mirna KIT Nr. kat. EM12 Wersja zestawu: 1.2016 Zestaw do izolacji mirna z tkanek zwierzęcych oraz linii komórkowych EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A.
mirna KIT www.dnagdansk.com 2
Nr. kat. EM12 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME mirna przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji mirna z możliwością jednoczesnej izolacji wilekocząsteczkowego RNA oraz DNA o wysokiej czystości z 1 10 mg tkanki (świeżej lub mrożonej) oraz 10 4 10 6 komórek linii komórkowych. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia wysokiej wydajności i czystości izolowanego mirna. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU LICZBA IZOLACJI 10 IZOLACJI 25 IZOLACJI 100 IZOLACJI 250 IZOLACJI 3 IZOLACJE (DEMO) Nr katalogowy EM12-010 EM12-025 EM12-100 EM12-250 EM12-D MiRLys Buffer * (mirna Lysis Buffer) MiRW Buffer *** (Wash Buffer) MiREB (Elution Buffer) DNA Binding Columns (kolumny wiążące DNA) Large RNA Binding Columns (kolumny wiążące wielkocząsteczkowe RNA) MiRNA Binding Columns (kolumny wiążące mirna) 4 ml 10 ml 40 ml 100 ml 1.2 ml 5.4 ml 13.5 ml 49.5 ml 126 ml 4.5 ml *** 3 ml 7,5 ml 2x 15 ml 5x 15 ml 0.9 ml 10 szt. 25 szt. 2x 50 szt. 5x 50 szt. 3 szt. 10 szt. 25 szt. 2x 50 szt. 5x 50 szt. 3 szt. 10 szt. 25 szt. 2x 50 szt. 5x 50 szt. 3 szt. * Bezpośrednio przed izolacją do MiRLys Buffer można dodać 100% ß-merkaptoetanolu do końcowego stężenia 1%. Trwałość MiRLys Buffer po dodaniu ß-merkaptoetanolu wynosi 4 tygodnie w temp. 2 8 C. Stąd też, w przypadku izolacji RNA prowadzonej partiami, należy przenieść odpowiednią do izolacji ilość MiRLys Buffer do osobnej butelki (wolnej od RNaz) i dodać ß-merkaptoetanol. Po dodaniu ß-merkaptoetanolu zalecane jest oznaczenie butelki. ** Przed pierwszym użyciem do MiRW Buffer należy dodać odpowiednią ilość 96 100% etanolu (informacja na etykietach oraz w tabeli na następnej stronie). Po dodaniu etanolu zalecane jest oznaczenie butelki. *** Uwaga: w zestawie DEMO (EM12 D) MiRW Buffer zawiera już etanol 3
mirna KIT LICZBA IZOLACJI 10 IZOLACJI 25 IZOLACJI 100 IZOLACJI 250 IZOLACJI 3 IZOLACJE (DEMO) Nr katalogowy EM12-010 EM12-025 EM12-100 EM12-250 EM12-D MiRW Buffer 5.4 ml 13.5 ml 49.5 ml 126 ml 4.5 ml Etanol 96-100% 12.6 ml 31.5 ml 115.5 ml 294 ml Całkowita objętość 18 ml 45 ml 165 ml 420 ml 4.5 ml Bufory MiRLys, MiREB należy przechowywać w temp. +4 C. Pozostałe składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15-25 C). Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność minimum przez okres 12 miesięcy. III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT etanol 96 100% cz.d.a. jałowe probówki wirownicze typu Eendorf (1,5 2 ml) wolne od RNaz pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet (wolne od RNaz) rękawiczki jednorazowe mikrowirówka z rotorem na probówki o obj. 1,5 2 ml (> 11 tys. x g) worteks statywy mrożeniowe (temp. <7 C) na probówki 1,5 2 ml lub kuwety umożliwiające trzymanie probówek w warunkachchłodniczych Opcjonalnie: 100% ß-merkaptoetanol (ß-ME) nożyczki, skalpel probówki z kulkami ceramicznymi wolne od RNaz (nr kat. HPLM100) homogenizator tkankowy na probówki 2 ml homogenizator nożowy termomikser o orbicie ruchu min. 2 mm moździerz z gładkim wylewem (50 75 ml) z dopasowanym pistonem ciekły azot worteks z przystawką na probówki 2 ml wirówka na falkony 10 15 ml (linie komórkowe) woda utleniona 3% lub roztwór podchlorynu sodu <0,5% www.dnagdansk.com 4
Nr. kat. EM12 IV. ZASADA IZOLACJI Zestaw EXTRACTME mirna opiera się na zdolności złóż krzemionkowych do wiązania kwasów nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych. Procedura oczyszczania mirna składa się z 7 etapów i jest przeprowadzana z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych. Pierwszym etapem jest homogenizacja tkanki, mająca na celu dezintegrację połączeń międzykomórkowych (tkanki nabłonkowe) oraz fragmentację białek wysokocząsteczkowych (tkanka mięśniowa, łączna). Następnie homogenat poddawany jest lizie chemicznej z wykorzystaniem rodanku guanidyny oraz detergentów. Obecne w materiale tkankowym RNazy inaktywowane są poprzez zastosowanie wysokiego stężenia rodanku guanidyny oraz opcjonalnie 1% ß-merkaptoetanolu. Kolejnym etapem jest usunięcie DNA poprzez wiązanie na pierwszej minikolumnie. Następnie selektywnie immobilizowane zostaje wielkocząsteczkowe RNA na kolumnie wiążącej. W następnym kroku następuje wiązanie mirna do przeznaczonej specjalnie do tego celu minikolumny. Trzyetapowe przemywanie mirna związanego do złoża minikolumny ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone mirna eluowane jest ze złoża buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą wolną od RNaz (ph 7,0 9,0) i jest gotowe do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej, takich jak RT PCR, RT qpcr i Northern blotting. 5
mirna KIT V. KONTROLA JAKOŚCI Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME mirna testowana jest według opracowanych procedur. Wydajność oraz efektywność izolacji i oczyszczania RNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi, oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego mirna sprawdzana jest w reakcji qpcr poprzedzonej reakcją odwrotnej transkrypcji. VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY tkanka świeża lub mrożona (najlepiej w temp. -80 C): 1 10 mg, tkanka przechowywana w buforach inaktywujących RNazy: 1 10 mg linie komórkowe: 10 4 10 6 komórek WYDAJNOŚĆ IZOLACJI RNA Przykładowe wydajności izolacji RNA ze świeżego materiału biologicznego podane są w sekcji XIII. POJEMNOŚĆ ZŁOŻA ok. 90 μg RNA CZAS IZOLACJI 25-30 min (po etapie lizy lub w przypadku braku homogenizacji dla linii komórkowych) 35-70 min w przypadku homogenizacji w ciekłym azocie 35-50 min w przypadku homogenizacji mechanicznej (kulki ceramiczne) CZYSTOŚĆ RNA A 260 /A 280 = 1.9 2.1 www.dnagdansk.com 6
Nr. kat. EM12 VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Tkanka jest biologicznym materiałem niebezpiecznym ze względu na potencjalną zawartość mikroorganizmów patogennych lub substancji zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Przy pracy z materiałem tkankowym należy stosować się do wymogów dotyczących biologicznych materiałów niebezpiecznych. Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze II klasy bezpieczeństwa biologicznego lub przy palniku laboratoryjnym, używać ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych. Zalecane jest używanie jałowych końcówek do pipet z filtrami wolnymi od RNaz. Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem. W przypadku rozlania cieczy zawierającej krew, zanieczyszczoną powierzchnię zmyć najpierw wodą z detergentem, a następnie 1% roztworem podchlorynu sodu. Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladów RNA lub zanieczyszczeń pomiędzy kolejnymi minikolumnami. VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI Ilość materiału wyjściowego Jeśli istnieje konieczność izolacji całkowitego RNA z większej ilości materiału (>10 mg, >10 6 komórek), należy tak zwiększyć ilość buforu RLys oraz rozdzielić na większą ilość minikolumn, aby nie przekroczyć maksymalnej wielkości 10 mg tkanki (lub 10 6 komórek) na minikolumnę. Przekroczenie tej wartości może spowodować zatkanie się kolumny lub/i uzyskanie zanieczyszczonego mirna. Pobieranie i przechowywanie prób do izolacji RNA Kluczowym elementem dobrej jakościowo i ilościowo izolacji RNA jest rygorystyczna procedura pobierania i przechowywania materiału biologicznego. Materiał po uzyskaniu (pobraniu) należy utrwalić poprzez mrożenie (-80 C lub w ciekłym azocie) lub przechowywać w buforach chroniących RNA (np. RNAlater, Ambion) w temp. -20 C. W przypadku większości tkanek granicznym momentem jest 30 minuta od momentu pobrania, natomiast w przypadku tkanek bogatych w RNazy (trzustka, wątroba), tkankę należy natychmiast utrwalić. Najlepsze efekty izolacji mirna z linii komórkowych uzyskuje się ze świeżych komórek. W przypadku późniejszej pracy, po odwirowaniu należy odrzucić pożywkę znad osadu komórek i mrozić w temp. -80 C lub w ciekłym azocie (LN 2 ). 7
mirna KIT Eliminacja RNaz RNazy są bardzo aktywnymi enzymami, niewymagającymi kofaktorów do aktywacji oraz odpornymi na autoklawowanie w temp. 121 C przez 15 min. W celu wykluczenia możliwości degradacji RNA przez RNazy należy zastosować się do następujących zaleceń: a. Zawsze stosować jednorazowe rękawiczki lateksowe/winylowe/nitrylowe podczas pracy. Nie należy dotykać innych rzeczy niż bezpośrednio związanych z izolacją RNA. b. Próby na każdym etapie izolacji (w miarę możliwości również wirówka) powinny zachować temp. 2 8 C. Najlepiej korzystać ze statywów mrożeniowych, ze względu na kontaminację lodu RNazami. Wyizolowane RNA należy obowiązkowo niezwłocznie wstawić do statywu mrożeniowego. c. Plastiki zużywalne (tipsy, probówki) należy stosować wolne od RNaz, lub też autoklawować w temp. 134 C przez 18 20 min. d. Plastiki niezużywalne, szkło, porcelana: moczyć przez noc w roztworze 0,1 N NaOH/0,1% woda DEPC (lub woda wolna od RNaz), a następnie płukać wodą DEPC lub wodą wolną od RNaz. Szkło i porcelanę (moździerze) w miarę możliwości prażyć w temp. 150 240 C przez 2 4 h, następnie schłodzić do temp. pokojowej. e. Za pomocą 3% H2O2 lub <0,5% podchlorynu sodu (lub komercyjnie dostępnych płynów inaktywujących RNazy) należy przetrzeć: blaty, pipety, wirówkę (rotor osobno), statywy do probówek. Przed traktowaniem płynami należy wykonać próbę, czy nie następuje reakcja z materiałami odkażanymi. Elucja RNA ze złoża Optymalną objętość buforu elucyjnego MiREB (Elution Buffer) należy dobrać w zależności od ilości materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego poziomu stężenia RNA w eluacie. Zaleca się stosowanie 30 50 μl MiREB. Jeśli pożądane jest otrzymanie RNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć nawet do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że obniży to wydajność odzysku RNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża. www.dnagdansk.com 8
Nr. kat. EM12 Zanieczyszczenie DNA Każdy materiał biologiczny podlegający izolacji RNA zawiera DNA. Żadna z obecnie stosowanych metod izolacji RNA nie gwarantuje usunięcia 100% DNA bez zastosowania metod enzymatycznych (DNaza) po izolacji RNA. Nawet śladowe zanieczyszczenie DNA (rzędu kilku kopii gdna na próbę) może spowodować uzyskanie fałszywie pozytywnych wyników w reakcji qpcr (po etapie odwrotnej transkrypcji). W celu wyeliminowania tego zagrożenia, proponujemy zastosowanie komercyjnie dostępnych metod enzymatycznego usuwania DNA po izolacji RNA (np. termolabilna dsdnaza, nr kat. EN32). W przypadku Eukaryota zalecamy projektowanie układów qpcr niewrażliwych na zanieczyszczenia DNA (startery obejmujące sąsiednie egzony lub z intronem >1,5 kpz). Pienienie buforu MiRLys Ze względu na zawartość detergentów niejonowych w buforze lizującym może dojść do pienienia, co jest zjawiskiem normalnym dla tego typu buforów podczas etapu homogenizacji, po worteksowaniu lub intensywnym pipetowaniu. W celu usunięcia piany, probówkę należy wirować 1 min przy 10 tys. rpm (11 tys. x g). IX. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy dobrze wymieszać. Nie należy mieszać zbyt intensywnie MiRLys Buffer. 2. Należy upewnić się czy do MiRW Buffer został dodany etanol. Jeśli nie, należy dodać odpowiednią ilość 96 100% etanolu (ilości podane są na etykietach oraz w tabeli w sekcji II). 3. W przypadku wytrącenia osadu w buforach MiRLys lub MiRW, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 37 C (MiRW Buffer) lub temp. 50 C (MiRLys Buffer) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 4. Przygotować statyw mrożeniowy, odpowiednie plastiki wolne od RNaz oraz pozostałe elementy stanowiska do pracy z RNA. 5. Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem mikrowirówki Eendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach rpm odnoszą się do tej mikrowirówki. 9
mirna KIT X. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI A. TKANKA STAŁA ŚWIEŻA LUB MROŻONA Ilość: 1 10 mg Materiał: tkanki zwierzęce, tkanki ludzkie Procedura ogólna niezależna od stosowanej metody homogenizacji Tkankę podzielić za pomocą pęsety i nożyczek lub skalpela na jak najmniejsze fragmenty. W zależności od stopnia fragmentacji oraz rodzaju tkanki, przejść do wyboru metod homogenizacji (poniżej) lub przejść do pkt. 1 Protokołu izolacji (sekcja XI). Ciekły azot (LN 2 ) 1. Zamrożoną w LN 2 tkankę umieścić w jałowym, uprzednio schłodzonym moździerzu i za pomocą schłodzonego pistonu delikatnie lecz zdecydowanie rozbić na małe fragmenty, następnie rozetrzeć. 2. Otrzymany proszek przenieść do probówki (2 ml) zawierającej 400 μl MiRLys Buffer i przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI). Jeśli po roztarciu powstaje cienka kleista warstwa zamiast proszku, zhomogenizowaną tkankę zawiesić dodając do moździerza 400 μl MiRLys Buffer i poprzez staranne pipetowanie zebrać całość i przenieść do probówki (2 ml), nie zapominając o starannym przemyciu pistonu z resztek tkanki. Homogenizacja z użyciem homogenizatora nożowego 1. Umieścić tkankę w probówce (2 ml), dodać 100 μl MiRLys Buffer, homogenizować ostrożnie sterylną końcówką homogenizatora. 2. Po uzyskaniu homogenatu, opłukać końcówkę nożową za pomocą 300 μl MiRLys Buffer, a następnie przenieść całość do nowej probówki (2 ml). 3. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI). www.dnagdansk.com 10
Nr. kat. EM12 Homogenizacja z wykorzystaniem kulek ceramicznych 1. Do probówki zawierającej kulki ceramiczne dodać 100 μl MiRLys Buffer i przenieść pociętą tkankę. 2. Następnie umieścić w homogenizatorze tkankowym i rozdrabniać przez 30 s przy 5 6 tys. rpm. Procedurę powtórzyć w razie konieczności. W przypadku braku możliwości oceny stopnia rozdrobnienia tkanki spowodowanej pienieniem buforu, probówkę zwirować przez 2 min przy 10 tys. rpm (11 tys. x g). W przypadku braku homogenizatora próbkę można rozdrobnić korzystając z odpowiedniej przystawki do worteksu; minimum 5 min przy maksymalnych obrotach. 3. Dodać 300 μl MiRLys Buffer i wymieszać przez pipetowanie. 4. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI). B. LINIE KOMÓRKOWE Ilość: 10 4 10 6 komórek Materiał: świeże lub mrożone (-80 C lub -196 C) linie komórek adherentnych lub zawiesinowych. 1. Zamrożone komórki rozmrozić w temp. 37 C lub RT. Komórki w pożywce lub PBS zwirować w falkonie (15 ml) lub probówce (2 ml) przez 5 min przy 5 tys. rpm (ok. 3 tys. x g). Odrzucić supernatant. W przypadku, gdy nie tworzy się zwarty osad komórkowy należy komórki dwukrotnie przemyć przy pomocy 1 ml zimnego PBS. 2. Dodać 400 μl MiRLys Buffer. Wymieszać przez intensywne worteksowanie 30 s, a następnie pipetowanie. Dla części komórek, szczególnie tworzących syncytia (mioblasty) i połączenia zwarte (kom. nabłonkowe) oraz komórek w dużej ilości (~10 7 ) mogą wystąpić trudności z rozpuszczeniem osadu w MiRLys Buffer. Należy wtedy rozpipetować ostrożnie osad z wykorzystaniem pipety z końcówką 1000 ml lub jałową strzykawką. Nie stosować w tym celu końcówek z filtrem do pipet. 3. Całość przenieść do nowej probówki (2 ml). 4. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI). 11
mirna KIT XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI 1. Rozdrobniony materiał biologiczny umieścić w probówce (2ml). Dodać 400 μl MiRLys Buffer. Worteksować przez 60 s. 2. Wirować przez 2 min przy 15-21 tys. x g. 3. Supernatant przenieść do minikolumny wiążącej DNA umieszczonej w probówce odbierającej (2 ml) i wirować 2 min przy 15-21 tys. x g. Zachować przesącz. Minikolumnę zachować w celu dalszego oczyszczania DNA. W przypadku pozostania niezwirowanego płynu w górnej części minikolumny, należy powtórzyć wirowanie przez 2 min przy prędkości 14 tys. rpm ( 21 tys. x g). Jeśli to nie pomaga, prawdopodobnie materiał nie uległ poprawnej homogenizacji lub trawienie było zbyt krótkie lub wyjściowego materiału tkankowego było zbyt dużo. 4. Przesącz po kolumnie ( 400 μl) przenieść do wolnej od RNaz probówki typu Eendorf o pojemności 1,5 ml. 5. Dodać 0,5 objętości 96-100% etanolu i wymieszać przez pipetowanie. Na przykład do 400 µl supernatantu należy dodać 200 µl etanolu. 6. Roztwór przenieść do minikolumny wiążącej wielkocząsteczkowe RNA umieszczonej w probówce odbierającej (2 ml) i wirować 2 min przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. x g). Zachować przesącz. Minikolumnę zachować w celu dalszego oczyszczania wielkocząsteczkowego RNA. Minikolumnę ze związanym wielkocząsteczkowym RNA należy przechowywać nie dłużej niż 15 minut w temperaturze 4-8 C. 7. Przesącz przenieść do wolnej od RNaz probówki typu Eendorf o pojemności 1,5-2 ml. 8. Do przesączu dodać 1 objętość 96-100% etanolu i wymieszać przez pipetowanie. Na przykład do 600 µl przesączu należy dodać 600 µl etanolu. 9. Przenieść 650 µl roztworu do minikolumny wiążącej mirna umieszczonej w probówce odbierającej (2 ml) i wirować 2 min przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. x g). Wylać przesącz z probówki odbierającej i ponownie umieścić w niej kolumnę. www.dnagdansk.com 12
Nr. kat. EM12 10. Przenieść pozostałą część roztworu do minikolumny wiążącej mirna umieszczonej w probówce odbierającej (2 ml) i wirować 2 min przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. x g). Wylać przesącz. 11. Przygotować minikolumny ze związanym DNA, wielkocząsteczkowym RNA i mirna. 12. Do przygotowanych minikolumn dodać 500 μl MiRW Buffer i wirować 1 min przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. x g). Wylać przesącz z probówek odbierających i ponownie umieścić w nich minikolumny. 13. Ponownie dodać 500 μl MiRW Buffer do minikolumn i wirować 1 min przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. x g). Wylać przesącz z probówek odbierającej i ponownie umieścić w nich minikolumny. 14. Ponownie dodać 500 μl MiRW Buffer do minikolumn i wirować 1 min przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. x g). Wylać przesącz z probówek odbierającej i ponownie umieścić w nich minikolumny. 15. Wirować 3 min przy 12 tys. rpm (15 tys. x g). 16. Ostrożnie wyjąć suche minikolumny z probówek odbierających i umieścić je w jałowych, wolnych od RNAaz probówkach 1,5 ml typu Eendorf. 17. Nanieść 30-100 μl buforu elucyjnego MiREB centralnie na złoże w minikolumnie. Możliwe jest zmniejszenie objętości buforu elucyjnego. Więcej wskazówek na temat elucji znajduje się w sekcji VIII. Szczególne zalecenia i uwagi. 18. Inkubować minikolumny z buforem przez 2 min. 19. Wirować 2 min przy 8-10 tys. rpm (7-11 tys. x g). 20. Minikolumny usunąć, a wyizolowane kwasy nukleinowe umieścić w statywie mrożeniowym. Wyizolowane RNA i DNA przechowywać w temp. -80 C lub -20 C do czasu dalszych analiz. 13
mirna KIT XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE Problem Prawdopodobna przyczyna Rozwiązanie Niska wydajność izolacji mirna Niskie stężenie RNA Zatkana minikolumna Zdegradowane RNA Tkanka źle przechowywana lub utrwalona degradacja RNA. Zbyt mała ilość materiału wyjściowego. Tkanka nieprawidłowo rozdrobniona. Zatkana minikolumna. Obecność RNaz. Zbyt duża objętość buforu elucyjnego. Materiał niewystarczająco rozdrobniony. Przeładowanie minikolumny Tkanka zbyt stara. Tkanka kilkukrotnie rozmrażana. RNA fizycznie zdegradowane/ zbyt gwałtowna homogenizacja. Przechowywać tkankę w -80 C nie dłużej niż rok. W przypadku stosowania buforu utrwalającego do przechowywania tkanek, upewnić się, że jest on dobrej jakości, a warunki przechowywania odpowiednie. Pipette the supernatant carefully, without disturbing the tissue or cell pellet. Upewnić się, że tkanka została odpowiednio zhomogenizowana w MiRLys Buffer. Tkankę należy uprzednio pokroić na jak najmniejsze fragmenty, a następnie dobrać odpowiednią metodę homogenizacji. Patrz zatkana minikolumna. Patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi, Eliminacja RNaz. Zmniejszyć objętość buforu elucyjnego MiREB do 20-50 μl. Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji. Nie przekraczać zalecanej ilości materiału wyjściowego. Używać tkanek świeżych lub odpowiednio utrwalonych. Unikać cykli zamrażanie-rozmrażanie. Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji. Kontaminacja DNA Obecność RNaz. Zbyt duża ilość materiału wyjściowego. Niewłaściwa homogenizacja. Patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi, Eliminacja RNaz. Zmniejszyć ilość materiału wyjściowego. Opcjonalne trawienie DNazą po izolacji RNA. Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji. Opcjonalne trawienie DNazą po izolacji RNA. www.dnagdansk.com 14
Nr. kat. EM12 XIII. PRZYKŁADOWE WYDAJNOŚCI IZOLACJI RNA ZE ŚWIEŻEGO MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO MATERIAŁ Masa/ilość V elucji Stężenie RNA A 260 /A 280 Ilość RNA Linie komórkowe HCT116 10 4 100 μl 328.3 ng/μl 2.03 32.83 μg Nerka 10 mg 100 μl 319.3 ng/μl 1.88 31.93 μg Jelito grube 10 mg 100 μl 168.8 ng/μl 2.14 16.88 μg XIV. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM MiRLys Buffer Niebezpieczeństwo H302+H312+H332, H315, P273, P30+P352, P280, P305+P351+P338, P304+P340 MiRW Buffer Niebezpieczeństwo H225, H319, H336 P210, P280, P305+P351+P338 H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. H302+H312+H332 Działa szkodliwie po połknięciu, w kontakcie ze skórą i po wdychaniu. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P273 Unikać uwolnienia do środowiska. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu /ochronę twarzy. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. 15
www.dnagdansk.com