Rozdział 12 Białka Krzysztof Siemianowicz Dorota Polańska Białka są zbudowane z łańcucha utworzonego przez aminokwasy. Stopnie złożoności budowy białka są określane przez kolejną rzędowość (I-IV) jego struktury. Pierwszorzędowa struktura białka określa sekwencję aminokwasów. Geometryczne właściwości wiazań peptydowych i wynikająca stąd konformacja łańcucha polipeptydowego warunkuje drugorzędową strukturę białka. Przestrzenne uformowanie pofałdowanego lub skręconego łańcucha polipeptydowego bądź wzajemne usytuowanie kilku łańcuchów warunkuje strukturę trzeciorzędową. Wpływają na nią głównie wiązania 1
wodorowe i disiarczkowe. Niektóre białka mają budowę podjednostkową. Wzajemny układ przestrzenny podjednostek określa strukturę czwartorzędową. Ze względu na swoją strukturę i właściwości fizykochemiczne białka dzielimy na: globularne o kształcie kuli lub elipsoidy obrotowej. Stosunek długości osi długiej do krótkiej cząsteczki białka nie przekracza 20. Białka globularne zwykle są rozpuszczalne w wodzie i roztworach soli. Przykładem tej grupy białek są albumina i globuliny. fibrylarne (włókienkowe), dla których stosunek osiowy osiąga wartość około 200. Są praktycznie nierozpuszczalne w wodzie i roztworach soli. Przykładem tej grupy białek są kolagen, elastyna i keratyna. Uwzględniając składniki tworzące białko można wśród białek globularnych wyodrębnić: białka proste zbudowane tylko z aminokwasów, białka złożone (skoniugowane), które obok części białkowej zawierają istotną dla swojej funkcji nieorganiczną lub organiczną część niebiałkową. Glikoproteiny zawierają obok białka węglowodany obojętne (np. galaktozę, mannozę, fruktozę), aminocukry (N-acetylogalaktozoaminę, N- acetyloglukozoaminę) lub kwasowe pochodne monocukrów (kwas uronowy, 2
kwas sjalowy). Lipoproteiny zawierają trójglicerydy, cholesterol, estry choleterolu i fosfolipidy. W metaloproteinach atom metalu jest związany koordynacyjnie lub jonowo. W fosfoproteinach reszta kwasu fosforowego jest połączona wiązaniem estrowym z resztą seryny lub treoniny. Nukleoproteiny są zasocjowane z kwasami nukleinowymi w rybosomach. Chromoproteiny (np. hemoproteiny) zawierają barwny związek jako grupę prostetyczną. Funkcje białek strukturalne pełnią je białka tkanki łącznej, a wewnątrzkomórkowo białka mikrofilamentów enzymatyczne enzymy katalizują większość reakcji chemicznych zachodzących w organiźmie regulatorowe aktywatory i inhibitory enzymów regulują szereg procesów przekazywanie informacji zewnątrzkomórkowo hormony białkowe i cytokiny wewnątrzkomórkowo np. białka G receptory komórkowe warunkują odpowiedź komórki na określone bodźce transportowe transport zewnątrzkomórkowy i wewnątrzkomórkowy związków trudno rozpuszczalnych w wodzie, przenoszenie elektronów w łańcuchu oddechowym magazynowe np. ferrytyna gromadzi jony żelaza 3
odpornościowe odporność swoista immunoglobuliny odporność nieswoista układ dopełniacza, interferony krzepnięcie krwi kurczliwość białka włókien mięśniowych funkcje buforowe Wybrane właściwości fizykochemiczne białek Charakter amfolityczny W zależności od ph roztworu cząsteczki białka wykazują w środowisku kwaśnym nadmiar ładunku dodatniego, a w środowisku zasadowym nadmiar ładunku ujemnego. Punkt izoelektryczny białka określa takie ph, w którym dane białko występuje w postaci jonu obojniaczego. W punkcie tym ładunki dodatnie i ujemne się równoważą dając ładunek sumaryczny równy zeru. Rozpuszczalność Rozpuszcalność białek zależy od ph i siły jonowej roztworu, stałej dielektrycznej rozpuszczalnika i od cech strukturalnych danego białka. Wsalanie określone stężenie soli powstrzymuje asocjację lub agregację cząsteczek białka i poprawia jego rozpuszczalność. Ten efekt dotyczy białek o asymetrycznym rozkładzie ładunku w cząsteczce. 4
Wysalanie określone stężenie soli powoduje powstrzymanie hydratacji białka i jego wytrącenie z roztworu. Denaturacja Są to określone zmiany wywołane czynnikami fizycznymi lub chemicznymi prowadzące do utraty aktywności biologicznej i niektórych cech fizykochemicznych białka. W trakcie denaturacji białka dochodzi do zerwania wiązań wodorowych, hydrofobowych, a niekiedy także dwusiarczkowych. Proces denaturacji nie zmienia struktury pierwszorzędowej białka. Jeśli w trakcie denaturacji białka jego nowa konformacja nie została utrwalona poprzez wytworzenie nowych wiązań dwusiarczkowych, nowych wiązań kowalencyjnych lub poprzez niespecyficzne utlenienie, to proces denaturacji jest odwracalny możliwa jest renaturacja. W przeciwnym wypadku denaturacja jest nieodwracalna. Białka osocza W osoczu krwi człowieka wykazano obecność około 300 różnych białek, z których każde ma specyficzną dla siebie budowę i pełni jedną lub kilka określonych funkcji. Stężenia poszczególnych białek osocza mogą się zmieniać w różnych okresach życia i stanach fizjologicznych. Funkcje bialek osocza Regulacja ciśnienia koloidosomotycznego (onkotycznego). Około 3-4 krotnie większe stężenie białka w przestrzeni wewnątrznaczyniowej w stosunku do przestrzeni pozanaczyniowej zapobiega ucieczce wody ze 5
światła naczynia do przestrzeni pozanaczyniowej i zapewnia kontrolę dystrybucji płynów przestrzeni pozakomórkowej. Zaburzenie tej funkcji staje sie widoczne, gdy pojawiają się obrzęki spowodowane obniżeniem stężenia białka całkowitego w osoczu. Głównym białkiem pełniącym tę funkcję jest albumina z racji swego dominującego udziału procentowego w puli białek osocza. Funkcje transportowe. Albumina stanowi niespecyficzny układ transportujący hormony, bilirubinę, wolne kwasy tłuszczowe, jony metali, witaminy oraz leki. Wiele leków, hormony, jony wapnia wykazują aktywność biologiczną tylko w formie wolnej, w przeciwieństwie do formy związanej z białkiem. Zmiany stężenia białka całkowitego oraz jego zdolności wiązania poszczególnych leków, hormonów, bilirubiny i wapnia mogą mieć istotne znaczenie kliniczne. Oprócz albuminy wyspecjalizowane funkcje transportowe pełnią inne białka. np. transferyna transportuje żelazo, lipoproteiny transportują poszczególne lipidy (ich funkcje zostały przedstawione w rozdziale Lipoproteiny osocza ), TBG (Thyroxine Binding Globulin globulina wiążąca tyroksynę) i TBA (Thyroxine Binding PreAlbumine prealbumina wiążąca tyroksynę) transportują tyroksynę, SHBG (Sex Hormone Binding Globulin globulina wiążąca hormony płciowe) transportuje hormony płciowe, RBP (Retinol Binding Protein białko wiążące retinol) przenosi retinol. Udział w krzepnięciu krwi. Większość osoczowych czynników krzepnięcia jest białkami. 6
Udział w fibrynolizie. Enzymy fibrynolizy również są białkami. Funkcje enzymatyczne. Oprócz enzymów proteolitycznych zaangażowanych w procesy krzepnięcia i fibrynolizy, inne białka pełnią funkcje enzymatyczne, np. ceruloplazmina katalizuje utlenienie żelaza z Fe2+ do Fe3+, które następnie jest wiązane przez transferynę. W podziale klinicznym enzymów są one określane jako enzymy sekrecyjne (opisane w rozdziale pt. Enzymy ważne klinicznie ). Regulacja aktywności enzymów. Układ krzepnięcia oraz układ aktywacji dopełniacza są przykładami kaskadowej aktywacji enzymów proteolitycznych. PAI-1 i PAI-2 (Plasminogen Activator Inhibitor inhibitor aktywatora plazminogenu) są elementami regulacji równowagi pomiędzy procesami krzepnięcia i fibrynolizy. Funkcje odpornościowe. Immunoglobiliny stanowią układ odporności swoistej, natomiast układ dopełniacza jest elementem odporności nieswoistej. Funkcje hormonalne. Niektóre hormony produkowane przez przysadkę mózgową oraz gonadotropina kosmówkowa mają budowę białkową. Funkcje buforowe. Dzięki swojej budowie białka osocza mają właściwosci buforowe i odpowiadają za około 18% pojemności buforowej krwi. Metody oznaczania białek osocza Ponieważ białka osocza stanowią mieszaninę związków o różnych masach czasteczkowych, a ich proporcje mogą sie istotnie zmieniać w różnych stanach patologicznych, przyjęto nie podawać stężenia białka całkowitego w jednostkach układu SI (w milimolach/litr), lecz w gramach/litr lub 7
gramach/decylitr. Metody oznaczania stężenia białka polegają na wykorzystaniu właściwości chemicznych lub fizycznych wspólnych dla wszystkich białek osocza. Metoda Kjeldahla Jest metodą referencyjną przy standaryzacji innych metod ilościowego oznaczania białka. Polega na ilościowym oznaczeniu azotu w białku. W celu oznaczenia azotu zawartego w białkach należy próbkę oczyścić z innych związków zawierających azot pozabiałkowy (jego zawartość jest znacznie niższa niz azotu białkowego). W pierwszym etapie przeprowadza się mineralizację związków organicznych (wśród nich ilościowo dominuje białko) kwasem siarkowym w obecności katalizatora (jony miedziowe lub rtęciowe). Azot zawarty w tych związkach przechodzi w siarczan amonowy: azot organiczny + H2SO4 (NH4)2SO4 Pod wpływem stężonego wodorotlenku sodowego w kolbie aparatu destylacyjnego z powstałego siarczanu amonowego jest uwalniany amoniak: (NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2 H2O + 2NH3 8
W odbieralniku powstały amoniak wiąże sie z kwasem siarkowym lub solnym o znanym stężeniu: 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 Pozostałą cześć kwasu, która nie przereagowała z amoniakiem oznacza się ilościowo miareczkując ją: H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O Następnie oblicza się ilość azotu w próbce, którą się przelicza na zawartość białka. Średnia zawartość azotu w białkach surowicy wynosi 16%, czyli współczynnik przeliczenia dla białek surowicy wynosi 6,25. Zawartość azotu w poszczególnych oczyszczonych białkach jest różna: np. 12% dla mucyn i 30% dla protamin, dlatego oznaczając stężenia poszczególnych białek należy uwzględnić różne współczynniki. Metody kolorymetryczne Najczęściej stosuje sie metodę biuretową i metodę Lowry ego. Metoda biuretowa jony miedziowe w środowisku zasadowym wiążą się z wiązaniami peptydowymi tworząc kompleks o zabarwieniu fiołkowym. Ta reakcja nosi nazwę reakcji Piotrowskiego na cześć swego odkrywcy. 9
Dodatnią reakcję dają związki posiadające co najmniej dwa wiązania peptydowe. Oprócz białek są to również peptydy, amidy -aminokwasów i inne związki. Najprostszym związkiem dającym tę reakcję jest biuret, produkt kondensacji dwóch cząsteczek mocznika. Metody biuretowej nie należy stosować do oznaczania białek w obecności soli amonowych i siarczanu magnezu, ponieważ obie sole zaburzają ilościowe wiązanie jonów miedziowych. Metoda Lowry ego i wsp. jest oparta na reakcji barwnej dawanej przez dwa odczynniki. Białko reaguje z jonami miedziowymi w środowisku zasadowym dając reakcję biuretową oraz dochodzi do redukcji odczynnika fosforo-molibdenowego (odczynnika Folina-Ciocalteau) do błękitu molibdenowego przez obecne w białku tyrozynę i tryptofan. Ze względu na różny skład aminokwasowy i różną zawartość tyrozyny i tryptofanu poszczególne białka mogą dawać różne natężenie barwy z odczynnikiem Folina-Ciocalteau, należy więc stosować odpowiednie wzorce białkowe. Inne związki reagujące z odczynnikiem Folina-Ciocalteau (fenole i ich pochodne, kwas moczowy, puryny, pirymidyny) powodują zwiększenie natężenia barwy. Siarczan cynku i siarczan amonowy (w stężeniu powyżej 0,1%), zobojętniony kwas trójchlorooctowy i nadchlorowy, aceton, mocznik (w stężeniu powyżej 1%), etanol i eter (w stężeniu powyżej 5%) oraz 10
zanieczyszenie DNA w oznaczanej próbce zmniejszają natężenie barwy. Bufory fosforanowe o stężeniu wyższym niż 0,1 M powodują zmętnienie prób. Metoda Lowry ego jest znacznie czulsza od metody biuretowej i umożliwia oznaczanie białka w zakresie stężeń 10-100 mg/l. Metody turbidymetryczne (zmętnieniowe) Do tej grupy metod należy metoda Extona. Kwas sulfosalicylowy i siarczan sodowy powodują wytrącenie białka z roztworu. Powstałe zmętnienie oznacza się mierząc absorbancję. Ta metoda jest zwykle stosowana do oznaczania stężenia białka w moczu i płynie mózgowo-rdzeniowym. Stężenie białka całkowitego w surowicy Normoproteinemia, czyli prawidłowe stężenie białka całkowitego w surowicy, wynosi 60-80 g/ (6-8 g/dl). Hipoproteinemia jest to obniżenie stężenia białka całkowitego w surowicy poniżej 60 g/l (6 g/dl). Może być spowodowana 3 grupami przyczyn powodującymi zmniejszenie ilości białka rozpuszczonego w surowicy: - obniżeniem wytwarzania białek surowicy, które może być spowodowane uszkodzeniem miąższu wątroby, niedożywieniem, zaburzeniami trawienia białek lub wchłaniania aminokwasów w przewodzie pokarmowym; 11
- utratą białka z organizmu, która jest możliwa na drodze nerkowej (choroby nerek przebiegające z białkomoczem np. zespół nerczycowy) lub pozanerkowej (oparzenia lub po krwotokach); - zwiększeniem katabolizmu białek (choroby gorączkowe, choroby nowotworowe, ciężkie posocznice). Do hipoproteinemii może również dojść, gdy ilość białka rozpuszczonego w surowicy nie ulega zmianie, lecz zwiększa się objętość osocza, w której białko jest rozpuszczone. Z taką sytuacją możemy mieć do czynienia w przypadku przewodnienia. Hiperproteinemia jest to zwiększenie stężenia białka całkowitego w osoczu powyżej 80 g/l (8 g/dl). Może być spowodowana: - zwiększeniem syntezy białka. Odpowiada za nie wzrost syntezy immunoglobulin (nie stwierdza się hiperproteinemii wywołanej wzrostem syntezy albumin). W badaniu elektroforetycznym surowicy stanowi takiemu towarzyszy hipergammaglobulinemia. Taka sytuacja występuje w nowotworach układu chłonnego, które syntetyzują w nadmiarze jedną klasę immunoglobulin (lub fragmenty immunoglobulin). Do tych chorób należą: szpiczak mnogi, choroba ciężkich łańcuchów, makroglobulinemia Walderströma i inne. 12
- drugą przyczyną hiperproteinemii może być odwodnienie, w którym nie dochodzi do zwiększenia ilości białka rozpuszczonego w osoczu, lecz do zmniejszenia objętości osocza. Elektroforeza białek Elektroforeza białek wykorzystuje różnice w wędrówce białek w polu elektrycznym umożliwiając ich rozdział na frakcje. Najczęściej dokonuje się rozdziału elektroforetycznego na octanie celulozy lub agarozie. Stosowany bufor ma zwykle ph 8,6. Większość białek w tych warunkach posiada ładunek ujemny i wędruje w kierunku anody. Szybkość wędrówki białka w polu elektrycznym zależy od ładunku elektrycznego cząsteczki białka, napięcia, wielkości cząsteczki białka, ph i siły jonowej buforu oraz rodzaju nośnika. Standardowo w rozdziale elektroforetycznym białek surowicy otrzymuje się frakcję albuminy i 4 frakcje globulinowe: 1, 2, i (ryc. 1). W rozdziale elektroforetycznym białek osocza pomiędzy frakcją i globulin jest obecna frakcja zawierająca fibrynogen. Aby uniknąć trudności interpretacyjnych spowodowanych tym faktem zaleca się do elektroforezy białek używać surowicy zamiast osocza. Po dokonaniu rozdziału w polu elektrycznym frakcje białkowe wybarwia się czernią amidową lub innym barwnikiem łączącym się z białkiem. Po utrwaleniu i odpłukaniu nadmiaru barwnika dokonuje się odczytu densytometrycznego. Współczesne densytometry automatycznie podają zawartość procentową poszczególnych frakcji białkowych obliczając stosunek powierzchni pola pod krzywą danej frakcji w stosunku do powierzchni pola pod krzywą całego densytogramu 13
(ryc. 2) oarz wyliczają stosunek zawartości procentowej albumin do globulin (A/G). Znając stężenie białka całkowitego w danej próbce surowicy i zawartość procentową poszczególnych frakcji białkowych można wyliczyć stężenie każdej z nich. Ryc. 1. Żel, na którym dokonano rozdziału elektroforetycznego białek surowicy. Zaznaczono ścieżkę nr 15, która przedstawia prawidłowy proteinogram. 14
Ryc. 2. Odczyt densytometryczny żelu, na którym dokonano rozdziału elektroforetycznego surowicy z prawidłowym proteinogramem. Albumina jest białkiem globularnym o masie cząsteczkowej 6600. Jest wytwarzana w wątrobie i ma okres półtrwania w osoczu około 14 dni. U poszczególnych osób zwykle występuje jeden rodzaj albuminy. Bardzo rzadko występuje bisalbuminemia polegająca na występowaniu we krwi dwóch rodzajów albuminy o różnym składzie aminokwasowym i różnej ruchliwości elektroforetycznej. Bisalbuminemia jest dziedziczna i nie powoduje konsekwencji klinicznych. Frakcje globulinowe zawierają różne białka o identycznej lub podobnej ruchliwości elektroforetycznej. 15
1-globuliny w tej frakcji występują: 1 inhibitor proteaz, 1 kwaśna glikoproteina (AAG, orozomukoid), -lipoproteiny (HDL). 2-globuliny w tej frakcji wystepują: 2 makroglobulina, haptoglobina, ceruloplazmina i niektóre immunoglobuliny. -globuliny dodanie do buforu mleczanu wapnia pozwala rozdzielić tę frakcję na 1 i 2 globuliny, jednakże nie ma to istotnego znaczenia klinicznego. Frakcja ta zawiera: transferynę, -lipoproteiny (LDL), składnik C3 dopełniacza i niektóre immunoglobuliny. -globuliny w tej frakcji występuje większość immunoglobulin i białko C- reaktywne (CRP). Na podstawie rozdziału elektroforetycznego białek surowicy można stwierdzić w sytuacjach patologicznych: 1. Dysproteinemię polegającą na zmanie stosunków ilościowych pomiędzy poszczególnymi frakcjami białkowymi. Należy pamiętać, że zmiana zawartości procentowej danej frakcji białkowej nie musi oznaczać zmiany jej stężenia. Częstą postacią dysproteinemii jest hipergammaglobulinemia polegająca na wzroście procentowej zawartości gamma globulin w surowicy. Wyróżniamy 2 typy hipergammaglobulinemii: - monoklonalną spowodowaną zwiększoną produkcją jednej klasy immunoglobulin (lub ich fragmentów). Może występować w szpiczku mnogim, chorobie ciężkich łańcuchów, makroglobulinemii Walderströma. Może jej towarzyszyć hiperproteinemia; 16
- poliklonalną spowodowaną zwiększoną produkcją różnych klas immunoglobulin. Występuje w przewlekłych stanach zapalnych, chorobach autoimmunologicznych. Niektórym z tych stanów może towarzyszyć zwiększone wytwarzanie białka C-reaktywnego (CRP), które także jest składnikiem frakcji gamma globulin. 2. Paraproteinemię, czyli pojawienie się dodatkowego pasma (frakcji), które prawidłowo nie występuje, np. białka monoklonalnego (białko M) produkowanego przez komórki nowotworowe wywodzące się z układu immunologicznego. Występująca w surowicy hemoglobina (prawidłowo występuje w ilościach śladowych) pochodząca z hemolizy erytrocytów może dać obraz paraproteinemii. Białka ostrej fazy Jest to grupa białek osocza, których stężenie w różnym stopniu wzrasta w odpowiedzi na proces zapalny, uraz tkanek, oparzenia, martwicę tkanek oraz nowotwory. Stany te określamy mianem ostrej fazy. Mediatory stanu zapalnego (interleukina 6 i interleukina 1) produkowane i uwalniane do krążenia w miejscu gdzie toczy się proces zapalny docierają do wątroby i indukują w hepatocytach produkcję białek ostrej fazy. Są one glikoproteinami zawierającymi kwas sialowy. Ich stężenie w osoczu zaczyna rosnąć już po upływie 2-5 godzin od wystąpienia stanu określonego mianem ostrej fazy. Ich stężenie może rosnąć w niewielkim stopniu, np. ceruloplazminy około dwukrotnie, aż do ponad 1000-krotnego wzrostu, jak w przypadku białka C- reaktywnego. Wiele z białek ostrej fazy to inhibitory proteaz mające ograniczyć proteolityczne uszkodzenie tkanek do miejsca toczącego się 17
procesu. W odpowiedzi na proces ostrej fazy stężenie niektórych białek osocza ulega obniżeniu. Te białka określamy jako ujemne (negatywne) białka ostrej fazy w odróżnieniu od pozostałych, czyli dodatnich (pozytywnych) białek ostrej fazy. Najważniejszym negatywnym białkiem ostrej fazy jest transferyna. Inne przykłady tej grupy białek to białko wiążące retinol (RBP) i prealbumina. Niektórzy autorzy zaliczają albuminę do grupy ujemnych białek ostrej fazy ponieważ jej zawartość procentowa w surowicy ulega w ostrej fazie obniżeniu. Białko C-reaktywne (CRP) Jest pentamerem zbudowanym z identycznych podjednostek. Nazwa pochodzi od zdolności wiązania się z polisacharydem C ściany komórkowej bakterii Pneumococcus pneumoniae. Białko C-reaktywne wiąże się z wieloma składnikami obcych lub uszkodzonych własnych komórek i aktywuje klasyczną drogę aktywacji dopełniacza. Aktywuje makrofagi i podobnie jak przeciwciała rozpoczyna procesy opsonizacji, fagocytozy i lizy obcych komórek. Stężenie CRP w osoczu wzrasta w czasie zakażeń bakteryjnych, rozległych urazów, oparzeń, martwicy tkanek (np. zawału serca) i chorób nowotworowych. Wzrost stężenia CRP rozpoczyna się po 2 godzinach od wystąpienia procesu ostrej fazy. Jeżeli proces się nie rozszerza, to stężenie CRP może ulec obniżeniu w ciagu 24 godzin.przy oznaczaniu stężenia w osoczu białka C-reaktywnego metodami rutynowymi wzrost jego stężenia powyżej górnego zakresu normy (10 mg/l) wskazuje na proces ostrej fazy. 18
Ostatnio coraz większe znaczenie zyskuje oznaczanie stężenia białka C- reatywnego metodami wysokiej czułości (hs-crp, high sensitivity CRP). Badanie to pozwala wykryć niewielki wzrost stężenia w osoczu, który w badaniu metodami tradycyjnymi mieści się jeszcze w zakresie normy dla stanów ostrej fazy. Stężenie białka C-reaktywnego (hs-crp) powyżej 2 mg/l jest jednym z najczulszych wskaźników wzrostu ryzyka wystąpienia choroby niedokrwiennej serca i zawału serca. Oznaczanie poziomu białka C- reaktywnego (hs-crp) ma duże znaczenie u osób z wieloma czynnikami ryzyka choroby niedokrwiennej serca (opisanymi w rozdziale pt. Lipoproteiny osocza ), u których są prawidłowe wyniki oznaczeń parametrów lipidowych. Ostanio znacznie wzrasta rola oznaczania hs-crp w monitorowaniu osób z chorobą niedokrwienną serca. Wynik oznaczenia hs-crp powyżej 10 mg/l wskazuje na toczący się proces zapalny lub inną przyczynę stanu ostrej fazy i wymaga ponownego oznaczenia po ustąpieniu przyczyny ostrej fazy. Jeśli stwierdzamy, że u pacjenta występuje stan, który może powodować wzrost stężenia białek ostrej fazy (np. infekcja, przeziębienie), wówczas nie ma sensu wykonanie oznaczenia hs-crp. Oznaczenie to należy wykonać po ustaniu stwierdzonego zaburzenia wywołujacego wzrost stężenia białek ostrej fazy. 1 inhibitor proteaz Dawniej określany mianem 1 antytrypsyny. Hamuje aktywność proteaz. Odpowiada za około 90% aktywności antytrypsynowej osocza. Jego główną funkcją jest hamowanie aktywności elastazy granulocytarnej uwalnianej 19
podczas fagocytozy przez granulocyty wielojądrzaste. Hamuje także aktywność elastazy trzustkowej, trypsyny, chymotrypsyny, reniny, trombiny i plazminy. W stanach zapalnych stężenie 1 inhibitora proteaz rośnie około 4-krotnie osiągajac maksimum po 2-4 dniach. Genetycznie uwarunkowany brak lub niedobór 1 inhibitora proteaz powoduje zwiększoną aktywność proteaz, a w szczególności elastazy prowadząc do uszkodzenia wątroby i płuc. To zaburzenie jest przyczyną genetycznie uwarunkowanej rozedmy płuc i rozstrzeni oskrzeli. Ceruloplazmina Jest późnym białkiem ostrej fazy. Jest syntetyzowana w wątrobie. Około 90-95% miedzi w osoczu jest połączone z ceruloplazminą. Pełni funkcje antyoksydacyjne chroniąc tkanki w stanach ostrej fazy. Katalizuje utlenienie jonu żelazawego do jonu żelazowego umożliwiając jego wiązanie się z transferyną. Wzrost poziomu ceruloplazminy obserwuje się w stanach zapalnych, procesach martwiczych i przy stosowaniu estrogenów. Obniżenie stężenia ceruloplazminy w osoczu występuje w chorobie Wilsona. Haptoglobina Jest tetramerem zbudowanym z 2 rodzajów podjednostek ( i ). W stanach ostrej fazy jej stężenie zwiększa się wielokrotnie, wzrost stężenia rozpoczyna się w ciągu 48 godzin, a normalizacja po około 9 dniach. Haptoglobina wiąże się nieodwracalnie z hemoglobiną występujacą w surowicy. Kompleks haptoglobina-hemoglobina jest szybko wychwytywany 20
przez komórki układu siateczkowo-śródbłonkowego, gdzie oba białka są rozkładane do aminokwasów. Wychwyt hemoglobiny przez haptoglobinę zapobiega jej przedostawaniu sie do kanalików nerkowych, gdzie mogłaby spowodować ich uszkodzenie oraz zapobiega utracie żelaza. Ponieważ kompleks haptoglobina-hemoglobina ma krótszy okres półtrwania w osoczu niż sama haptoglobina, w przypadku hemolizy stężenie haptoglobiny ulega zmniejszeniu. Z tego powodu stężenie haptoglobiny w osoczu może nie wzrastać gdy ostrej fazie towarzyszy hemoliza. 1 kwaśna glikoproteina (AAG) To białko ostrej fazy nosi również nazwę orozomukoid. W osoczu wiąże i transportuje progesteron. W stanach zapalnych obserwuje się powolny wzrost stężenia orozomukoidu (około 5 dni), który zwykle nie przekracza 200% górnej granicy normy. 2 makroglobulina Jest drugim ważnym inhibitorem proteaz. Wiąże się nieodwracalnie z proteazami w kompleksy, które są wychwytywane przez układ siateczkowośródbłonkowy. W większości chorób zmiany stężenia 2 makroglobuliny są niewielkie, co ogranicza jej znaczenie diagnostyczne. Ze względu na dużą masę cząsteczkową (80 tys.) nie przechodzi do przestrzeni pozanaczyniowej. W zespole nerczycowym stężenie 2 makroglobuliny może wzrastać kilkukrotnie. Utrata z moczem białek o niskiej masie cząsteczkowej powoduje nieselektywny wzrost syntezy białek w wątrobie, w tym także 2 makroglobuliny, która nie jest wydalana z moczem. W 21
elektroforezie białek surowicy obserwuje sie wtedy zwiększenie frakcji 2. Obecność 2 makroglobuliny w moczu świadczy o przedostaniu się pełnej krwi do moczu. Fibrynogen Pełni funkcje w układzie krzepnięcia. Jest pozytywnym białkiem ostrej fazy. W stanach zapalnych po początkowym niewielkim obniżeniu spowodowanym wzmożonym zużyciem, jego stężenie znacznie wzrasta, nawet do 15 g/l. 22
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Ćwiczenie 1. Kolorymetryczne oznaczanie stężenia białka całkowitego w surowicy metodą biuretową Zasada metody Białka i peptydy zawierające co najmniej dwa wiązania peptydowe reagują w zasadowym roztworze z jonami miedzi w tak zwanej reakcji biuretowej z wytworzeniem fioletowego kompleksu barwnego. Materiał surowica Odczynniki stężony odczynnik biuretowy (60 mmol/l CuSO 4 x 5 H 2 O, 160 mmol/l winian sodowo-potasowy czterowodny), roboczy odczynnik biuretowy (pięciokrotnie rozcieńczony stężony odczynnik biuretowy), wzorce białka o stężeniu 20, 40, 60, 80 g/l 23
Wykonanie Do probówek chemicznych odmierzyć według schematu: Składnik próby (ml) Próba Badana (B) Wzorcowa (W) Odczynnikowa (O) Surowica 0,05 - - Woda destylowana - - - Wzorce białka o stężeniu 20 g/l 40 g/l 0,05 60 g/l 80 g/l Roboczy odczynnik biuretowy 1,5 1,5 1,5 Zawartość probówek dokładnie wymieszać i po upływie 30 minut zmierzyć ekstynkcję próby badanej oraz wzorcowej względem próby odczynnikowej przy długości fali 540 nm. Sporządzić wykres zależności absorbancji od stężenia białka i odczytać z niego stężenie białka w próbie badanej. 24
ĆWICZENIE 2. Ilościowe oznaczanie białka metodą Extona Zasada metody Białko wytrąca się przez dodanie kwasu sulfosalicylowego w obecności siarczanu sodowego. Intensywność powstałego zmętnienia określa się metodą turbidymetryczną. Materiał badany płyn mózgowo-rdzeniowy lub mocz Odczynniki 0,9% roztwór chlorku sodu. wzorcowy roztwór białka o stężeniu 1,5 g/l. odczynnik sulfosalicylowy: odważyć 50 g kwasu sulfosalicylowego C 7 H 6 O 6 S x 2H 2 O i 160 g siarczanu sodu krystalicznego Na 2 SO 4 x 10 H 2 O, a następnie rozpuścić w wodzie destylowanej. Uzupełnić do objętości 1 l. 25
Wykonanie Do probówek chemicznych odmierzyć wg schematu: Próba Składnik próby (ml) badana (B) wzorcowa (W) odczynnikowa (0) PMR* lub mocz 0,2 - - wzorcowy roztwór białka - 0,2-0,9% NaCl - - 0,2 odczynnik sulfosalicylowy 1,5 1,5 1,5 *PMR - płyn mózgowo-rdzeniowy Zawartość probówek dokładnie wymieszać i zmierzyć absorbancję próby badanej oraz wzorcowej wobec próby odczynnikowej przy długości fali 445 nm. Optymalny czas pomiaru absorbancji wynosi 4-10 minut po dodaniu odczynnika sulfosalicylowego. 26
Obliczenia Stężenie białka całkowitego w g/l, oblicza się wg wzoru: C A 1, 5 A B W A B absorbancja próby badanej A W absorbancja próby wzorcowej ĆWICZENIE 3. Izolowanie i oznaczanie stężenia fibrynogenu w osoczu metodą tyrozynową Zasada metody Fibrynogen zawarty w osoczu szczawianowym lub cytrynianowym przekształca się we włóknik pod działaniem chlorku wapnia lub trombiny. Oznaczenie stężenia fibrynogenu przeprowadza się kolorymetrycznie wg metody Quicka poprzez pomiar zawartości tyrozyny w fibrynogenie (10,8 mg fibrynogenu zawiera 1mg tyrozyny). Materiał badany osocze 27
Odczynniki 28 0,025 mol/l roztwór CaCl2: 2,777 g bezwodnego CaCl2 rozpuścić i uzupełnić wodą destylowaną do objętości 1000 ml roztwór buforowy: 9 g NaCl, 0,8 g KH2PO4, 1,12 g Na2HPO4, 0,2 g CaCl2 rozpuścić i uzupełnić wodą destylowaną do objętości 1000 ml 0,9% roztwór NaCl 5% roztwór NaOH wzorcowy roztwór tyrozyny: 40 mg tyrozyny rozpuścić w 100 ml 2/3 N H2SO4 (18,2 ml stężonego kwasu uzupełnić wodą do objętości 1000 ml) 12,5% roztwór węglanu sodowego rozcieńczony odczynnik Folina-Ciocalteau roztwór trombiny, zawierający 50-100 jednostek tego enzymu w 1 ml Wykonanie (ampułka 100 j. rozpuszczona w 4 ml soli fizjologicznej) 1. Izolowanie fibrynogenu Do 0,5 ml osocza dodać 4,5 ml buforu fosforanowego (ph 6,5) i 5 ml CaCl2 (lub 0,2 ml roztworu trombiny). Do probówki włożyć bagietkę, zamieszać zawartość i odstawić na ok. 30-60 min. Po tym czasie powstały włóknik nawinąć na bagietkę i ostrożnie wyjąć. Bagietkę ze skrzepem fibryny przepłukać przez dwukrotne zanurzenie w probówce zawierającej 0,9%
NaCl a następnie, używając paseczka bibuły, zsunąć na wysokość 1 cm od dolnego końca bagietki. 2. Oznaczanie stężenia fibrynogenu Umieścić bagietkę w 20 cm probówce zawierającej 1,0 ml 5 % NaOH. Probówkę wstawić do wrzącej łaźni wodnej i inkubować do momentu całkowitego rozpuszczenia skrzepu włóknika (10-20 min). W osobnej probówce ogrzewać 1,0 ml 5 % roztworu NaOH jako próbę ślepą. Dodać do obydwu probówek (badanej i ślepej) po 9 ml wody destylowanej. Wymieszać, z każdej pobrać po 0,5 ml roztworu i dodać po 1,5 ml 12,5 % roztworu Na2CO3 oraz 0,25 ml rozcieńczonego odczynnika Folina i natychmiast wymieszać, energicznie wstrząsając. Po 20 minutach odczytać ekstynkcję próby badanej wobec ślepej przy długości fali 720 nm. 3. Wykonanie wykresu kalibracyjnego Wzorcowy roztwór tyrozyny o stężeniu 400 g/ml rozcieńczyć wg poniższej tabelki Wzorcowy Woda Numer g tyrozyny roztwór tyrozyny destylowana próbki w 1 ml roztworu (ml) (ml) 1 0,10 3,90 10 2 0,30 3,70 30 3 0,50 3,50 50 29
Z każdej próbki odmierzyć po 0,5 ml roztworu, dodać po 1,5 ml 12,5% Na2CO3 oraz 0,25 ml rozcieńczonego odczynnika Folina intensywnie wstrząsając. Próba ślepa zawiera 0,5 ml wody destylowanej, 1,5 ml 12,5% roztworu Na2CO3 oraz 0,25 ml rozcieńczonego odczynnika Folina. Po 20 minutach odczytać ekstynkcję prób wzorcowych wobec próby ślepej przy długości fali 720 nm. Sporządzić wykres kalibracyjny zależności ekstynkcji od stężenia tyrozyny. Obliczanie wyników Stężenie fibrynogenu w mg/dl osocza oblicza się ze wzoru: 10,8 10 200 T C 24T 0,9 1000 gdzie: T ilość tyrozyny w badanej próbce, odczytana z wykresu kalibracyjnego 10,8 równoważnik tyrozyny dla fibrynogenu 10 wynika z 10 krotnego rozcieńczenia próbki 200 wynika z przeliczenia stężenia na 100 ml osocza 0,9 rozcieńczenie krwi cytrynianem 1000 wynika z przeliczenia g/mg 30