Imię i nazwisko Uzyskane punkty Nr albumu data /2 podpis asystenta ĆWICZENIE 7 LIPIDY O ZNACZENIU BIOLOGICZNYM Wstęp merytoryczny Pojęciem lipidów określa się zespół heterogennych związków organicznych wykazujących duże podobieństwo pod względem rozpuszczalności - są one nierozpuszczalne w wodzie, ale rozpuszczalne w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak eter, chloroform i aceton. Do lipidów zalicza się: 1. lipidy proste: estry kwasów tłuszczowych z alkoholami (tłuszcze właściwe, woski) 2. lipidy złożone: estry kwasów tłuszczowych z alkoholem zawierające dodatkowe grupy (fosfolipidy, glikolipidy, sulfolipidy, aminolipidy itp.) 3. Prekursory i pochodne lipidów: kwasy tłuszczowe, glicerol, steroidy, aldehydy tłuszczowe, ciała ketonowe, witaminy rozpuszczalne w tłuszczach itp. Lipidy o znaczeniu biologicznym: 1. Triacyloglicerole (triglicerydy) estry glicerolu z kwasami tłuszczowymi, główna forma zapasowa kwasów tłuszczowych Rycina 1. Schemat biosyntezy triacyloglicerolu W przypadku lipidów naturalnie występujących w przyrodzie R R R (zwykle R nasycony kwas tłuszczowy, R nienasycony kwas tłuszczowy, R nasycony lub nienasycony kwas tłuszczowy). Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 1
Triacyloglicerole w podlegają hydrolizie: 2. Kwasy tłuszczowe: Rycina 2. Schemat hydrolizy triacyloglicerolu Materiał energetyczny magazynowany w postaci triglicerydów, substrat do biosyntezy innych lipidów (glikolipidów, fosfolipidów, ikozanoidów, estrów cholesterolu). Wśród kwasów tłuszczowych wyróżnia się kwasy: 1. nasycone: brak wiązań podwójnych pomiędzy atomami węgla 2. nienasycone: występuje co najmniej jedno wiązanie podwójne pomiędzy atomami węgla, mogą występować w położeniu cis i trans jednonienasycone wielonienasycone ikozanoidy (eikozanoidy) Rycina 3. Schemat struktury nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych Struktura chemiczna przykładowych kwasów tłuszczowych: Rycina 4. Budowa chemiczna wybranych nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 2
Wybrane nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe występujące w tłuszczach roślinnych, zwierzęcych oraz błonach biologicznych: Nazwa systematyczna Nazwa zwyczajowa Wzór sumaryczny liczba atomów C:liczba wiązań podwójnych kwas butanowy masłowy C 3 H 7 COOH 4 : 0 kwas heksanowy kapronowy C 5 H 11 COOH 6 : 0 kwas oktanowy kaprynowy C 7 H 15 COOH 8 :0 kwas dodekanowy laurynowy C 11 H 23 COOH 12 : 0 kwas tetradekanowy mirystynowy C 13 H 27 COOH 16 : 0 kwas heksadekanowy palmitynowy C 15 H 31 COOH 16 : 0 kwas heksadeka-9-enowy palmitoleinowy C 15 H 29 COOH 16 : 1 kwas oktadekanowy stearynowy C 17 H 35 COOH 18 : 0 kwas oktadeka-9-enowy oleinowy C 17 H 33 COOH 18 : 1 kwas oktadeka-9,12-dienowy linolowy C 17 H 31 COOH 18 : 2 kwas oktadeka-9,12,15-trienowy -linolenowy C 17 H 29 COOH 18 : 3 kwas oktadeka-6,9,12-trienowy -linolenowy C 17 H 29 COOH 18 : 3 kwas ejkoza-5,8,11,14-tetraenowy arachidonowy C 19 H 31 COOH 20 : 4 3. Ikozanoidy (eikozanoidy): pochodne wielonienasyconych 20-węglowych kwasów tłuszczowych o znaczeniu regulacyjnym prostanoidy (prostaglandyny, prostacykliny, tromboksany) leukotrieny lipoksyny 4. Fosfolipidy: główne składniki błon komórkowych. Rycina 5. Struktura chemiczna wybranych ikozanoidów Fosfolipidy to pochodne kwasu fosfatydowego (1,2-diacylo-3-fosfoglicerolu), w których fosforan ulega estryfikacji odpowiednim alkoholem. Rycina 6. Schemat ogólny budowy fosfolipidów Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 3
Fosfatydylocholiny (lecytyny): składniki błon biologicznych, źródło choliny. Rycina 7. Schemat budowy przykładowej fosfatydylocholiny Kefaliny: składniki substancji mózgowej i osłonek mielinowych zakończeń nerwowych. Rycina 8. Schemat budowy przykładowych kefalin Sfingomieliny: pochodne sfingozyny (amioalkohol), składniki mózgu i tkanki nerwowej. Rycina 9. Schemat budowy sfingomieliny 5. Glikolipidy: składniki błon komórkowych (głównie warstwy zewnętrznej) Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 4
Cholesterol i jego pochodne: Rycina 10. Schemat budowy przykładowego glikolipidu Cholesterol: pochodna steranu występująca we wszystkich tkankach w postaci wolnej lub estrów z kwasami tłuszczowymi. Prekursor kwasów żółciowych, hormonów steroidowych (androgeny, estrogeny, glikokortykoidy, mineralokortykoidy) oraz witaminy D. Z racji na właściwości hydrofobowe, w osoczu krwi transportowany jest w postaci rozpuszczalnych w wodzie kompleksów lipoprotein. Chylomikrony lipoproteiny transportujące triglicerydy i cholesterol pokarmowy z jelit do wątroby, LDL lipoproteiny transportujące cholesterol endogenny z wątroby do tkanek (aterogenne), HDL lipoproteiny transportujące cholesterol endogenny z tkanek do wątroby (antyaterogenne). Kwasy żółciowe: metabolity cholesterolu. Wśród kwasów żółciowych wyróżnia się kwasy pierwotne (kwas cholowy i kwas chenodeoksycholowy) syntetyzowane de novo w hepatocytach (komórki wątroby) w ilości około 500 mg/dobę oraz kwasy wtórne (kwas deoksycholowy i kwas litocholowy) powstające z pierwotnych kwasów żółciowych pod wpływem enzymów flory bakteryjnej jelit. Sole kwasów żółciowych jako detergenty i aktywatory lipaz trzustkowych uczestniczą w procesie trawienia i wchłaniania lipidów egzogennych w jelicie cienkim. Związki te są także ligandami receptorów wewnątrzkomórkowych uczestniczących w regulacji ekspresji genów zaangażowanych m.in. w ich własny metabolizm, a także regulację przemian węglowodanów i lipidów. Odpowiedni stosunek stężeń cholesterolu i kwasów żółciowych w żółci zapobiega wytrącaniu się cholesterolu w pęcherzyku żółciowym, a w konsekwencji rozwojowi kamicy pęcherzyka żółciowego. Witamina D 3 : syntetyzowana z 7-dehydrocholesterolu (prowitamina D) gromadzącego się w keratynocytach warstwy kolczystej i podstawnej naskórka. Pod wpływem promieni UVB( = 290-315 nm) ulega przekształceniu w cholekalcyferol, który transportowany jest do wątroby, gdzie zostaje przekształcony do kalcydiolu (25-hydroksycholekalcyferol). Ostatni etap syntezy aktywnej postaci witaminy D zachodzi głównie w nerkach, gdzie kalcydiol jest przekształcany do kalcytriolu (1,25-hydroksycholekalcyferol). Kalcytriol działa poprzez receptor jądrowy VDR wpływając regulacyjnie m.in. na gospodarkę wapniowofosforanową, węglowodanową, układ renina-angiotensyna-aldosteron, śródbłonek naczyń krwionośnych oraz układ immunologiczny. Hormony sterydowe: syntetyzowane w korze nadnerczy, gonadach, ciałku żółtym oraz łożysku pochodne cholesterolu, wśród których wyróżnia się mineralokortykoidy (regulacja gospodarki wodno-mineralnej, np. aldosteron), glikokortykoidy (regulacja gospodarki węglowodanowej, np. kortyzol) oraz hormony płciowe (męskie androgeny, np. testosteron oraz żeńskie estrogeny i gestageny, np. estradiol i progesteron), działające przez receptory wewnątrzkomórkowe. Rycina 11. Przykłady hormonów sterydowych Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 5
Cel: Badanie rozpuszczalności lipidów Zasada metody: Doświadczenie 1 Tłuszcze nie rozpuszczają się w wodzie, natomiast rozpuszczają się w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych. Postępowanie: Przygotuj 4 długie szklane probówki i dodaj do każdej z nich odpowiednie substancje zgodnie ze schematem zamieszczonym w poniższej tabeli: Numer probówki składnik 1 2 3 4 woda 1 cm 3 - - - etanol - 1 cm 3 - - chloroform - - 1 cm 3 - aceton - - - 1 cm 3 olej roślinny 4 krople 4 krople 4 krople 4 krople wytrząsnąć zawartość próbówek za pomocą vorteksu przez 20 sekund Obserwacje: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 6
Doświadczenie 2 Cel: Badanie właściwości kwasów żółciowych jako emulgatorów Zasada metody: Emulsja to układ koloidalny, w którym ośrodek rozpraszający i substancja rozproszona są nie mieszającymi się wzajemnie cieczami. Układ taki powstaje w warunkach intensywnego wytrząsania np. w układzie tłuszcz woda. Emulsja jest układem termodynamicznie nietrwałym, co prowadzi do szybkiego jego rozwarstwienia z powierzchniowym usytuowaniem tego składnika, który cechuje niższa gęstość. W celu utrwalenia emulsji stosuje się substancje powierzchniowo czynne (surfaktanty) zwane też emulgatorami. Cząsteczki tych substancji są amfifilowe, co oznacza, iż posiadają wyraźnie zróżnicowane pod względem powinowactwa do wody lub innych cieczy polarnych bieguny: hydrofilowy i hydrofobowy. Emulgator to substancja zmniejszająca napięcie powierzchniowe na granicy faz, tj. siłę, która przeciwstawia się zwiększeniu powierzchni granicznej między wodą i np. tłuszczem. Powstała w ten sposób utrwalona emulsja charakteryzuje się istotnie wyższą stabilnością. Do emulgatorów zalicza się m.in. lecytynę (fosfatydylocholinę), sole estrów kwasu siarkowego i wyższych alkoholi, mydła (sole sodowe lub potasowe kwasów tłuszczowych), kwasy żółciowe. Rycina 15 Układ detergentów w mieszaninie woda/olej oraz przykładowe detergenty Utworzenie emulsji w przewodzie pokarmowym ma istotne znaczenie w procesie trawienia lipidów pokarmowych. Sole kwasów żółciowych, będące produktami przemian cholesterolu, wykazują zdolność obniżania napięcia powierzchniowego na granicy faz, a dzięki temu emulgowania tłuszczów, co ułatwia ich trawienie w przewodzie pokarmowym. Kwasy żółciowe zwiększają powierzchnie kontaktu między fazą wodną, w której występuje lipaza trzustkowa i fazą lipidową, w której zawarte są trawione przez ten enzym triacyloglicerole. Kwasy żółciowe tworzą tym samym w środowisku treści jelitowej układy micelarne, które ułatwiają także dalsze wchłanianie lipidów, produktów ich trawienia oraz rozpuszczonych w lipidach substancji, np. witamin A, D, E i K. Rycina 16 Kwasy żółciowe jako detergenty Kwasy żółciowe, jako regulatory ekspresji genów, aktywują receptory jądrowe, m.in. receptor farnezoidowy X (FXR), receptor pregnanu X (PXR) oraz receptor witaminy D (VDR), wpływając nie tylko na własny metabolizm, ale także na metabolizm glukozy i lipidów. Silnie hydrofobowy kwas litocholowy, będący główną formą usuwania nadmiaru cholesterolu z organizmu, może działać toksycznie na komórki. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 7
Etap 1: Postępowanie: Przygotuj 3 długie szklane probówki i postępuj według schematu zamieszczonego w tabelce: Odczynniki Numer probówki 1 2 3 olej 1.0 cm 3 1.0 cm 3 1.0 cm 3 woda destylowana 5.5 cm 3 5.0 cm 3 5.0 cm 3 wymieszaj zawartość probówek roztwór deoksycholanu sodowego - 5.0 cm 3 - detergent - - 5.0 cm 3 mocno wytrząśnij probówkę Obserwacje: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 8
Etap 2: Wykrywanie kwasów żółciowych testem Hay a Postępowanie: Przygotuj 2 szklane probówki i postępuj według schematu zamieszczonego w tabelce: Odczynniki Numer probówki 1 2 roztwór żółci 5.0 cm 3 - woda destylowana - 5.0 cm 3 siarka sublimowana kilka ziaren kilka ziaren Obserwacje: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 9
Doświadczenie 3 Cel: Reakcja zmydlania tłuszczów i badanie właściwości mydeł Zasada metody: Reakcja zmydlania tłuszczu (hydroliza zasadowa) zachodzi w środowisku zasadowym. Produktami reakcji, poza alkoholem, są mydła, czyli sole kwasów tłuszczowych. Rycina 16 Hydroliza zasadowa triacyloglicerolu (reakcja zmydlania) Mydła jako sole słabych kwasów oraz mocnych zasad wykazują odczyn zasadowy. Pod wpływem mocnych kwasów nieorganicznych (np. H 2 SO 4 ) dochodzi do wyparcia z mydła słabego kwasu, jakim jest nierozpuszczalny w wodzie kwas tłuszczowy. Mydła charakteryzują się różną rozpuszczalnością w wodzie w zależności od kationu metalu, jaki wchodzi w jego skład. Mydła sodowe i potasowe dobrze rozpuszczają się w wodzie, natomiast mydła wapniowe i magnezowe są trudno rozpuszczalne w wodzie. Mydła rozpuszczalne w wodzie są substancjami powierzchniowo czynnymi. Micele koloidowe tworzone przez mydła utrzymują się w wodzie dzięki otaczającemu je płaszczowi wodnemu. Rycina 17 Mydło jako detergent Dodanie elektrolitu o większym powinowactwie do wody np. NaCl powoduje zobojętnienie ładunków elektrycznych na powierzchni, przez co cząsteczki koloidu są pozbawiane otoczki wodnej i wypadają z roztworu. W przebiegu ostrego zapalenia trzustki, dochodzić może do uwolnienia enzymów lipolitycznych trzustki do okolicznych tkanek i uczynnienia lipazy, czego następstwem jest rozwój tzw. martwicy Balsera czyli martwicy tkanki tłuszczowej spowodowanej hydrolizą triacylogliceroli i powstawaniem nierozpuszczalnych mydeł wapniowych tworzących charakterystyczne ogniska w jamie brzusznej. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 10
Postępowanie Etap 1: Otrzymywanie mydła potasowego Przygotuj suchą długą szklaną probówkę i postępuj wg zamieszczonego niżej schematu. Odczynnik Probówka smalec grudka wielkości ziarna fasoli 10% roztwór KOH w metanolu 3 cm 3 ogrzewanie przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej, a następnie schłodzenie w strumieniu zimnej wody woda destylowana 10 cm 3 wytrząsanie w celu rozpuszczenia mydła Etap 2: Badanie właściwości mydła sodowego Przygotuj trzy probówki i postępuj zgodnie z poniższym schematem. odczynnik numer probówki 1 2 3 roztwór mydła 2 cm 3 2 cm 3 2 cm 3 1% roztwór CaCl 2 0.5 cm 3 - - woda destylowana 3 cm 3 - - stały NaCl - do wytrącenia osadu - 1 M H 2 SO 4 - - 0.5 cm 3 Obserwacje: zlać płyn znad osadu i dodać 2 cm 3 wody destylowanej, mocno wytrząsnąć ogrzewać w gorącej łaźni wodnej do rozpuszczenia osadu; ochłodzić w strumieniu zimnej wody Doświadczenie 4 Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 11
Cel: Wykrywanie glicerolu Zasada metody: Tłuszcze właściwe (triacyloglicerole) to estry alkoholu trihydroksylowego glicerolu oraz jednokarboksylowych kwasów tłuszczowych. Glicerol, podobnie jak inne alkohole wielowodorotlenowe mające grupy hydroksylowe przy sąsiednich atomach węgla, reaguje z wodorotlenkiem miedzi(ii), tworząc charakterystyczny kompleks miedzi(ii) o szafirowej barwie. 2NaOH + CuSO 4 Cu(OH) 2 + Na 2 SO 4 Rycina 18 Reakcja wykrywania glicerolu Postępowanie: Przygotuj dwie probówki i postępuj zgodnie z zamieszczonym poniżej schematem. odczynnik Numer probówki 1 2 7% wodny roztwór CuSO 4 1 cm 3 1 cm 3 10% roztwór wodny NaOH 1 cm 3 1 cm 3 wymieszaj zawartość probówek glicerol 1 cm 3 - woda destylowana - 1 cm 3 wymieszaj zawartość probówek Obserwacje: Doświadczenie 5 Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 12
Cel: Wykrywanie nienasyconych kwasów tłuszczowych w tłuszczach Zasada metody: Fluorowce podlegają reakcji addycji elektrofilowej do występujących w nienasyconych kwasach tłuszczowych wiązań podwójnych między atomami węgla. W wyniku reakcji jodu z nienasyconymi kwasami tłuszczowymi, odczynnik Hübla (alkoholowy roztwór I 2 w HgCl 2 ) odbarwia się. Postępowanie: Przygotuj 4 probówki postępuj zgodnie z poniższym schematem. Numer probówki odczynnik 1 2 3 4 tłuszcz olej smalec margaryna masło chloroform 2.0 cm 3 2.0 cm 3 2.0 cm 3 2.0 cm 3 odczynnik Hübla 2.0 cm 3 2.0 cm 3 2.0 cm 3 2.0 cm 3 zamieszaj i obserwuj probówki przez 60 sekund Obserwacje: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 13
Cel: Utlenianie nienasyconych kwasów tłuszczowych Doświadczenie 6 Zasada metody: Wiązania podwójne w nienasyconych kwasach tłuszczowych łatwo ulegają utlenieniu pod wpływem utleniaczy, np. KMnO 4. Dochodzi wówczas do rozerwania łańcucha węglowego w miejscu podwójnych wiązań z jednoczesnym utlenieniem końcowych atomów węgla do grup karbonylowych. Postępowanie: Dodaj 3-4 krople oleju do suchej probówki, następnie dodaj 3 krople stężonego 12 M wodnego roztworu NaOH i 2 cm 3 wody destylowanej. Ogrzewaj roztwór lekko przez kilka sekund. Dodaj 2 krople wodnego roztworu KMnO 4, dokładnie wymieszaj po dodaniu każdej kropli. Zwróć uwagę na kolor roztworu. Obserwacje: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 14
Doświadczenie 7 Cel: Wykrywanie witamin rozpuszczalnych w tłuszczach na przykładzie witaminy E Zasada metody: Witamina E to nazwa obejmująca grupę związków organicznych występujących w olejach roślinnych, obejmująca tokoferole i tokotienole. Różnią się one liczbą i położeniem grup metylowych. Właściwości redukcyjne nadaje im grupa hydroksylowa w pozycji 6 w pierścieniu 6-chromanolu. Metody oznaczania tokoferolu są oparte na wykorzystaniu tych właściwości w reakcjach chemicznych. W reakcji Emmerie-Engla tokoferol reaguje w środowisku etanolu z α,α -bipirydyną. Powstały związek w obecności jonów żelaza(iii) tworzy sól o intensywnie czerwonej barwie. Postępowanie: Przygotuj dwie krótkie probówki i postępuj zgodnie z poniższym schematem: odczynnik Numer probówki 1 2 3 witamina E 4 krople - - olej roślinny - 4 krople - etanol 0.50 cm 3 0.50 cm 3 0.50 cm 3 0,2% roztwór FeCl 3 w etanololu 0.25 cm 3 0.25 cm 3 0.25 cm 3 0,5% roztwór, -bipirydyny w etanolu 0.50 cm 3 0.50 cm 3 0.50 cm 3 woda destylowana - - 4 krople pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na 5 minut Obserwacje: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 15
Doświadczenie 7 Cel: Oznaczanie stężenia cholesterolu w surowicy krwi metodą enzymatyczną Zasada metody: Metoda enzymatyczna służy do oznaczania całkowitego poziomu cholesterolu w surowicy przy użyciu pojedynczego odczynnika wodnego. Estry cholesterolu są hydrolizowane w celu uwolnienia cholesterolu przez hydrolazę estru cholesterolu (EC 3.1.1.13). Uwolniony cholesterol jest utleniany przez oksydazę cholesterolu (EC 1.1.3.6) do cholest- 4-en-3-onu z jednoczesną syntezą nadtlenku wodoru, który reaguje z 4-aminoantypiryną i fenolem w obecności peroksydazy, tworząc chinoniminę (czerwony kolor) wykazującą maksimum absorpcji przy 500 nm. Postępowanie Przygotuj trzy kuwety i postępuj zgodnie z poniższym schematem: Numer kuwety odczynnik 1 2 3 surowica 0.01 cm 3 - - wzorzec - 0.01 cm 3 - woda destylowana - - 0.01 cm 3 odczynnik roboczy 1.0 cm 3 1.0 cm 3 1.0 cm 3 wymieszaj zawartość kuwet i inkubuj przez 5 minut w temperaturze 37 C zmierz absorpcję wzorca i badanej surowicy względem próby 3 przy długości fali Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 16
Wzorzec - roztwór cholesterolu o stężeniu 5.17 mmol/l (200 mg/dl) Masa molowa cholesterolu - 386.65 g/mol Dla celów diagnostycznych stężenie cholesterolu wyraża się w mmol/l i w mg/dl (mg%). Oblicz stężenie cholesterolu całkowitego w mmol/l i dokonaj analizy wyniku na podstawie poniższego zestawienia: Obliczenia: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 17
Doświadczenie 8 Cel: Oznaczanie stężenia 17-ketosteroidów w surowicy krwi metodą Zimmermana-Reinchardta Zasada metody: Reakcja Zimmermana-Reinchardta jest charakterystyczna dla 17-ketosteroidów, które posiadają grupę ketonową w pozycji C-17 i sąsiadującą z nią (w pozycji C-16) grupę metylenową. W środowisku zasadowym m-dinitrobenzen tworzy z 17-ketosteroidem związek kompleksowy o barwie czerwono-fioletowej. Intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do stężenia 17-ketosteroidów w badanej próbie. Postępowanie: Do dwóch suchych kuwet pomiarowych oznaczonych P (próba badana) i O (próba ślepa) dodaj kolejno: Odczynnik P Oznaczenie kuwety O roztwór DHA (dihydroizoandrosteron) w etanolu 0.2 cm 3 - etanol - 0.2 cm 3 roztwór m-dwunitrobenzenu w etanolu 0.2 cm 3 0.2 cm 3 5 M roztwór KOH w etanolu 0.2 cm 3 0.2 cm 3 wymieszać zawartość kuwet i pozostawić w ciemności przez 30 minut etanol 0.2 cm 3 0.2 cm 3 Zmierzyć absorpcję próbki P względem próbki O przy długości fali =520 nm Obserwacje: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 18