Biochemia z elementami Chemii

Transkrypt

1 Imię i nazwisko Uzyskane punkty Nr albumu data /3 podpis asystenta ĆWICZENIE 9 LIPIDY O ZNACZENIU BIOLOGICZNYM Wstęp merytoryczny Pojęciem lipidów określa się zespół heterogennych związków organicznych wykazujących duŝe podobieństwo pod względem rozpuszczalności - są one nierozpuszczalne w wodzie, ale rozpuszczalne w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak eter, chloroform i aceton. Do lipidów zalicza się: 1. lipidy proste: estry kwasów tłuszczowych z alkoholami (tłuszcze właściwe, woski) 2. lipidy złoŝone: estry kwasów tłuszczowych z alkoholem zawierające dodatkowe grupy (fosfolipidy, glikolipidy, sulfolipidy, aminolipidy itp.) 3. Prekursory i pochodne lipidów: kwasy tłuszczowe, glicerol, steroidy, aldehydy tłuszczowe, ciała ketonowe, witaminy rozpuszczalne w tłuszczach itp. Lipidy o znaczeniu biologicznym: 1. Triacyloglicerole (triglicerydy) estry glicerolu z kwasami tłuszczowymi, główna forma zapasowa kwasów tłuszczowych Rycina 1. Schemat biosyntezy triacyloglicerolu W przypadku lipidów naturalnie występujących w przyrodzie R R R (zwykle R nasycony kwas tłuszczowy, R nienasycony kwas tłuszczowy, R nasycony lub nienasycony kwas tłuszczowy). Zakład Biochemii str. 1

2 Triacyloglicerole podlegają hydrolizie: 2. Kwasy tłuszczowe: Rycina 2. Schemat hydrolizy triacyloglicerolu Materiał energetyczny magazynowany w postaci triglicerydów, substrat do biosyntezy innych lipidów (glikolipidów, fosfolipidów, ikozanoidów, estrów cholesterolu). Wśród kwasów tłuszczowych wyróŝnia się kwasy: 1. nasycone: brak wiązań podwójnych pomiędzy atomami węgla 2. nienasycone: występuje co najmniej jedno wiązanie podwójne pomiędzy atomami węgla, mogą występować w połoŝeniu cis i trans - jednonienasycone - wielonienasycone - ikozanoidy (eikozanoidy) Rycina 3. Schemat struktury nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych Struktura chemiczna przykładowych kwasów tłuszczowych: Rycina 4. Budowa chemiczna wybranych nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych Wybrane nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe występujące w tłuszczach roślinnych, zwierzęcych oraz błonach biologicznych: Zakład Biochemii str. 2

3 Nazwa systematyczna Nazwa zwyczajowa Wzór sumaryczny liczba atomów C:liczba wiązań podwójnych kwas butanowy masłowy C 3 H 7 COOH 4 : 0 kwas heksanowy kapronowy C 5 H 11 COOH 6 : 0 kwas oktanowy kaprynowy C 7 H 15 COOH 8 :0 kwas dodekanowy laurynowy C 11 H 23 COOH 12 : 0 kwas tetradekanowy mirystynowy C 13 H 27 COOH 16 : 0 kwas heksadekanowy palmitynowy C 15 H 31 COOH 16 : 0 kwas heksadeka-9-enowy palmitoleinowy C 15 H 29 COOH 16 : 1 kwas oktadekanowy stearynowy C 17 H 35 COOH 18 : 0 kwas oktadeka-9-enowy oleinowy C 17 H 33 COOH 18 : 1 kwas oktadeka-9,12-dienowy linolowy C 17 H 31 COOH 18 : 2 kwas oktadeka-9,12,15-trienowy α-linolenowy C 17 H 29 COOH 18 : 3 kwas oktadeka-6,9,12-trienowy γ-linolenowy C 17 H 29 COOH 18 : 3 kwas ejkoza-5,8,11,14-tetraenowy arachidonowy C 19 H 31 COOH 20 : 4 3. Ikozanoidy (eikozanoidy): pochodne wielonienasyconych 20-węglowych kwasów tłuszczowych o znaczeniu regulacyjnym - prostanoidy (prostaglandyny, prostacykliny, tromboksany) - leukotrieny - lipoksyny 4. Fosfolipidy: główne składniki błon komórkowych. Rycina 5. Struktura chemiczna wybranych ikozanoidów Fosfolipidy to pochodne kwasu fosfatydowego (1,2-diacylo-3-fosfoglicerolu), w których fosforan ulega estryfikacji odpowiednim alkoholem. Rycina 6. Schemat ogólny budowy fosfolipidów Fosfatydylocholiny (lecytyny): składniki błon biologicznych, źródło choliny. Zakład Biochemii str. 3

4 Rycina 7. Schemat budowy przykładowej fosfatydylocholiny Kefaliny: składniki substancji mózgowej i osłonek mielinowych zakończeń nerwowych. Rycina 8. Schemat budowy przykładowych kefalin Sfingomieliny: pochodne sfingozyny (amioalkohol), składniki mózgu i tkanki nerwowej. Rycina 9. Schemat budowy sfingomieliny 5. Glikolipidy: składniki błon komórkowych (głównie warstwy zewnętrznej) Rycina 10. Schemat budowy przykładowego glikolipidu Zakład Biochemii str. 4

5 Cholesterol i jego pochodne: Cholesterol: pochodna steranu występująca we wszystkich tkankach w postaci wolnej lub estrów z kwasami tłuszczowymi. Prekursor kwasów Ŝółciowych, hormonów steroidowych (androgeny, estrogeny, glikokortykoidy, mineralokortykoidy) oraz witaminy D. Z racji na właściwości hydrofobowe, w osoczu krwi transportowany jest w postaci rozpuszczalnych w wodzie kompleksów lipoprotein. Chylomikrony lipoproteiny transportujące triglicerydy i cholesterol pokarmowy z jelit do wątroby, LDL lipoproteiny transportujące cholesterol endogenny z wątroby do tkanek (aterogenne), HDL lipoproteiny transportujące cholesterol endogenny z tkanek do wątroby (antyaterogenne). Kwasy Ŝółciowe: metabolity cholesterolu. Wśród kwasów Ŝółciowych wyróŝnia się kwasy pierwotne (kwas cholowy i kwas chenodeoksycholowy) syntetyzowane de novo w hepatocytach (komórki wątroby) w ilości około 500 mg/dobę oraz kwasy wtórne (kwas deoksycholowy i kwas litocholowy) powstające z pierwotnych kwasów Ŝółciowych pod wpływem enzymów flory bakteryjnej jelit. Sole kwasów Ŝółciowych jako detergenty i aktywatory lipaz trzustkowych uczestniczą w procesie trawienia i wchłaniania lipidów egzogennych w jelicie cienkim. Związki te są takŝe ligandami receptorów wewnątrzkomórkowych uczestniczących w regulacji ekspresji genów zaangaŝowanych m.in. w ich własny metabolizm, a takŝe regulację przemian węglowodanów i lipidów. Odpowiedni stosunek stęŝeń cholesterolu i kwasów Ŝółciowych w Ŝółci zapobiega wytrącaniu się cholesterolu w pęcherzyku Ŝółciowym, a w konsekwencji rozwojowi kamicy pęcherzyka Ŝółciowego. Witamina D 3 : syntetyzowana z 7-dehydrocholesterolu (prowitamina D) gromadzącego się w keratynocytach warstwy kolczystej i podstawnej naskórka. Pod wpływem promieni UVB(λ = nm) ulega przekształceniu w cholekalcyferol, który transportowany jest do wątroby, gdzie zostaje przekształcony do kalcydiolu (25-hydroksycholekalcyferol). Ostatni etap syntezy aktywnej postaci witaminy D zachodzi głównie w nerkach, gdzie kalcydiol jest przekształcany do kalcytriolu (1,25-hydroksycholekalcyferol). Kalcytriol działa poprzez receptor jądrowy VDR wpływając regulacyjnie m.in. na gospodarkę wapniowofosforanową, węglowodanową, układ renina-angiotensyna-aldosteron, śródbłonek naczyń krwionośnych oraz układ immunologiczny. Hormony sterydowe: syntetyzowane w korze nadnerczy, gonadach, ciałku Ŝółtym oraz łoŝysku pochodne cholesterolu, wśród których wyróŝnia się mineralokortykoidy (regulacja gospodarki wodno-mineralnej, np. aldosteron), glikokortykoidy (regulacja gospodarki węglowodanowej, np. kortyzol) oraz hormony płciowe (męskie androgeny, np. testosteron oraz Ŝeńskie estrogeny i gestageny, np. estradiol i progesteron), działające przez receptory wewnątrzkomórkowe. Cel: Badanie rozpuszczalności lipidów Rycina 11. Przykłady hormonów sterydowych Doświadczenie 1 Zakład Biochemii str. 5

6 Tłuszcze nie rozpuszczają się w wodzie, natomiast rozpuszczają się w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych. Postępowanie: Przygotuj 4 długie szklane probówki i dodaj do kaŝdej z nich odpowiednie substancje zgodnie ze schematem zamieszczonym w poniŝszej tabeli: Numer probówki składnik woda 1.0 cm etanol cm chloroform cm 3 - aceton cm 3 olej roślinny 4 krople 4 krople 4 krople 4 krople wytrząsnąć zawartość próbówek za pomocą vorteksu przez 20 sekund Obserwacje: Zakład Biochemii str. 6

7 Doświadczenie 2 Cel: Badanie właściwości kwasów Ŝółciowych jako emulgatorów Emulsja to układ koloidalny, w którym ośrodek rozpraszający i substancja rozproszona są nie mieszającymi się wzajemnie cieczami. Układ taki powstaje w warunkach intensywnego wytrząsania np. w układzie tłuszcz woda. Emulsja jest układem termodynamicznie nietrwałym, co prowadzi do szybkiego jego rozwarstwienia z powierzchniowym usytuowaniem tego składnika, który cechuje niŝsza gęstość. W celu utrwalenia emulsji stosuje się substancje powierzchniowo czynne (surfaktanty) zwane teŝ emulgatorami. Cząsteczki tych substancji są amfifilowe, co oznacza, iŝ posiadają wyraźnie zróŝnicowane pod względem powinowactwa do wody lub innych cieczy polarnych bieguny: hydrofilowy i hydrofobowy. Emulgator to substancja zmniejszająca napięcie powierzchniowe na granicy faz, tj. siłę, która przeciwstawia się zwiększeniu powierzchni granicznej między wodą i np. tłuszczem. Powstała w ten sposób utrwalona emulsja charakteryzuje się istotnie wyŝszą stabilnością. Do emulgatorów zalicza się m.in. lecytynę (fosfatydylocholinę), sole estrów kwasu siarkowego i wyŝszych alkoholi, mydła (sole sodowe lub potasowe kwasów tłuszczowych), kwasy Ŝółciowe. Rycina 15 Układ detergentów w mieszaninie woda/olej oraz przykładowe detergenty Utworzenie emulsji w przewodzie pokarmowym ma istotne znaczenie w procesie trawienia lipidów pokarmowych. Sole kwasów Ŝółciowych, będące produktami przemian cholesterolu, wykazują zdolność obniŝania napięcia powierzchniowego na granicy faz, a dzięki temu emulgowania tłuszczów, co ułatwia ich trawienie w przewodzie pokarmowym. Kwasy Ŝółciowe zwiększają powierzchnie kontaktu między fazą wodną, w której występuje lipaza trzustkowa i fazą lipidową, w której zawarte są trawione przez ten enzym triacyloglicerole. Kwasy Ŝółciowe tworzą tym samym w środowisku treści jelitowej układy micelarne, które ułatwiają takŝe dalsze wchłanianie lipidów, produktów ich trawienia oraz rozpuszczonych w lipidach substancji, np. witamin A, D, E i K. Rycina 16 Kwasy Ŝółciowe jako detergenty Kwasy Ŝółciowe, jako regulatory ekspresji genów, aktywują receptory jądrowe, m.in. receptor farnezoidowy X (FXR), receptor pregnanu X (PXR) oraz receptor witaminy D (VDR), wpływając nie tylko na własny metabolizm, ale takŝe na metabolizm glukozy i lipidów. Silnie hydrofobowy kwas litocholowy, będący główną formą usuwania nadmiaru cholesterolu z organizmu, moŝe działać toksycznie na komórki. Zakład Biochemii str. 7

8 Etap 1: Postępowanie: Przygotuj 3 długie szklane probówki i postępuj według schematu zamieszczonego w tabelce: Odczynniki Numer probówki olej 1.0 cm cm cm 3 woda destylowana 5.5 cm cm cm 3 wymieszaj zawartość probówek roztwór deoksycholanu sodowego cm 3 - detergent cm 3 mocno wytrząśnij probówkę Obserwacje: Zakład Biochemii str. 8

9 Etap 2: Wykrywanie kwasów Ŝółciowych testem Hay a Postępowanie: Przygotuj 2 szklane probówki i postępuj według schematu zamieszczonego w tabelce: Odczynniki Numer probówki 1 2 roztwór Ŝółci 5.0 cm 3 - woda destylowana cm 3 siarka sublimowana kilka ziaren kilka ziaren Obserwacje: Zakład Biochemii str. 9

10 Doświadczenie 3 Cel: Reakcja zmydlania tłuszczów i badanie właściwości mydeł Reakcja zmydlania tłuszczu (hydroliza zasadowa) zachodzi w środowisku zasadowym. Produktami reakcji, poza alkoholem, są mydła, czyli sole kwasów tłuszczowych. Rycina 16 Hydroliza zasadowa triacyloglicerolu (reakcja zmydlania) Mydła jako sole słabych kwasów oraz mocnych zasad wykazują odczyn zasadowy. Pod wpływem mocnych kwasów nieorganicznych (np. H 2 SO 4 ) dochodzi do wyparcia z mydła słabego kwasu, jakim jest nierozpuszczalny w wodzie kwas tłuszczowy. Mydła charakteryzują się róŝną rozpuszczalnością w wodzie w zaleŝności od kationu metalu, jaki wchodzi w jego skład. Mydła sodowe i potasowe dobrze rozpuszczają się w wodzie, natomiast mydła wapniowe i magnezowe są trudno rozpuszczalne w wodzie. Mydła rozpuszczalne w wodzie są substancjami powierzchniowo czynnymi. Micele koloidowe tworzone przez mydła utrzymują się w wodzie dzięki otaczającemu je płaszczowi wodnemu. Rycina 17 Mydło jako detergent Dodanie elektrolitu o większym powinowactwie do wody np. NaCl powoduje zobojętnienie ładunków elektrycznych na powierzchni, przez co cząsteczki koloidu są pozbawiane otoczki wodnej i wypadają z roztworu. W przebiegu ostrego zapalenia trzustki, dochodzić moŝe do uwolnienia enzymów lipolitycznych trzustki do okolicznych tkanek i uczynnienia lipazy, czego następstwem jest rozwój tzw. martwicy Balsera czyli martwicy tkanki tłuszczowej spowodowanej hydrolizą triacylogliceroli i powstawaniem nierozpuszczalnych mydeł wapniowych tworzących charakterystyczne ogniska w jamie brzusznej. Zakład Biochemii str. 10

11 Postępowanie Etap 1: Otrzymywanie mydła potasowego Przygotuj suchą długą szklaną probówkę i postępuj według zamieszczonego niŝej schematu. Odczynnik Probówka smalec grudka wielkości ziarna fasoli 10% roztwór KOH w metanolu 3.0 cm 3 ogrzewanie przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej, a następnie schłodzenie w strumieniu zimnej wody woda destylowana 10.0 cm 3 wytrząsanie w celu rozpuszczenia mydła Etap 2: Badanie właściwości mydła sodowego Przygotuj trzy probówki i postępuj zgodnie z poniŝszym schematem. odczynnik numer probówki roztwór mydła 2.0 cm cm cm 3 1% roztwór CaCl cm woda destylowana 3.0 cm stały NaCl - do wytrącenia osadu - 1 M H 2 SO cm 3 Obserwacje: zlać płyn znad osadu i dodać 2 cm 3 wody destylowanej, mocno wytrząsnąć ogrzewać w gorącej łaźni wodnej do rozpuszczenia osadu; ochłodzić w strumieniu zimnej wody Zakład Biochemii str. 11

12 Cel: Wykrywanie glicerolu Doświadczenie 4 Tłuszcze właściwe (triacyloglicerole) to estry alkoholu trihydroksylowego glicerolu oraz jednokarboksylowych kwasów tłuszczowych. Glicerol, podobnie jak inne alkohole wielowodorotlenowe mające grupy hydroksylowe przy sąsiednich atomach węgla, reaguje z wodorotlenkiem miedzi(ii), tworząc charakterystyczny kompleks miedzi(ii) o szafirowej barwie. 2NaOH + CuSO 4 Cu(OH) 2 + Na 2 SO 4 Rycina 18 Reakcja wykrywania glicerolu Postępowanie: Przygotuj dwie probówki i postępuj zgodnie z zamieszczonym poniŝej schematem. odczynnik Numer probówki 1 2 7% wodny roztwór CuSO cm cm 3 10% roztwór wodny NaOH 1.0 cm cm 3 wymieszaj zawartość probówek glicerol 1.0 cm 3 - woda destylowana cm 3 wymieszaj zawartość probówek Obserwacje: Doświadczenie 5 Zakład Biochemii str. 12

13 Cel: Wykrywanie nienasyconych kwasów tłuszczowych w tłuszczach Fluorowce podlegają reakcji addycji elektrofilowej do występujących w nienasyconych kwasach tłuszczowych wiązań podwójnych między atomami węgla. W wyniku reakcji jodu z nienasyconymi kwasami tłuszczowymi, odczynnik Hübla (alkoholowy roztwór I 2 w HgCl 2 ) odbarwia się. Postępowanie: Przygotuj 4 probówki postępuj zgodnie z poniŝszym schematem. Numer probówki odczynnik tłuszcz olej smalec margaryna masło chloroform 2.0 cm cm cm cm 3 odczynnik Hübla 0.2 cm cm cm cm 3 zamieszaj i obserwuj probówki przez 60 sekund Obserwacje: Zakład Biochemii str. 13

14 Cel: Utlenianie nienasyconych kwasów tłuszczowych Doświadczenie 6 Wiązania podwójne w nienasyconych kwasach tłuszczowych łatwo ulegają utlenieniu pod wpływem utleniaczy, np. KMnO 4. Dochodzi wówczas do rozerwania łańcucha węglowego w miejscu podwójnych wiązań z jednoczesnym utlenieniem końcowych atomów węgla do grup karbonylowych. Postępowanie: Dodaj 3-4 krople oleju do suchej probówki, następnie dodaj 3 krople stęŝonego 12 M wodnego roztworu NaOH i 2 cm 3 wody destylowanej. Ogrzewaj roztwór lekko przez kilka sekund. Dodaj 2 krople wodnego roztworu KMnO 4, dokładnie wymieszaj po dodaniu kaŝdej kropli. Zwróć uwagę na kolor roztworu. Obserwacje: Zakład Biochemii str. 14

15 Doświadczenie 7 Cel: Wykrywanie witamin rozpuszczalnych w tłuszczach na przykładzie witaminy E Witamina E to nazwa obejmująca grupę związków organicznych występujących w olejach roślinnych, obejmująca tokoferole i tokotrienole. RóŜnią się one liczbą i połoŝeniem grup metylowych. Właściwości redukcyjne nadaje im grupa hydroksylowa w pozycji 6 w pierścieniu 6-chromanolu. Metody oznaczania tokoferolu są oparte na wykorzystaniu tych właściwości w reakcjach chemicznych. W reakcji Emmerie-Engla tokoferol reaguje w środowisku etanolu z α,α -bipirydyną. Powstały związek w obecności jonów Ŝelaza(III) tworzy sól o intensywnie czerwonej barwie. Postępowanie: Przygotuj dwie krótkie probówki i postępuj zgodnie z poniŝszym schematem: odczynnik Numer probówki witamina E 4 krople - - olej roślinny - 4 krople - etanol 0.50 cm cm cm 3 0,2% roztwór FeCl 3 w etanololu 0.25 cm cm cm 3 0,5% roztwór α,α -bipirydyny w etanolu 0.50 cm cm cm 3 woda destylowana krople pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na 5 minut Obserwacje: Zakład Biochemii str. 15

16 Cel: Wykrywanie steroli na przykładzie cholesterolu Doświadczenie Oznaczanie stęŝenia cholesterolu w surowicy krwi metodą enzymatyczną Metoda enzymatyczna słuŝy do oznaczania całkowitego poziomu cholesterolu w surowicy przy uŝyciu pojedynczego odczynnika wodnego. Estry cholesterolu są hydrolizowane w celu uwolnienia cholesterolu przez hydrolazę estru cholesterolu (EC ). Uwolniony cholesterol jest utleniany przez oksydazę cholesterolu (EC ) do cholest- 4-en-3-onu z jednoczesną syntezą nadtlenku wodoru, który reaguje z 4-aminoantypiryną i fenolem w obecności peroksydazy, tworząc chinoniminę (czerwony kolor) wykazującą maksimum absorpcji przy 500 nm. Postępowanie Przygotuj trzy kuwety i postępuj zgodnie z poniŝszym schematem: Numer kuwety odczynnik surowica 0.01 cm wzorzec cm 3 - woda destylowana cm 3 odczynnik roboczy 1.0 cm cm cm 3 wymieszaj zawartość kuwet i inkubuj przez 5 minut w temperaturze 37 C zmierz absorpcję wzorca i badanej surowicy względem próby 3 przy długości fali λ=500nm Zakład Biochemii str. 16

17 Wzorzec - roztwór cholesterolu o stęŝeniu 5.17 mmol/l (200 mg/dl) Masa molowa cholesterolu g/mol Dla celów diagnostycznych stęŝenie cholesterolu wyraŝa się w mmol/l i w mg/dl (mg%). Oblicz stęŝenie cholesterolu całkowitego w mmol/l i dokonaj analizy wyniku na podstawie poniŝszego zestawienia: Obliczenia: Zakład Biochemii str. 17

18 8.2. Wykrywanie cholesterolu metodą Salkowskiego Cholesterol, zawierający wiązanie podwójne, pod wpływem stęŝonego kwasu siarkowego, ulega odwodnieniu prowadząc do powstania związku o sprzęŝonych wiązaniach podwójnych kwasu disulfonowego bicholestadienu o barwie czerwonej. Postępowanie: Przygotuj trzy kuwety i postępuj zgodnie z poniŝszym schematem: odczynnik Numer probówki 1 2 chloroform 1.0 cm 3-2% roztwór cholesterolu w chloroformie cm 3 zawartość probówek wymieszać Obsewacje trzymając ukośnie probówkę dodawać kroplami stęŝony roztwór H 2 SO 4 (nie mieszać) 0.5 cm cm 3 Zakład Biochemii str. 18

19 Doświadczenie 9 Cel: Oznaczanie stęŝenia 17-ketosteroidów w surowicy krwi metodą Zimmermana-Reinchardta Reakcja Zimmermana-Reinchardta jest charakterystyczna dla 17-ketosteroidów, które posiadają grupę ketonową w pozycji C-17 i sąsiadującą z nią (w pozycji C-16) grupę metylenową. W środowisku zasadowym m-dinitrobenzen tworzy z 17-ketosteroidem związek kompleksowy o barwie czerwono-fioletowej. Intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do stęŝenia 17-ketosteroidów w badanej próbie. Oznaczanie stęŝenia 17-ketosteroidów w moczu dobowym pozwala na przybliŝoną ocenę czynności nadnerczy i gonad. Wydalane z moczem 17 -ketosteroidy są końcowymi produktami przemiany steroidów androgennych i niektórych kortykosteroidów. Ich stęŝenie u męŝczyzn jest wskaźnikiem wydzielania androgenów przez nadnercza i gonady. U kobiet 17- ketosteroidy zawarte w moczu są pochodzenia nadnerczowego, natomiast u męŝczyzn 2/3 jest pochodzenia nadnerczowego, a 1/3 gonadowego. Ilość wydalanych z moczem 17- ketosteroidów jest zaleŝna od wieku i płci. U męŝczyzn wynosi ona w moczu dobowym mg, natomiast u kobiet 5-13 mg. Postępowanie: Do dwóch suchych kuwet pomiarowych oznaczonych P (próba badana) i O (próba ślepa) dodaj kolejno: Odczynnik Oznaczenie kuwety roztwór DHA (dihydroizoandrosteron) w etanolu 0.2 cm 3 - etanol cm 3 roztwór m-dwunitrobenzenu w etanolu 0.2 cm cm 3 5 M roztwór KOH w etanolu 0.2 cm cm 3 wymieszać zawartość kuwet i pozostawić w ciemności przez 30 minut etanol 3.0 cm cm 3 Zmierzyć absorpcję próbki P względem próbki O przy długości fali λ=520 nm P O Obserwacje: Zakład Biochemii str. 19