INSTYTUT MATKI I DZIECKA ZAKŁAD GENETYKI MEDYCZNEJ Kierownik: prof. dr hab. n. med. Tadeusz Mazurczak ul. Kasprzaka 17a, 01-211 Warszawa Tel: (022) 632-96-57; Tel/fax: (022) 632 62 24 e-mail: genetyka@imid.med.pl TADEUSZ MAZURCZAK, AGNIESZKA SOBCZYŃSKA-TOMASZEWSKA, JERZY BAL, IDENTYFIKACJA MUTACJI I ZMIAN POLIMORFICZNYCH W GENIE CFTR. ZASADY DIAGNOSYTYKI MOLEKULARNEJ ATYPOWEJ POSTACI MUKOWISCYDOZY. MOLEKULARNA ANALIZA DEFEKTÓW W NIEPŁODNOŚCI MĘSKIEJ POWODOWANEJ OBUSTRONNA NIEDROŻNOŚCIĄ PRZEWODÓW NASIENNYCH (CBVAD). EKSPERTYZA NAUKOWA WYKONANA NA ZLECENIE MINISTERSTWA ZDROWIA Warszawa 2000 1
Spis Treści. 1. Wstęp 2. Obustronny brak przewodów nasiennych 3. Defekt w genie CFTR 4. Mukowiscydoza a CBAVD 5. Polimorfizm IV8S-T 6. Polimorfizm M470V 7. Wyniki analizy DNA 8. Interpretacja wyników analizy DNA 9. Propozycje postępowania diagnostycznego 10. CBAVD a poradnictwo genetyczne 11. Podsumowanie 12. Piśmiennictwo uzupełniające 13. Piśmiennictwo Zakładu Genetyki Medycznej z zakresu podłoża molekularnego CBAVD. 14. Aneks 14.1. Identyfikacja mutacji 14.2. Analiza polimorfizmu IV8S-T 14.3. Analiza polimorfizmu M470V 2
1. Wstęp Brak, niski poziom ekspresji lub nieprawidłowe funkcjonowanie białka CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance) są przyczyną szerokiego spektrum objawów klinicznych. Białko to, o masie cząsteczkowej ok. 170 kd, pełni w komórkach nabłonkowych rolę, aktywowanego przez c-amp, kanału chlorkowego. W swojej budowie zbliżone jest do innych białek transbłonowych zaliczanych do tzw. rodziny ABC. Kodowane jest w genie o tej samej nazwie. Gen CFTR zlokalizowany jest na chromosomie 7. Składa się z 27 eksonów i jest jednym z większych genów człowieka (250 kb). Do końca 2000 w genie CFTR zmapowano około 1000 różnych mutacji (por. http://www.genet.sickkids.on.ca). Większość z nich to mutacje punktowe względnie małe delecje lub wstawki w sekwencji genu. Dużą grupę defektów stanowią mutacje w składaniu RNA. Najczęstszą mutacją genu CFTR jest trójnukleotydowa delecja w eksonie 10 tzw. F508. Najlepiej poznaną choroba dziedziczną u podłoża, której leży defekt genu CFTR jest mukowiscydoza (cystic fibrosis, CF). Choroba ta jest jedną z najczęstszych chorób dziedzicznych rasy białej. Dziedziczy się jako cecha autosomalnie recesywna i występuje z częstością 1 na 2500 żywo urodzonych. Mukowiscydoza w postaci ciężkiej objawia się przewlekłymi zmianami obturacyjnymi i zakażeniami układu oddechowego, niewydolnością zewnątrzwydzielniczą trzustki. Oprócz mukowiscydozy mutacje w genie CFTR wykazano między innymi w obu- i jednostronnej wrodzonej niedrożności przewodów nasiennych, przewlekłej chorobie oskrzelowo-płucnej czy polipach nosa. W pełni uzasadnione wydaje się więc przypuszczenie, że szereg chorób o symptomatologii podobnej do mukowiscydozy można by, pod względem klasyfikacji molekularnej, zaliczyć do łagodnych form mukowiscydozy. 2. Obustronny brak przewodów nasiennych Obustronny brak przewodów nasiennych (ang. congenital bilateral absence of the vas deferens, CBAVD) jest rozpoznawany u 2% niepłodnych mężczyzn i około 6% pacjentów, u których stwierdzono azoospermię obstrukcyjną. CBAVD do niedawna traktowany był jako oddzielna jednostka nosologiczna. Ponieważ u większości, 70-80% pacjentów z CBAVD stwierdza się występowanie mutacji w 3
jednym lub w obu allelach genu CFTR, obecnie klasyfikowany jest jako, niepełnoobjawowa, dotycząca męskiego układu rozrodczego postać mukowiscydozy. W pozostałych przypadkach CBAVD jest wynikiem nieprawidłowości w obrębie układu moczowego, a nie zmian w genie CFTR. Na udział białka CFTR w procesach płodności męskiej szczególnie w procesie spermatogenezy i spermiogenenzy wskazują również badania w których wykazano wyższą, niż w populacji ogólnej, częstość mutacji u pacjentów z obniżonymi parametrami nasienia (oligo-, astheno-, terato- -zoospermia,) oraz z azoospermią nieobstrukcyjną. 3. Defekt w genie CFTR Mutacje w genie CFTR odpowiedzialne są za modyfikację lub brak funkcji białka CFTR i można je podzielić na dwie grupy: mutacje silne i mutacje łagodne. Mutacje silne odpowiedzialne są za brak produktu genu lub powodują, jak np. w przypadku mutacji F508, zmiany w jego właściwej lokalizacji w komórce, a przebieg choroby jest wówczas szczególnie ciężki. Mutacje łagodne to zazwyczaj mutacje zmieniające specyficzność działania białka jako kanału chlorkowego. W sytuacji gdy na genotyp pacjenta składają się: mutacja silna w jednym allelu i mutacja łagodna w drugim, zazwyczaj mutacja łagodna decyduje o fenotypie choroby. Obecnie wiadomo, że obok klasycznych mutacji genowych fenotyp określają również zmiany w genie CFTR o charakterze polimorficznym oraz coraz częściej znajdywane tzw. mutacje złożone, to jest występowanie w pojedynczym allelu (pozycja cis) dwóch różnych mutacji. Wydaje się, że ten typ mutacji jest odpowiedzialny za modyfikację białka CFTR i obniżenie jego aktywności. W chorobach o symptomatologii podobnej do mukowiscydozy z reguły na genotyp składają się mutacje łagodne, względnie mutacja silna i łagodna. Wykazano, że określone typy mutacji łagodnych występują w tych chorobach z częstością większą niż w populacji chorych na mukowiscydozę. 4. Mukowiscydoza a CBAVD Około 95% mężczyzn z CF jest niepłodna z powodu azoospermii, która jest wynikiem zarówno agenezji jak i atrezji najądrzy, nasieniowodów oraz kanalików nasiennych. Najczęstszą mutacją występującą w genie CFTR, zarówno w klasycznej 4
postaci mukowiscydozy jaki i postaciach atypowych, jest zlokalizowana w eksonie 10 silna mutacja F508. U większości mężczyzn z CBAVD wykazano obecność mutacji F508 w jednym zmutowanym allelu genu. W drugim allelu stwierdza się na ogół mutację łagodną. Często jest nią mutacja R117H zlokalizowana w obrębie eksonu 4 (10-20% wszystkich zmutowanych alleli występujących u mężczyzn chorych na CBAVD). Mutacja ta występuje również u chorych na mukowiscydozę, choć z dużo mniejszą częstością niż wśród mężczyzn z CBAVD. Dużą rolę w patogenezie CBAVD przypisuje się zmianom o charakterze polimorficznym. W tym przypadku zmiany te należy traktować jako mutacje łagodne. 5. Polimorfizm IV8S-T W puli mrna powstałego na matrycy genu CFTR, u pacjentów z CBAVD, istnieją produkty transkrypcji zbudowane z pełnej liczby eksonów jak i mrna pozbawione eksonu 9. Białko CFTR, które powstaje na matrycy mrna pozbawionego eksonu 9 nie przejawia funkcji kanału chlorkowego. Obecność lub brak eksonu 9 zależy z kolei od różnej liczby powtórzeń nukleotydów tymidynowych w pobliżu miejsca złącza intronu 8 z eksonem 9. Sekwencja polit w intronie 8 (locus IVS8) może składać się z 5, 7 lub 9 powtórzeń tymidynowych. Występowanie wariantu 9T warunkuje powstanie 95% prawidłowego mrna, 7T od 50 do 90% mrna normalnej długości, natomiast w przypadku warianty 5T powstaje jedynie 5% prawidłowego mrna. Spadek ilości prawidłowego mrna poniżej 8% może prowadzić do powstania CBAVD. Nie występują natomiast wtedy inne typowe dla mukowiscydozy objawy kliniczne, lub są one łagodne. Zakażenia dróg oddechowych, niski poziom enzymów trzustkowych, podwyższony poziom chlorków w pocie pojawiają się dopiero wtedy, gdy produkowane prawidłowe mrna będzie stanowiło mniej niż 3% ogółu produktów transkrypcji genu CFTR. U pacjentów z CBAVD wykazywano niekiedy pięciokrotnie wyższą, w porównaniu z kontrolą, częstość występowania allelu 5T. 6. Polimorfizm M470V Polimorfizm M470V, w eksonie 10, powoduje zamianę metioniny w pozycji 470 łańcucha peptydowego w walinę. Zamiana ta odbija się na procesie dojrzewania białka, które w przypadku obecności waliny jest szybsze niż w przypadku, gdy w 5
pozycji 470 znajduje się metionina. Konsekwencją szybszego dojrzewania jest mniejsza aktywność białka CFTR jako kanału chlorkowego. 7. Wyniki analizy DNA W ZGM badano grupę 43 pacjentów z CBAVD. Badając występowanie mutacji w genie CFTR u 27,9% badanych pacjentów z CBAVD zidentyfikowano mutacje w obu (4,6%) lub w jednym allelu (23,3%) genu CFTR. Najczęściej identyfikowaną mutacją była F508 (8 alleli), ponadto zidentyfikowano mutacje R117H (2 allele), R553X (2 allele), G542X (1 allel), oraz del21kb (1 allel). Włączona do diagnostyki molekularnej analiza wariantu 5T pozwoliła na pełną identyfikację genotypów odpowiedzialnych za CBAVD u 7 pacjentów ze zidentyfikowaną wcześniej mutacją w jednym allelu (16,3%). Wariant 5T wykryto również w jednym allelu u 8 pacjentów (18,6%) z niezidentyfikowanymi mutacjami. Częstość tego polimorfizmu jest trzykrotnie wyższa od stwierdzanej dla populacji ogólnej. Łącznie u 46,5% pacjentów wykryto mutacje lub zmiany polimorficzne co najmniej w jednym allelu genu CFTR. Wykonane badania nie potwierdziły korelacji pomiędzy typem allela w locus 470 a występowaniem CBAVD. Być może jest to spowodowane zbyt małą liczbą badanych osób, u których udało się w pełni określić genotyp CF. 8. Interpretacja wyników analizy DNA Otrzymane wyniki są podobne dla populacji, w których badanie ograniczyło się do analizy podobnego zestawu mutacji (tabela 1). Potwierdzono ogólna zasadę spotykaną w CBAVD, że mutacji silnej towarzyszy zawsze mutacja słaba warunkująca atypową formę mukowiscydozy. Oprócz mutacji F508 znaleziono mutację R117H. Mutacja R117H odpowiedzialna jest za redukcję poziomu ekspresji białka CFTR. Jeśli występuje ona w tym samym allelu genu CFTR równocześnie z wariantem 5T, a w drugim allelu jest obecna inna mutacja charakterystyczna dla mukowiscydozy to obserwowany fenotyp odpowiada objawom klinicznym mukowiscydozy. Jeśli natomiast mutacja R117H występuje razem z wariantem 7T obserwuje się wtedy dwustronną niedrożność przewodów nasiennych. Wśród pacjentów, u których zidentyfikowano mutację R117H w locus IVS8 stwierdzono genotyp 7T/9T. Ze względu na to, że badanie ograniczone było wyłącznie do osób z azoospermią i nie obejmowało rodziców probanda nie było możliwości określenia 6
czy allel 5T występuje w pozycji cis czy trans w stosunku do drugiego zmutowanego allelu W porównaniu z polską populacją ogólną wśród badanych pacjentów z azoospermią widoczna jest wyższa częstość allelu 5T. Jest ona jednak niższa niż prezentowana dla pacjentów innych populacji. Wydaje się, że przyczyny tych różnic należy poszukiwać w częstości występowania allela 5T w populacji polskiej. Zidentyfikowanie mutacji tylko w jednym allelu lub nie wykrycie żadnej z analizowanych zmian może być wynikiem wąskiego spektrum badanych mutacji (5 z 1000 zarejestrowanych w Consortium). Ponadto analizowano mutacje w obrębie sekwencji kodujących, pominięto w rutynowej diagnostyce sekwencje intronowe oraz promotorową. Tabela. 1 Wyniki analizy identyfikacji mutacji i zmian polimorficznych w genie CFTR w grupie pacjentów z CBAVD GENOTYP LICZBA WARIANT PACJENTÓW IVS8-T F508/R117H 2 7T/9T 2 5T/9T F508/? 4 7T/9T lub9t/9t G542X/? 1 5T/9T R553X/? 1 5T/7T 1 7T/9T Del2,3/? 1 5T/7T? /? 8 23 5T/7T lub 5T/9T 7T/7T lub 7T/9T 7
9. Propozycje postępowania diagnostycznego W przypadku analizy molekularnej CBAVD badanie diagnostyczne powinno przebiegać dwuetapowo: 1) identyfikacja jednej z mutacji występujących w tym zespole najczęściej ( F508, R553X, G542X, R117H oraz del21kb ) 2) identyfikacja wariantu polit w locus IVS8 oraz, jak wskazują ostatnie doniesienia, polimorfizmu (TG) m. Układ wariantów (TG) m T n w intronie 8 blisko miejsca łącza intron/ekson ma wpływ na dokładność procesu składania mrna. Ilość prawidłowego mrna- CFTR maleje gdy obecny jest wariant IVS8-5T wraz z większą ilością powtórzeń TG. W literaturze istnieją dane iż, kombinacja (TG) 13 T 5 w jednym allelu genu CFTR, przy obecność mutacji w drugim allelu, jest odpowiedzialna za kliniczny obraz łagodnej mukowiscydozy lub CBAVD. 10. CBAVD a poradnictwo genetyczne - Ponieważ u kobiet nie znane są przypadki niepłodności związanej z obecnością mutacji w allelach genu CFTR, CBAVD klasyfikuje się jako chorobę genetycznie uwarunkowaną, autosomalną recesywną ujawniająca się jedynie u płci męskiej. - U 70-80% mężczyzn z CBAVD identyfikuje się mutacje w jednym lub obu allelach genu CFTR.. Należy odróżniać formę CBAVD związaną z nieprawidłowościami rozwojowymi układu moczowego od CBAVD, która nie jest związana z CF. Dlatego też konieczne wydaje się wykonywanie badania ultrasonograficznego układu moczowego pacjentów z CBAVD. Pacjenci ci powinni mieć też wykonany dodatkowo test potowy: u większości pacjentów CBAVD związanym z CF stwierdza się, podobnie jak u pacjentów CF, wartości stężenia jonów w pocie graniczne lub powyżej normy. Wprowadzona do kliniki leczenia niepłodności metoda zapłodnienia pozaustrojowego polegająca na pobraniu plemników bezpośrednio z gonady (intracytoplasmic sperm injection, ICSI) wydaje się mieć istotne znaczenie dla mężczyzn z CBVAD. Pacjenci z brakiem plemników w nasieniu, ale z zachowaną prawidłową spermatogenezą w samych jądrach potwierdzoną biopsją gonad - azoospermia obstructiva mogą bowiem być kwalifikowani do ICSI. Wykrycie 8
mutacji w genie CFTR u mężczyzny z obustronnym brakiem przewodów nasiennych ma jednak określone konsekwencje prognostyczne dotyczące prokreacji. W przypadku wykrycia mutacji w genie CFTR u pacjenta CBAVD należy wykonać badanie molekularne u jego partnerki w celu wykluczenia nosicielstwa mutacji w genie CFTR (w populacji europejskiej nosicielem mutacji w tym genie jest co 25 osoba, niezależnie od płci). Nosicielstwo mutacji w genie CFTR u partnerki mężczyzny z potwierdzonym molekularnie rozpoznaniem klinicznym CBAVD (defekt w obu allelach genu CFTR) sprawia, że w przypadku ciąży płód z bardzo wysokim prawdopodobieństwem (50%) obciążony będzie mukowiscydozą, bądź jedną z jej atypowych postaci. Identyfikacja u pacjenta z CBAVD mutacji w obu allelach genu CFTR ma poważne konsekwencje nie tylko dla niego i jego partnerki, ale również dla rodzeństwa pacjenta. Jego rodzina jest bowiem rodziną ryzyka genetycznego i członkowie tej rodziny powinni mieć możliwość wykonania badania molekularnego wykluczające nosicielstwo mutacji w genie CFTR. 11. Podsumowanie Mukowiscydoza charakteryzuje się szerokim spektrum zmian patomorfologicznych i klinicznych. Wydaje się, że wiedza o strukturze genu CFTR i jego mutacjach w dużym stopniu ułatwia zrozumienie tej zmienności. Z jednej strony o fenotypie klinicznym decyduje różnorodność ponad 1000 mutacji, z drugiej, wzajemne relacje pomiędzy zmutowanymi allelami. Różnorodność fenotypów CF może być powodowana również powstałymi na skutek mutacji zmianami w nadrzędnej funkcji białka CFTR nad innymi kanałami chlorkowymi komórek nabłonkowych. Gromadzone są również dowody wskazujące, że wpływ na ekspresję genu CFTR mają geny z poza locus CFTR. Jeden z takich modyfikatorów zlokalizowano u człowieka w chromosomie 19. Fakt, że defekt genu CFTR może być powodowany występowaniem jednej z kilkuset różnych mutacji stwarza określone trudności diagnostyczne. Poszukiwanie mutacji występujących sporadycznie, w przypadku tak wielkiego genu jakim jest gen CFTR, musi być poprzedzone badaniem przesiewowym a następnie sekwencjonowaniem wybranych fragmentów DNA. W przypadku metod przesiewowych zastosowane mogą być technika PCR-DGGE (ang. denaturing gradient gel electrophoresis) lub PCR-SSCP (ang single stranded conformation 9
polymorphism). Pamiętać jednak należy, że nawet w przypadku bezpośredniego sekwencjonowania wszystkich eksonów i otaczających je sekwencji intronowych nie uzyska się gwarancji identyfikacji wszystkich defektów genu. Znanych jest bowiem szereg mutacji zlokalizowanych głęboko w intronach genu CFTR. W świetle uzyskanych wyników badań molekularnych pacjentów z CBAVD oraz danych z piśmiennictwa należy dążyć do tego, aby: - pacjenci z potwierdzonym molekularnie rozpoznaiem klinicznym CBAVD, nosiciele mutacji lub specyficznych zmian polimorficznych w genie CFTR mieli zapewnioną możliwość uzyskania kompetentnej porady genetycznej, - pacjenci z pozytywnymi wynikami badań molekularnych, decydujący się na korzystanie z metod prokreacji wspomaganej, powinni być świadomi konieczności wykonania badań molekularnych genu CFTR u ich współmałżonek (partnerek), - decyzje o poddaniu się leczeniu metodami prokreacji wspomaganej przez pary zidentyfikowanych nosicieli zmian molekularnych w genie CFTR powinny być podejmowane po uprzednim uzyskaniu porady genetycznej. 12. Piśmiennictwo uzupełniające Casals T., Bassas L., Ruiz-Romero J. et al. Extensive analysis of 40 infertile patients with congenital absence of the vas deferens: in 50% of cases only one CFTR allele could be detected. Hum. Genet. (1995) 95: 205-211 Chillon M., Casals T., Mercier B. et al. Mutations in the cystic fibrosis gene in patients with congenital absence of the vas deferens. N. Engl. J. Med. (1995) 332: 1475-1480 Costes B., Girodon E., Ghanem N. et al. Frequent occurrence of the CFTR intron 8 (TG) n 5T allele in men with congenital bilateral absence of the vas deferens. Eur. J. Hum. Genet. (1995) 3: 285-293 Cuppens H. i wsp. Polyvariant mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator genes. J.Clin. Invest. (1998) 101 (2): 487-496 Dohle G.R., H.J.Veeze, S.E. Overbeek et al. The complex relationships between cystic fibrosis and congenital bilateral absence of the vas deferens: clinical, electrophysiological and genetics data. Hum. Reproduction (1999) 14 (2):371-374 10
Estivill X, Bancells C, Ramos C, and Biomed CF Analysis Consortium. Geographic distribution and regional origin of 272 cystic fibrosis mutations in European populations. Hum Mut 10, 135 Lissens W, I. Liebaers. The genetics of male infertility in relation to cystic fibrosis. Baillieres Clinical Obstetrics & Gynaecology (1997) 11(4):797-817 Niksic M., Romano M., Buratti E. et al. Functional analysis of cis-acting elements regulating the alternative splicing of human CFTR exon 9. Hum. Molecular Genetics (1999) 8(13): 2339-2349 Osborne L.R. Congenital bilateral absence of the vas deferens. Cystic Fibrosis- Current Topics (1996) 3: 207-222 Wolski J.K., Kozioł K., Lewandowski P., Biarda B. ICSI-PESA jako alternatywa operacji rekonstrukcyjnych dróg wyprowadzających nasienie u pacjentów z azoospermią obstrukcyjną. Urol. Pol. (1996) 49(3A): 130-131 Van K.van der,. Messer L, Van H. van der et al. Cystic fibrosis mutation screening in healthy men with reduced sperm quality. Hum Reproduction (1996) 11(3):513-517 Zielenski J., Tsui L. Cystic fibrosis:genotypic and phenotypic variations. Annu. Rev. Genetics (1995) 29: 777-807 Zielenski J. Genetyczne determinanty zmienności fenotypowej mukowiscydozy. Medycyna Wieku Rozwojowego 1997, 1, 649 13. Piśmiennictwo Zakładu Genetyki Medycznej z zakresu podłoża molekularnego CBAVD. Bal J. Mukowiscydoza podstawy wprowadzenia somatycznej terapii genowej. Postępy Biochemii (1994) 40(2): 86-90 Bal J, Maciejko D. Mukowiscydoza - od genu do terapii. Kosmos, 1994, 43, 419. Witt M, Bal J, Maciejko D, Mazurczak T i wsp. Częstość występowania mutacji genu CFTR u chorych na mukowiscydozę w Polsce. Ped Pol 1997, 72, 665. Sobczyńska A, Wolski JK, Bal J Azoospermia obstrukcyjna a mutacje w genie CFTR genetyczne podstawy zespołu wrodzonej obustronnej niedroznosci nasieniowodów (CBAVD) Terapia 1997, 12, 25 Sobczyńska-Tomaszewska A, Wolski JK., Bal J. Identyfikacja mutacji i zmian polimorficznych w genie CFTR u pacjentów z azoospermia obstrukcyjną. Wiadomości Lekarskie 2000, 11-12, 644 11
14. Aneks Metody biologii molekularnej stosowane do identyfikacji mutacji i zmian polimoficznych w genie CFTR są standardowe. Genomowy DNA izolowano z leukocytów krwi obwodowej metoda kolejnego wysalania. 14.1. Identyfikacja mutacji U pacjentów z klinicznym rozpoznaniem CBAVD przeprowadza się analizę 5 najczęściej występujących mutacji: F508, R553X, G542X, R117H oraz del21kb (del2,3) ze względu na wysoką częstość występowania w Polsce wśród pacjentów z mukowiscydozą. 14.2. Identyfikacja alleli wariantu IV8S-T. Allele 5T, 7T i 9T locus IVS8 analizowano według zmodyfikwanej metody Chillon i wsp. [2] Produkt trawienia enzymem XmnI analizowano elektroforetycznie w 12% żelu poliakryloamidowym niedenaturującym przez 20 godzin przy natężeniu 7mA. Po elektroforezie fragmenty DNA uwidaczniano w świetle UV po wybarwieniu żelu w bromku etydyny. 14.3. Analiza polimorfizmu M470V Analizę DNA prowadzono powielając ekson 10. Warunki reakcji PCR były następujące: wstępna denaturacja 95 C/4min., denaturacja 95 C/30sek., przyłączanie starterów 50 C/30sek., wydłużanie 72 C/30sek., 30 cykli, końcowe wydłużanie 72 C/5min. Produkt wielkości 491 pz poddawano trawieniu enzymem restrykcyjnym HphI. W przypadku występowania allelu 470V obecne było miejsce restrykcyjne. Produkty trawienia analizowano elektroforetycznie w 3% żelu agarozowym. 12