Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią ================================================================= Ćwiczenie 5 Badanie aktywności promotora w fuzjach transkrypcyjnych z genami reporterowymi lacz oraz lux Prowadzący: dr Barbara Kędzierska, mgr Aleksandra Urban, mgr Joanna Morcinek-Orłowska Celem ćwiczenia jest zbadanie aktywności promotora paxe dzięki zastosowaniu fuzji transkrypcyjnych z genami reporterowymi lacz oraz lux, a także sprawdzenie, jaki wpływ na aktywność tego promotora mają mutacje wprowadzone w obrębie sekwencji -10. Gen reporterowy to gen kodujący białko, którego obecność lub aktywność biochemiczną można w łatwy sposób oznaczyć w komórce (in vivo) poprzez wykorzystanie technik autoradiograficznych, spektrofotometrycznych lub bio- i chemiluminescencyjnych. Geny reporterowe służą do określania wydajności ekspresji innych genów lub badania aktywności różnych promotorów. W tym celu konstruuje się fuzje genowe lub operonowe (transkrypcyjne), w których gen reporterowy jest przyłączony do innego genu przy zachowaniu zgodności ramki odczytu lub też znajduje się pod kontrolą badanego promotora. Geny reporterowe zwykle kodują białko, którego aktywność może być wykryta bezpośrednio (np. emisja światła), lub jest rozpoznawana w wyniku reakcji enzymatycznej prowadzącej do powstania łatwo wykrywalnego produktu (np. zmiana koloru). Jednymi z najpowszechniej wykorzystywanych bakteryjnych genów reporterowych są geny: lacz, kodujący enzym β-galaktozydazę i lux, kodujący lucyferazę. Enzym β-galaktozydaza, kodowany przez jeden z genów struktury operonu laktozowego (lacz) u Escherichia coli, hydrolizuje laktozę na dwa cukry proste: glukozę i galaktozę. Ryc 1. Budowa operonu laktozowego.
Ryc 2. Reakcja hydrolizy laktozy przez β-galaktozydazę. Istnieją chromogenne (sztuczne) analogi strukturalne laktozy hydrolizowane przez β- galaktozydazę. Najczęściej stosowane są ONPG (o-nitrofenyl-β-d-galaktopiranozyd) w hodowlach płynnych oraz X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopiranozyd) w hodowlach stałych. β- galaktozydaza katalizuje rozkład ONPG, a jednym z produktów reakcji jest nitrofenol mający żółte zabarwienie. Intensywność tego zabarwienia mierzy się spektrofotometrycznie. Aktywność β- galaktozydazy w komórce jest wprost proporcjonalna do ilości tego enzymu, a ilość ta jest wprost proporcjonalna do ilości i aktywności translacyjnej odpowiednich transkryptów RNA. Mierząc aktywność β-galaktozydazy w szczepach bakteryjnych zawierających odpowiednie fuzje można wnioskować o wydajności ekspresji badanego genu lub aktywności badanego promotora. Doświadczenia te należy oczywiście wykonywać w szczepach zawierających unieczynniony gen lacz, tak aby aktywne cząsteczki β-galaktozydazy powstawały tylko w oparciu o odpowiednią fuzję genową lub operonową. Fuzje te mogą być ulokowane na chromosomie bakteryjnym (fuzje jednokopijne) lub na plazmidzie (fuzje wielokopijne). Aktywność β-galaktozydazy mierzy się po lizie komórek i oznacza w tzw. jednostkach Millera. Ryc 3. Wzory strukturalne sztucznych substratów operonu laktozowego.
Ryc 4. Reakcja hydrolizy ONPG przez β-galaktozydazę. Gen lux, kodujący lucyferazę, jest odpowiedzialny za bioluminescencję, czyli wytwarzanie światła przez organizmy żywe takie jak np: bakterie Vibrio harveyi, robaczek świętojański Photinus pyralis czy jamochłon morski Renilla reniformis. Proces ten zachodzi w wyniku enzymatycznej reakcji chemicznej polegającej na utlenieniu tlenem atmosferycznym związku zwanego lucyferyną, w obecności enzymu lucyferazy. Lucyferaza łącząc się z kofaktorem - zredukowanym mononukleotydem flawinowym (FMNH2), przy pomocy tlenu, przekształca aldehyd w kwas tłuszczowy, a sama ulega wzbudzeniu przechodząc na poziom wyższy energetycznie. Reakcja ta wymaga udziału ATP i jonów magnezu. W wyniku utleniania powstaje cząsteczka w stanie wzbudzonym - oksylucyferyna, której przejście do stanu podstawowego wiąże się z emisją kwantu światła o długości fali 478-505nm. Kofaktor zostaje utleniony do mononukleotydu flawinowego (FMN). Reakcja przebiega następująco: FMNH 2 + RCHO + O 2 FMN + RCOOH + H 2 O + hν (490nm) Ryc 5. Schemat reakcji luminescencji. Istotną zaletą tego procesu jest możliwość dokładnego pomiaru ilości wyemitowanych fotonów za pomocą urządzenia zwanego luminometrem. Ryc 6. Schemat przedstawiający wynik transformacji bakterii plazmidem kodującym geny operonu lux (po lewej) oraz luminometr (po prawej).
Bakterie wykazujące bioluminescencję posiadają zestaw genów nazwany operonem lux. Komórki bakterii emitują światło w wyniku syntezy białek kompleksu lucyferazy, kodowanych przez pięć genów strukturalnych luxcdabe. Geny luxa i luxb kodują podjednostki α i β lucyferazy; luxc, luxd i luxe to geny kompleksu reduktazy kwasów tłuszczowych. Ryc 7. Struktura operonu lux. Jednostka transkrypcyjna to fragment DNA, który ulega transkrypcji na cząsteczkę RNA; może nią być pojedynczy gen lub operon, czyli zbiór wspólnie transkrybowanych i regulowanych genów. W skład jednostki transkrypcyjnej wchodzą: promotor sekwencja genu/genów terminator sekwencje regulatorowe Inicjacja transkrypcji u organizmów prokariotycznych polega na związaniu się polimerazy RNA z odpowiednim odcinkiem matrycowego DNA, który zawiera informacje o miejscu startu transkrypcji - tzw. promotorem. Podjednostka σ polimerazy rozpoznaje sekwencje -35 i -10 promotora, a transkrypcja zaczyna się od nukleotydu +1. Sekwencja consensus promotora - sekwencja najwyższej zgodności - sekwencja nukleotydów o najwyższym prawdopodobieństwie wystąpienia określonej reszty nukleotydowej w danej pozycji DNA (graficznie przedstawiona w postaci LOGO), powstała po optymalnym nałożeniu na siebie wielu sekwencji promotorowych i odnalezieniu reszt występujących w danej pozycji w większości analizowanych sekwencji. Przyjmuje się, że im silniejszy promotor, tym jego sekwencja w pozycjach -10 i -35 jest bardziej zbliżona do sekwencji consensus (Ryc 8).
TATA-box 16-18 pz 5-6 pz +1 zawsze puryna (G lub A) paxe paxe-mut Ryc 8. Budowa typowego promotora bakteryjnego (na górze); LOGO dla sekwencji konsensusowych promotora rozpoznawanego przez podjednostkę σ polimerazy RNA Escherichia coli (pokazuje, które nukleotydy występują najczęściej w danych pozycjach promotora) (po
środku); sekwencja promotora paxe i paxe-mut (z zaznaczonymi na czerwono wprowadzonymi mutacjami w obrębie rejonu -10 ) (na dole). Materiały: - szczepy E. coli: MG1655Δlac/pRS415/ MG1655 Δlac /prs-axe MG1655 Δlac /prs-axe-mut/ MG1655 Δlac /pbbrlux/ MG1655 Δlac /pbbrlux-axe/ MG1655 Δlac /pbbrlux-axe-mut/ o plazmid prs-axe jest pochodną plazmidu prs415 i zawiera fuzję promotora paxe z genem reporterowym lacz; niesie oporność na ampicylinę. o plazmid pbbrlux-axe jest pochodną plazmidu pbbrlux i zawiera fuzję promotora paxe z genem reporterowym lux; niesie oporność na ampicylinę o konstrukty axe-mut zawierają mutacje w rejonie -10 promotora paxe, - pożywka LB z ampicyliną - chloroform - bufor Z (bufor fosforanowy z KCl, MgSO 4, SDS i β-merkaptoetanolem) - substrat reakcji - roztwór ONPG (roztwór 0.4% O-nitrofenylo- β-galaktozydu w buforze fosforanowym) - roztwór stopujący - 1M Na 2 CO 3 Badanie aktywności β-galaktozydazy Wykonanie: 1. Rozcieńczyć hodowle nocne (przygotowane przez prowadzącego) w 3 ml świeżej pożywki LB w stosunku 1:10 2. Zmierzyć i zapisać wartości OD 600 3. Do probówek zawierających 100 μl chloroformu i 1,5 ml buforu Z dodać po 100 μl rozcieńczonej hodowli 4. Zawartość każdej z tych probówek wymieszać przez worteksowanie przez 15 sekund 5. Inkubować na stole przez 10 minut 6. Do każdej próbki dodać 400 μl roztworu ONPG i włączyć stoper 7. Inkubować na stole do momentu pojawienia się żółtej barwy roztworu 8. Dodać 1 ml 1M Na 2 CO 3 i wyłączyć stoper. Zanotować dokładny czas, jaki upłynął od momentu dodania ONPG 9. Po skończeniu eksperymentu zmierzyć wartość OD 420 wszystkich prób 10. Obliczyć aktywność β-galaktozydazy (w jednostkach Millera) wg wzoru: gdzie: Abs600 gęstość optyczna hodowli Abs420 absorbancja żółtego O-nitrofenolu Abs550 współczynnik zmętnienia roztworu
t = czas (w min.) od momentu dodania ONPG do momentu dodania Na 2 CO 3 V = objętość hodowli bakteryjnej w próbce Mapa plazmidu prs415 Fragment DNA zawierający badany promotor został wklonowany pomiędzy miejsca restrykcyjne EcoRI i BamHI, tak aby kontrolować ekspresję genu lacz. Badanie aktywności lucyferazy Wykonanie: 1. Rozcieńczyć hodowle nocne (przygotowane przez prowadzącego) w 3 ml LB w stosunku 1:10 2. Zmierzyć i zapisać wartość OD 600 3. Pobierać po 0.2 ml rozcieńczonej hodowli bakteryjnej do specjalnych szklanych probówek i zmierzyć luminescencję za pomocą luminometru. Przeliczyć otrzymane wartości względem OD 600 bakterii 4. Zinterpretować otrzymane wyniki m ob/rep cm R term inator Mapa plazmidu pbbrlux luxe luxb pbbrlux 10851 bp rep AP053 (prim er pbbrmcsseq1) Spe I (3246) Bam HI (3252) AP052 (prim er pcs26seq2) Plazmidy pochodzące od pbbrlux zawierają rejon badanego promotora wklonowany pomiędzy miejsca restrykcyjne SpeI- BamHI, tak aby kontrolował on ekspresję operonu lux. luxc luxa luxd
Zagadnienia do samodzielnego przygotowania: 1. Teoria operonu na przykładzie operonu laktozowego; regulacja aktywności tego operonu. 2. Fuzje genowe i operonowe - sposoby konstrukcji i zastosowanie w badaniu ekspresji genów. 3. Geny reporterowe - przykłady, charakterystyka, wykorzystanie. 4. Gen lacz - charakterystyka produktu tego genu, oznaczanie aktywności β-galaktozydazy, podłoża, na których można testować aktywność β-galaktozydazy. 5. Gen lux jako gen reporterowy. 6. Budowa promotora bakteryjnego. 7. Inicjacja transkrypcji u bakterii. Literatura: 1. Gajewski W. Genetyka ogólna i molekularna 2. Węgleński P. Genetyka molekularna 3. Kotełko K., Sedlaczek L., Lachowicz T.M. Biologia bakterii 4. Kunicki-Goldfinger W.J.H. Życie bakterii 5. Kur J. Podstawy inżynierii genetycznej: teoria, ćwiczenia, testy