Ćwiczenie 1 Izolacja genomowego DNA różnymi metodami Praca laboratoryjna z użyciem materiału biologicznego wymaga szczególnej dbałości o prawidłowe wykonanie każdego etapu pracy, dlatego też tylko zastosowanie odpowiednich warunków pobierania próbek, izolacji i przechowywania DNA zapewnia efektywne uzyskanie pożądanego produktu. Szczególnie istotnym etapem pracy jest proces izolacji DNA. Podstawą do analiz materiału genetycznego jest uzyskanie czystego (pozbawionego białek i inhibitorów enzymów wykorzystywanych w następnych etapach pracy), wielkokocząsteczkowego (nie zdegradowanego) preparatu DNA. Jakość otrzymanego izolatu DNA determinuje powodzenie dalszych badań molekularnych. W warunkach laboratoryjnych izolację DNA, niezależnie od wybranej przez nas metody, powinno się przeprowadzać z zastosowaniem jałowych materiałów oraz odczynników, w taki sposób, aby uniknąć zanieczyszczenia preparatu obcym materiałem genetycznym (musimy mieć pewność, że wynik badania dotyczy materiału badanego, a nie przypadkowych zanieczyszczeń np. tkankami lub wydzielinami laboranta). Do badań molekularnych wykorzystuje się najczęściej DNA wyizolowane z około 200 µl krwi obwodowej, przy czym standardowo pobiera się co najmniej 1 ml, aby mieć możliwość ewentualnego powtórzenia izolacji lub uzyskania większej ilości materiału do dalszych badań. Coraz większą popularnością cieszą się metody izolacji DNA wykorzystujące wymazy. DNA wyizolowane metodą wymazu z wewnętrznej powierzchni policzka stosuje się zazwyczaj w sytuacjach, gdy nie ma możliwości pobrania krwi. Trzeba mieć na uwadze, że preparat uzyskany z wymazu zawiera, oprócz DNA pacjenta, także materiał genetyczny bakterii i innych mikroorganizmów zamieszkujących jego jamę ustną. Do badań diagnostycznych krew pobierana jest do probówki z EDTA (EDTA - wersenian - zapobiega pozaustrojowemu krzepnięciu krwi poprzez wiązanie jonów wapnia oraz hamuje aktywność deoksyrybonukleaz). Wykorzystuje się również inne antykoagulanty, jak na przykład heparyna, jednakże ich obecność może mieć znaczący wpływ na kolejne etapy pracy z analizowaną próbką (mogą częściowo przechodzić do izolatu, są często inhibitorami reakcji PCR). Metodyki izolacji DNA zalecają rozpoczęcie preparatyki niezwłocznie po pobraniu próbki. W przypadku pracy z krwią dopuszcza się przechowywanie prób w 4 C przez kilka dni. Jeśli w ciągu 48h od pobrania materiału nie zostanie on poddany izolacji, zaleca się go zamrozić w buforze do lizy i przechowywać w -20 C. Można go także utrwalić w alkoholu. Krew jako materiał do izolacji DNA nie jest stabilna w temperaturze 20 C, w razie dłuższego przechowywania (powyżej kilku miesięcy) należy ją głęboko zamrozić (-80 C). Wyizolowane DNA można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka godzin, w temperaturze 4 C kilka miesięcy, a w temperaturze -80 C nieograniczony czas. Należy jednak pamiętać, że częste rozmrażanie i zamrażanie powoduje degradację DNA.
Transportowanie próbek: wymaga prawidłowego zabezpieczenia ich przed zniszczeniem i zmianami warunków przewożenia, szczelnego zamknięcia probówek oraz starannego oznaczenia prób. Uwaga: Krew jest materiałem potencjalnie zakaźnym. Podczas wszystkich etapów pracy (także z uzyskanymi izolatami DNA) obowiązuje odzież ochronna i jednorazowe rękawice ochronne. Pod żadnym pozorem nie należy dopuścić do przeniesienia krwi poza probówki, w których wykonywana jest analiza, nie należy dotykać rękawicami ciała, żywności, telefonów komórkowych, wcierać krwi w błony śluzowe itp. Podczas nabierania krwi pipetą automatyczną należy bardzo powoli i w sposób kontrolowany zwalniać tłok, aby nie zassać płynu do wnętrza pipety. Izolacja DNA Izolacja DNA może być przeprowadzona na bardzo wiele sposobów, a metody stosowane w laboratoriach prawie zawsze są kompilacją kilku metod. Techniki izolacji DNA polegają na rozbiciu komórek i oddzieleniu DNA od innych struktur komórkowych, cząsteczek RNA i białek związanych z DNA. Wybór odpowiedniej metody izolacji DNA zależy od: a) pochodzenia materiału, z którego przeprowadzamy izolację; b) rodzaju materiału (tkanka, organ, hodowla komórkowa); c) rodzaju izolowanego DNA (DNA genomowe, mitochondrialne, plazmidowe); d) przeznaczenia wyizolowanego DNA (PCR, klonowanie). Izolacja całkowitego DNA składa się zasadniczo z kilku następujących po sobie etapów: 1) pobranie próbki materiału biologicznego, 2) homogenizacja pobranego materiału (w przypadku tkanek) i/lub liza błon komórkowych (w celu uwolnienia DNA), 3) denaturacja białek, 4) oczyszczanie DNA z resztek lizatu, 5) rozpuszczanie DNA, 6) ocena jakościowa i ilościowa uzyskanego izolatu DNA. Wybór odpowiedniej metody homogenizacji materiału biologicznego zależy od pochodzenia materiału: - miękkie tkanki zwierzęce: homogenizacja, - zawiesiny komórkowe i płyny biologiczne: sonifikacja lub tylko liza chemiczna, - komórki roślinne, bakteryjne: rozcieranie mechaniczne, - komórki bakteryjne, drożdże: liza enzymatyczna, - komórki pochodzące z hodowli komórkowych: liza detergentami; Metody stosowane do lizy komórek można podzielić na: a) fizyczne (zamrażanie, rozmrażanie; szok osmotyczny), b) mechaniczne (rozcieranie perełkami szklanymi, tlenkami glinu), c) chemiczne (liza detergentami, np. SDS, CTAB [Cetyltrimethylammonium bromide], DTAB [Dodecyltrimethylammonium bromide], Tryton-X-100).
Kolejny etap izolacji to usuwanie frakcji komórkowych poprzez odwirowanie i oddzielenie DNA od związanych z nim białek za pomocą: - nasyconego buforu roztworu fenolu; - chloroform z alkoholem izoamylowym; - chloroform z oktanolem; - mieszanina fenolu z chloroformem i alkoholem izoamylowym (25:24:1). Denaturację białek przeprowadza się przy pomocy detergentów (np. SDS) i soli (np. NaCl) powodujących denaturację białek i dysocjację kompleksów DNA - białka. Białka można także usunąć przez trawienie ich proteinazami, zwykle proteinazą K. Ze względu na obecność DNaz izolację DNA przeprowadza się w obecności czynników chelatujących (EDTA, CDTA). Odbiałczone DNA wytrącane jest za pomocą etanolu lub izopropanolu w obecności soli octanu sodu, potasu, amonu lub NaCl. Uwaga: Izopropanol (propan-2-ol) powoduje szybsze i bardziej wydajne wytrącanie DNA, jednak etanol jest znacznie tańszy. Wyizolowane DNA jest następnie zawieszane w wodzie lub w buforze TE (10 mm Tris:HCl ph 7.8-8.0, 1 mm EDTA). W lekko zasadowym buforze TE DNA jest bardziej stabilne i może być przechowywane w lodówce, ale bufor może nieznacznie zmieniać środowisko reakcji PCR. Przy rozpuszczaniu w wodzie destylowanej, przy dłuższym przechowywaniu zaleca się zamrożenie izolatu w 20 C. Wyróżnia się kilka różnych metod izolacji DNA, spośród których najpopularniejsze to: 1) izolacja DNA z zastosowaniem ekstrakcji fenolem i chloroformem (metoda organiczna), 2) izolacja DNA z odsalaniem białek, 3) izolacja DNA przez związanie DNA z nośnikiem (złoża krzemionkowe), 4) izolacja DNA metodą separacji magnetycznej. Etapami wspólnymi dla większości stosowanych metod są: - wstępne przygotowanie próbki, obejmujące oczyszczenie, rozdrobnienie i zawieszenie materiału w buforze stabilizującym, - liza komórek. 1) Izolacja DNA z zastosowaniem ekstrakcji fenolem i chloroformem Ponieważ DNA jest naładowaną ujemnie makrocząsteczką rozpuszczalną w roztworach wodnych, nie wykazującą powinowactwa do hydrofobowych rozpuszczalników organicznych, można je poddać ekstrakcji z użyciem mieszaniny fenolu i chloroformu. Proces ten obejmuje homogenizację badanego materiału i/lub lizę komórek przy użyciu takich detergentów, jak sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS) czy Triton-X100, których zadaniem jest degradacja błon komórkowych, a ponadto denaturacja białek. Lizę komórek przeprowadza się w podwyższonej temperaturze w obecności proteinazy K, enzymu rozkładającego białka. W metodzie z zastosowaniem fenolu i chloroformu, uzyskany lizat wytrząsa się następnie kilkukrotnie w obecności tych rozpuszczalników organicznych, które ekstrahują z fazy wodnej (jaką jest uzyskany lizat) tłuszcze. Obecność fenolu powoduje też, że na granicy fazy organicznej i fazy wodnej gromadzą się zdenaturowane białka. Na tym etapie w izolowanej przez nas próbce możemy
wyróżnić 3 różniące się od siebie warstwy: górną - wodną, zawierającą kwasy nukleinowe; środkową - zawierającą zdenaturowane białka oraz dolną - organiczną. Taki kilkukrotny proces ekstrakcji oczyszcza izolowaną próbkę DNA z białek i lipidów. Ostatnim etapem procesu izolacji jest wytrącenie DNA w obecności jonów sodu przy pomocy izopropanolu lub etanolu. Uzyskany osad DNA, po uprzednim przemyciu etanolem, rozpuszcza się w wodzie lub buforze TE. Wadą tej metody izolacji DNA jest konieczność pracy z lotnymi, trującymi, niebezpiecznymi rozpuszczalnikami organicznymi. 2) Izolacja DNA z odsalaniem białek Odbiałczenie DNA zachodzi na skutek odsalania białek komórkowych poprzez zastosowanie zjawiska odwodnienia i wytrącania z użyciem nasyconego roztworu NaCl. W pierwszej kolejności do pobranego materiału dodaje się bufor ekstrakcyjny, zawierający NaCl, TRIS/HCl, EDTA, a następnie proteinazę K oraz detergent (SDS). Próbkę inkubuje się w temp. 55 C przez 3 do 12 godzin. Po inkubacji do próbki dodaje się następnie nasycony roztwór NaCl oraz chloroform. Następne etapy obejmuję wytrącanie DNA, jego suszenie oraz rozpuszczanie w buforze TE. Zaletą metody izolacji DNA z odsalaniem białek jest jej stosunkowo proste wykonanie oraz niewygórowany koszt. 3) Izolacja DNA przez związanie DNA z nośnikiem (przez adsorpcję na kolumnach wypełnionych krzemionką) W metodzie tej tkanka lub komórki, z których ma zostać uzyskany izolat DNA, w pierwszej kolejności muszą zostać poddane lizie w podwyższonej temperaturze. Proces ten, oprócz obecności buforu zawierającego tak jak wcześniej proteinazę K, zawiera również sole chaotropowe, jak np. tiocyjanian guanidyny (który dodatkowo ułatwia lizę komórek oraz inaktywuje nukleazy), chlorowodorek guanidyny, jodek sodu, nadchloran sodu. Sole chaotropowe są związkami rozrywającymi wiązania wodorowe istniejące pomiędzy makrocząsteczkami a cząsteczkami wody. Usunięcie płaszcza wodnego z cząsteczek DNA umożliwia w następnym etapie jego wiązanie do membrany krzemionkowej. Po zakończeniu trawienia materiału biologicznego w obecności soli chaotropowych, uzyskany izolat przenosi się na kolumnę, do dna której przytwierdzona jest membrana krzemionkowa. Dzięki obecności soli chaotropowych i buforu o dużej sile jonowej dochodzi do selektywnej adsorpcji cząsteczek DNA do materiału membrany (inne składniki nie ulegają związaniu). Po odwirowaniu kolumny i odrzuceniu przesączu ze składnikami lizatu komórkowego, poza DNA, zwykle przemywa się dwukrotnie kolumnę roztworem o niższej sile jonowej zawierającym alkohol. Usuwa się dzięki temu resztki zanieczyszczeń pochodzących z lizatu komórek, a także wymycie soli chaotropowych. Ostatni etap postępowania stanowi wymycie oczyszczonego DNA buforem TE (który zawiera TRIS o właściwościach buforujących, zapewniający lekko zasadowe ph oraz EDTA chelator jonów) lub jałową wodą. Uzyskuje się roztwór DNA, którego cząsteczki osiągają długość do 50 kpz. Zaletą izolacji DNA metodą kolumienkową jest jej prostota, szybkość, wydajność, brak konieczności stosowania szkodliwych związków chemicznych oraz brak konieczności wytrącania i ponownego rozpuszczania DNA. Wydajność tej metody może być jednak niższa niż w przypadku izolacji metodą fenol-chloroform.
4) Izolacja DNA metodą separacji magnetycznej Cząstki magnetyczne o właściwościach adsorpcji DNA wykonane są zazwyczaj na bazie tetratlenku triżelaza (Fe 3 O 4 ) wykazującego właściwości magnetyczne, w połączeniu z takimi materiałami jak polistyren czy krzemionka, które zwiększają adsorpcję DNA do powierzchni powstałych cząstek. Tak przygotowane cząsteczki magnetyczne o średnicy 0.5-10 µm miesza się z uzyskanym lizatem komórkowym. Cząsteczki DNA w odpowiednim środowisku specyficznie adsorbują na powierzchni cząstek dzięki ich właściwościom magnetycznym łatwo można wyodrębnić DNA od pozostałych składników roztworu. Przyłożone zewnętrznie pole magnetyczne powoduje gromadzenie się i unieruchomienie cząstek w miejscu działania pola, dzięki czemu w łatwy sposób można usunąć całość wprowadzonego lizatu. Cząstki z zaadsorbowanym na powierzchni DNA można przemyć odpowiednim buforem po usunięciu pola magnetycznego. Po ponownym przyłożeniu pola bufor przemywający usuwa się nie naruszając ponownie unieruchomionych przez kontakt z magnesem cząstek. Ostatnim etapem tej izolacji jest dodanie do cząstek buforu wymywającego, dzięki któremu DNA dostaję się do roztworu (elucja). Przyłożenie pola magnetycznego umożliwia ostateczne oddzielenie uzyskanego roztworu DNA od cząstek magnetycznych. Ta metoda izolacji DNA jest cenna głównie ze względu na swoją szybkość i prostotę. Zastosowanie cząstek magnetycznych eliminuje konieczność stosowania toksycznych rozpuszczalników organicznych czy też konieczność wirowania prób. Wydajność izolacji metodą separacji magnetycznej jest porównywalna z ekstrakcją DNA metodą fenol-chloroform, przy czym izolacja trwa zaledwie kilkanaście minut, co oznacza istotną oszczędność czasu. Wadę stanowi wyższy koszt metody. Pomiar stężenia DNA Pierwszym etapem pracy z materiałem genetycznym przed jego dalszą analizą technikami biologii molekularnej jest określenie czystości oraz stężenia uzyskanych preparatów. Obecność w roztworze DNA takich zanieczyszczeń jak fenol, EDTA, heparyna itp. może istotnie zaburzać przebieg wielu technik analizy DNA, w szczególności PCR. Kontrolę jakości preparatów DNA przeprowadza się za pomocą pomiaru spektrofotometrycznego lub za pomocą wizualnej oceny elektroforezy w żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. Ocena wizualna jest wystarczająca do niektórych zastosowań (np. PCR/RFLP), jednak pomiar stężenia jest zalecany w przypadku użycia DNA jako matrycy do sekwencjonowania lub analizy ilościowej z wykorzystaniem aparatów do PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR). Standaryzacja stężenia pomiędzy próbami zmniejsza także ryzyko kontaminacji prób o niskim stężeniu przez równoległej analizie prób DNA o szczególnie wysokim stężeniu. W tradycyjnych spektrofotometrach preparaty muszą być rozcieńczone najczęściej 100x wodą lub buforem TE. Do kalibracji spektrofotometru używa się tego samego roztworu, w którym rozcieńczono preparaty. Spektrofotometry najnowszej generacji wykorzystują technologię retencji próbki, która stosuje napięcie powierzchniowe do utrzymania próbki w miejscu. To eliminuje konieczność stosowania kuwet lub innych urządzeń na próbki oraz pozwala na czyszczenie w czasie kilku sekund. Ponadto, posiadają możliwość pomiarów próbek bez konieczności ich rozcieńczania (50 krotnie wyższe stężenia niż próbki mierzone za pomocą standardowych
spektrofotometrów kuwetowych), w bardzo niewielkich objętościach (1-2µl), co zmniejsza straty cennego materiału. Kwasy nukleinowe wykazują maksymalną absorbancję przy długości fali 260 nm, białka (ze względu na obecność aminokwasów aromatycznych) przy 280 nm, a zanieczyszczenia organiczne przy długości fali mniejszej od 240 nm. Absorbancja przy 260 nm jest równa 1 (gęstość optyczna OD=1) dla dwuniciowego DNA o stężeniu 50 µg/ml, dla jednoniciowego DNA o stężeniu 33µg/ml i RNA o stężeniu 40 µg/ml. Różnice w absorbancji są wynikiem złożoności struktury DNA i RNA i dlatego jednoniciowe kwasy nukleinowe absorbują więcej światła (oligonukleotydy tylko 30 µg/ml). Zbyt niski stosunek wartości absorbancji A 260 do A 280 świadczy o zanieczyszczeniu preparatów kwasów nukleinowych białkami, a zbyt wysoki o zanieczyszczeniu detergentami stosowanymi podczas izolacji. Wartość współczynnika A 260 /A 280 w zakresie 1,8-2 oznacza, że preparaty są wystarczająco oczyszczone, natomiast wartość równa 1,5 oznacza, że w badanym preparacie DNA lub RNA jest 50% białka. Bardzo dobry preparat DNA powinien mieć dużą lepkość, stężenie około 1 mg/ml, czystość spektrofotometryczną zawartą pomiędzy wartością 1,8 a 2,0. Do większości analiz DNA opartych na technice PCR (amplifikacji) zaleca się stosowanie stężeń DNA rzędu 20 ng/µl, przy założeniu, że matrycowy izolat stanowi 10% mieszaniny PCR. Po uzyskaniu roztworu DNA o zadowalającej jakości, przystąpić można do właściwych analiz z zastosowaniem technik biologii molekularnej.