Genomic Micro AX Blood Gravity 96-well Zestaw do izolacji DNA z krwi w formacie płytek na 96 studzienek dedykowany do pracy z pipetą wielokanałową lub automatem typu liquid handler. 960 izolacji Nr kat. 101-960 1
Spis Treści Skład zestawu 3 Wyposażenie i materiały nie wchodzące w skład zestawu 3 Uwagi 3 Bufor E 3 Protokół izolacji 3 Informacje dodatkowe 7 Skraplanie próbek 7 Test funkcjonalności buforu E 7 Zobojętnianie próbek DNA 7 Problemy przy elucji DNA 8 Gwarancja 8 Informacje bezpieczeństwa 8 2
Skład zestawu element ilość warunki przechowywania płytki oczyszczające P96 10 szt. 4 do 8 C płytki odbierające R96 30 szt. temp. pok. płytki do lizy L96 10 szt. temp. pok. płytki elucyjne E96 10 szt. temp. pok. samoprzylepna folia aluminiowa 10 szt. temp. pok. samoprzylepna folia plastikowa 10 szt. temp. pok. LSU bufor lizujący 2 x 250 ml temp. pok. K1 roztwór równoważący 250 ml temp. pok. W1G pierwszy roztwór płuczący 2 x 250 ml temp. pok. W2 drugi roztwór płuczący 2 x 250 ml temp. pok. Bufor zobojętniający N 2 x 1.5 ml temp. pok. bufor elucyjny E 10 x20 ml 4 do 8 C Proteinaza K 5 x 4.5 ml 4 do 8 C Roztwór T 5 x 100 µl temp. pok. Każdy z elementów zestawu można zamówić osobno. tel. +48586982194, orders@aabiot.com Wyposażenie i materiały nie wchodzące w skład zestawu materiał do izolacji DNA inkubator 50 C (zalecany jest inkubator komorowy) wirówka (opcjonalnie) Uwagi Bufor E Po użyciu buforu E należy zawsze szczelnie zakręcać pojemnik. Patrz również Test funkcjonalności buforu E w rozdziale "Informacje dodatkowe". Protokół izolacji 1. Dodać po 20-100 µl próbek krwi do płytki do lizy L96. 2. Dodać po 420 µl mieszaniny buforu LSU i Proteinazy K. Mieszaninę należy przygotować w proporcji 20:1, czyli 400 µl buforu LSU i 20 µl Proteinazy K na każdą próbkę. (!) Mieszaninę buforu LSU i Proteinazy K przygotować z 10-15 % nadmiarem, tak aby nie zabrakło jej w trakcie dodawania. Na jedną płytkę należy przygotować około 46 ml mieszaniny. 3
3. Całość wymieszać przez 10-krotne pipetowanie. 4. Zakleić płytkę folią aluminiową i inkubować w temp. 50 C przez 10 min. (!) Zaleca się prowadzenie inkubacji w inkubatorze komorowym aby weliminować skraplanie się wody na folii aluminiowej zamykającej płytkę. Inkubację można przeprowadzić również w urządzeniu Thermomixer firmy Eppendorf lub jego odpowiedniku, przy parametrach ciągłego mieszania przy 1400 RPM. 5. Podczas inkubacji przygotować płytki do oczyszczania. W tym celu należy: zdjąć pokrywkę z płytki odbierającej R96. Pokrywka zabezpiecza znajdujące się w studzienkach wkłady sorpcyjne zdjąć folie plastikowe z wierzchniej i spodniej części płytki oczyszczającej P96 umieścić płytkę oczyszczającą P96 na płytce odbierającej R96 tak aby końcówki kolumn trafiły w otwory w płytce odbierającej R96. Płytki należy złożyć delikatnie, bez dociskania. nanieść na płytkę P96 po 200 µl roztworu równoważącego K1 i odczekać 5 minut, aż przepłynie on do płytki odbierającej. (!) Dobrą praktyką jest nanoszenie roztworu K1 na ściankę kolumny tak aby uniknąć przypadkowego zablokowania przepływu kolumny przez bąbelek powietrza uwięziony pomiędzy złożem a naniesionym roztworem K1. Uwaga ta nie dotyczy to nanoszenia automatycznego 4
6. Po inkubacji płytki L96 należy ją odwirować przez 1 min przy 500 RPM. Patrz też "Skraplanie próbek" w rozdziale "Informacje dodatkowe" 7. Delikatnie zdjąć folię aluminiową z płytki L96 i wymieszać próbki przez 10-krotne pipetowanie. Dokładne wymieszanie jest kluczowe dla wydajności izolacji DNA. 8. Nanieść po 500 µl lizatów z płytki L96 na odpowiadające pozycje w uprzednio przygotowanej płytce P96. Poczekać, aż lizat przejdzie do płytki odbierającej pod wpływem sił kapilarnych. Zwykle trwa to do 10 min. Prędkość przepływu przez kolumnę uzależniona jest od zawartości DNA w próbce. Im więcej DNA, tym wolniejsza prędkość przepływu. Po 10 minutach sprawdzić czy lizaty przeszły do płytki odbierającej R96. 9. Przenieść płytkę P96 na nową płytkę R96 (po uprzednim zdjęciu z niej pokrywki). Krok ten może być wykonany przez gripper czyli głowicę przenoszącą w urządzeniu typu liquid handler. 10. Nanieść na płytkę P96 po 400 µl pierwszego roztworu płuczącego W1G. Odczekać 10 minut, aż roztwór przepłynie do płytki odbierającej. Po 10 minutach sprawdzić czy roztwór przeszedł do płytki odbierającej R96. 5
11. Przenieść płytkę P96 na nową płytkę R96 (po uprzednim zdjęciu z niej pokrywki). Krok ten może być wykonany przez gripper czyli głowicę przenoszącą w urządzeniu typu liquid handler. 12. Nanieść na płytkę P96 po 500 µl drugiego roztworu płuczącego W2. Odczekać 10 minut, aż roztwór przepłynie do płytki odbierającej. Po 10 minutach sprawdzić czy roztwór przeszedł do płytki odbierającej R96. 13. Nanieść na płytkę P96 po 25 µl roztworu elucyjnego E i odczekać 5 min. Krok ten ma na celu zmniejszenie całkowitej objętości eluatu. 14. Nanieść na płytkę elucyjną E96 po 5 µl buforu zobojętniającego N. (!) Krok ten można pominąć jeżeli próbki wyizolowanego DNA nie będą zamrażane. Patrz Zobojętnianie próbek DNA w rozdziale Informacje dodatkowe. 15. Przenieść płytkę oczyszczającą P96 na płytkę elucyjną E96. Krok ten może być wykonany przez gripper czyli głowicę przenoszącą w urządzeniu typu liquid handler. 6
16. Eluować DNA przez naniesienie na płytkę P96 po 150 µl buforu elucyjnego E. Odczekać 10 minut, aż bufor przepłynie do płytki elucyjnej. Po 10 minutach sprawdzić czy roztwór przeszedł do płytki odbierającej R96. (!) Jeżeli po tym czasie roztwór nie przeszedł do płytki odbierającej, to należy przejść do punktu "Problemy przy elucji DNA" w rozdziale "Informacje dodatkowe". 17. Usunąć płytkę P96 i zakleić płytkę E96, zawierającą próbki DNA, folią plastikową. Informacje dodatkowe Skraplanie próbek Po inkubacji płytki L96 zalecamy jej odwirowanie. Ma to na celu usunięcie wody, która podczas inkubacji mogła skroplić się na folii aluminiowej zabezpieczającej płytkę. Jeżeli inkubacja była prowadzona w inkubatorze komorowym to zjawisko skraplania nie zachodzi. W takim wypadku można pominąć wirowanie i po inkubacji przejść bezpośrednio do punkttu 7. protokołu. Test funkcjonalności buforu E Bufor E ma kluczowy wpływ na wydajność elucji DNA. Po jego użyciu należy zawsze szczelnie zakręcać pojemnik ponieważ składniki buforu E ulegają rozkładowi przy długotrwałym kontakcie z powietrzem. Bufor E należy przechowywać w temp. 4 do 8 C. Prawidłowe działanie buforu E można sprawdzić za pomocą roztworu T wchodzączego w skład zestawu. Kiedy przeprowadzić test funkcjonalności? Bufor E nie był używany przez 2 miesiące lub dłużej. Bufor E był przechowywany w temperaturze pokojowej przez 2 tygodnie lub dłużej. Pojemnik zawierający bufor E nie został szczelnie zamknięty po użyciu. Wykonanie testu funkcjonalności 1. Przenieść 20 µl buforu E do nowej probówki PCR. 2. Dodać 2 µl roztworu T. Całość wymieszać. 3. Poczekać 2 min. Porównać kolor mieszaniny ze zdjęciem poniżej przedstawiającym kolory referencyjne. bufor E działający poprawnie bufor E działający niepoprawnie Zobojętnianie próbek DNA Bufor elucyjny E jest silnie alkaiczny i po zamrożeniu może powodować degradację DNA. Jeżeli oczyszczone próbki DNA mają być przechowywane w formie zamrożonej to bezwzględnie należy je zobojętnić przed zamrożeniem buforem zobojętniającym N. Z naszej praktyki laboratoryjnej wynika, że najwygodniej jest dodać bufor N przed elucją DNA do 7
płytki elucyjnej (punkt 14. protokołu). W trakcie elucji, zawieszone w buforze elucyjnym DNA wymiesza się z buforem N i ulegnie natychmiastowej neutralizacji. Jeżeli bufor neutralizujący N nie został dodany w punkcie 14. protokołu to można dodać go po zakończonej izolacji - przed zamrożeniem próbek DNA. Problemy przy elucji DNA Brak elucji po 10 minutach oznacza bardzo dużą ilość DNA w próbce. W takim przypadku zaleca się odwirowanie złożonych płytek P96 i E96 przez 30 s - 1 min przy 2000 rpm. Do wirowania należy zastosować rotor z adaptorami do płytek mieszczący kanapkę złożoną z dwóch płytek o wysokości 5,7 cm (np. dla wirówki Sigma 3K-15, rotor 11240 z adaptorami 13145). Gwarancja Firma A&A Biotechnology udziela rocznej gwarancji na niniejszy zestaw. Firma nie gwarantuje poprawnego działania zestawu do izolacji DNA w wypadku: odstępstwa od dostarczonego wraz z zestawem protokołu braku zalecanego w niniejszym protokole wyposażenia i materiałów użycia innych odczynników niż zalecane lub które nie wchodzą w skład zestawu użycia przeterminowanych ub niewłaściwie przechowywanych odczynników oraz kolumn Informacje bezpieczeństwa Proteinaza K LSU - bufor lizujący K1 - roztwór równoważący W1G - pierwszy roztwór płuczący bufor E NIEBEZPIECZEŃSTWO UWAGA UWAGA UWAGA NIEBEZPIECZEŃSTWO H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. P261 Unikać wdychania pyłu. P342+P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego skontaktować się z Ośrodkiem Zatruć lub lekarzem. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H314 Powoduje poważne oparzenia skóry oraz uszkodzenia oczu. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu/ ochronę twarzy. P310 Natychmiast skontaktować się z Ośrodkiem Zatruć lub lekarzem. 8