg/100 ml przez Clostridium. Tylko szczepy bakterii Clostridium produkowały kwas masłowy w stężeniu: 54,7 mg/100 ml szczepu izolowanego z przewodu pokarmowego dzieci 8-letnich i 82,1 mg/100 ml szczepu izolowanego z przewodu pokarmowego rocznych dzieci. Na poniższych wykresach przedstawiono stężenia produktów fermentacji preparatu przy udziale bakterii jelitowych wyizolowanych z przewodu pokarmowego 8-letnich dzieci (wykres A) oraz z przewodu pokarmowego dzieci rocznych (wykres B).

6 6 PL B1 Wnioski Bakterie probiotyczne są zdolne do wykorzystywania preparatu otrzymanego przez modyfikację skrobi ziemniaczanej kwasem cytrynowym, jako źródła węgla. Szczepy Escherichia, Enterococcus, Clostridium, izolowane z przewodu pokarmowego znacznie słabiej wykorzystują preparat według wynalazku jako źródło węgla niż bakterie probiotyczne. Żywotność bakterii probiotycznych w podłożu z preparatem według wynalazku jest wyższe niż bakterii jelitowych. Zastosowanie preparatu według wynalazku nie zmienia profilu fermentacyjnego bakterii jelitowych, a wytworzone kwasy organiczne są korzystne dla rozwoju nabłonka jelitowego. Preparat według wynalazku stymuluje wzrost bakterii probiotycznych, a jednocześnie stanowi słabo przyswajalne źródło węgla dla bakterii izolowanych z przewodu pokarmowego, a zatem preparat według wynalazku wykazuje właściwości prebiotyczne. Zastrzeżenie patentowe Preparat o właściwościach prebiotycznych, otrzymany ze skrobi, znamienny tym, że stanowi go produkt jednoczesnej dekstrynizacji i sieciowania skrobi ziemniaczanej w obecności kwasu cytrynowego użytego w ilości do 0,1% wagowych suchej masy skrobi oraz kwasu nieorganicznego, korzystnie chlorowodorowego jako katalizatora, w temperaturze C w czasie do 4 godzin, charakteryzujący się rozpuszczalnością 63%, ph 5, zawartością cukrów redukujących 17%, średnim DP 25, średnią długością łańcucha (CL) 10,5 oraz zawartością frakcji opornych, wyznaczoną metodą Englysta, równą 60%. Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)