Escherichia coli. System pbad

Transkrypt

1 Escherichia coli System pbad

2 System pbad System pbad został skonstruowany w oparciu o elementy regulacji transkrypcji operonu arabinozowego E. coli Elementy regulacji transkrypcji operonu arabinozowego E. coli pozwalają na bardzo precyzyjne sterowanie ekspresją białek w E. coli w systemie pbad za pomocą induktora arabinozy

3 Operon arabinozowy Bakterie E. coli są w stanie wykorzystywać arabinozę jako źródło węgla Enzymy wykorzystywane w tym szlaku są kodowane odpowiednio przez geny araa, arab i arad, należące do operonu arabinozowego

4 Operon arabinozowy araa gen kodujący izomerazę arabinozową, która przekształca L- arabinozę do L-rybulozy arab gen kodujący rybulokinazę przekształcającą L-rybulozę do L- rybulozo-5-fosforanu arad gen kodujący epimerazę L-rybulozo-5-fosforanu przekształcającą L- rybulozo-5-fosforanu do D-ksylulozo-5-fosforanu

5 Operon arabinozowy Operon arabinozowy zawiera poza genami enzymów szlaku asymilacji arabinozy pod kontrolą promotora P BAD : Gen arac kodujący białko regulatorowe AraC pod kontrolą własnego promotora P C Miejsca operatorowe arao 1,araO 2 i arai Miejsce wiązania białka CRP Proc Natl Acad Sci U S A Apr;62(4):

6 Operon arabinozowy Operon arabinozowy podlega podwójnej kontroli Do wydajnej transkrypcji genów spod tego promotora wymagana jest obecność: kompleksu białka CRP z camp pierwszy induktor transkrypcji kompleksu białka regulatorowego AraC z arabinozą drugi induktor transkrypcji Białko AraC pełni podwójną rolę w regulacji ekspresji genów operonu arabinozowego, w formie natywnej bez arabinozy białko pełni rolę represora

7 Operon arabinozowy regulacja ekspresji Białko AraC jest transkrybowane spod własnego promotora p c w kierunku przeciwnym do transkrypcji pozostałych białek operonu arabinozowego Przy niskim stężeniu camp w komórce związanym z obecnością glukozy, glukoza jest łatwiej przyswajalnym źródłem węgla niż arabinoza, białka arab, araa i arad nie są syntetyzowane

8 Operon arabinozowy regulacja ekspresji Kiedy białko AraC jest obecne w dużej ilości w komórce E. coli, a jednocześnie w tej komórce nie ma kompleksu camp-crp oraz poziom L-arabinozy jest niski zostaje zahamowana ekspresja wszystkich białek operonu arabinozowego W tych warunkach białko AraC tworzy dimery które poprzez wiązanie się z sekwencjami operatorowymi arao1, arao2 i arai hamuje: ekspresję białka AraC autoregulacja ekspresji (wiązanie z sekwencją regulatorową arao1) ekspresję białek arab, araa i arad (wiązanie z sekwencją regulatorową arao2 i arai)

9 Operon arabinozowy regulacja ekspresji Kiedy komórka E. coli wyczerpuje zasoby ATP, które czerpała z glukozy, wzrasta w niej znacznie poziom kompleksów camp- CRP jednego z dwóch aktywatorów operonu arabinozowego Drugim z induktorów jest L-arabinoza, która wiążąc się z białkiem AraC zmienia jego konformację, co prowadzi również do zmiany jego funkcji z represora na aktywator ekspresji Związanie się kompleksu camp-crp z miejscem regulatorowym CAP jest warunkiem koniecznym do zajścia transkrypcji z promotora P BAD. Sama obecność arabinozy związanej z białkiem arac nie wystarczy.

10 Operon arabinozowy regulacja ekspresji Białko AraC w zależności od obecności lub braku arabinozy pełni rolę induktora ekspresji genów własnego metabolizmu Białko AraC reguluje własną ekspresję autoregulacja ekspresji genu bez dodatkowych czynników zewnętrznych Ekspresja genu jest silnie związana z nadrzędnym mechanizmem ekspresji genów zangażowanych w metabolizm źródeł węgla przez E. coli tj. represję kataboliczną (poziom camp, białko CRP) Regulacja ekspresji genów odbywa się przez bardzo skuteczny mechanizm zapętlania DNA (bardziej charakterystyczny dla Eukariota niż Prokariota)

11 Operon arabinozowy - system pbad System pbad został stworzony w oparciu o operon arabinozowy i wykorzystuje jego elementy regulacyjne takie jak: Promotor pbad Sekwencje regulatorowe arao 1,araO 2 i arai Gen arac pod kontrolą własnego promotora P C

12 System pbad System pbad obejmuje serię wektorów plazmidowych pbad firmy Invitrogen oznaczającym przedstawiony fragment operonu arabinozowego np. pbad-topo, pbad-dest49, pbad/thio-e

13 System pbad

14 Inne promotory występujące w wektorach ekspresyjnych E. coli Promotor P tac szeroko używany w wielu systemach ekspresyjnych E. coli promotor hybrydowy promotor ten został skonstruowany przez złożenie regionu - 35 promotora P trp operonu syntezy tryptofanu i regionu -10 promotora P lacuv5 wraz z regionem operatorowym represora laci IPTG - kontrola ekspresji i indukcja

15 Inne promotory występujące w wektorach ekspresyjnych E. coli - promotory fagowe Promotory: Promotory fagowe rozpoznawane przez polimerazę RNA E. coli Promotory fagowe wymagające własnej fagowej polimerazy RNA (patrz system pet)

16 Escherichia coli

17 Bacteriofag lde3 W w obrębie genu int (gen integrazy) faga l wbudowano fragment faga 21 DNA zawierający gen laci pod własnym promotorem oraz gen kodujący polimerazę RNA faga T7 pod kontrolą promotora placuv5 Ponieważ gen integrazy faga lde3 został przerwany fag ten nie jest wstanie ani się sam wbudować, ani wyciąć z genomu bakterii Szczep Bl21(DE3) został skonstruowany poprzez zintegrowanie z genomem szczepu BL21 faga lde3 w obecności faga helperowego Firma Novagen sprzedaje zestawy do lizogenizacji dowolnych szczepów E. coli fagiem lde3 - lde3 Lysogenization Kit

18 Szczepy E. coli używane w systemie ekspresyjnym pet pochodzą od szczepów K12 lub szczepów B E. coli Szczepy DE3 pochodzące od K12: HSM174 NovaBlue Origami Rosetta-gami RosettaBlue Szczepy DE3 pochodzące od B : BL21 BLR B834 Tuner Rosetta OrigamiB RosettaGamiB Rosetta2

19 Mutanty lon - i ompt - Mutanty te nie produkują białek wewnątrzkomórkowej proteazy lon oraz zewnątrzkomórkowej proteazy ompt Docelowo eksprymowane w tych szczepach białka jest mniej narażone na proteolityczną degradację zarówno podczas ekspresji w cytoplazmie (proteaza lon) jak i podczas etapu oczyszczania po lizie komórek E. coli (proteaza ompt) Wszystkie szczepy pochodne od szczepu B E. coli są lon - i ompt -

20 Mutanty lacy1 - Szczepy E. coli z delacją genu lacy1 nie posiadają białka permeazy laktozowej Szczepy te umożliwiają precyzyjne sterowanie poziomem ekspresji białka spod promotora T7 poprzez regulację stężenia IPTG w pożywce hodowlanej Szczepy - mutanty lacy1 - to szczep Tuner i szczepy z klasy OrigamiB oraz Rosetta

21 Mutanty gor - i/lub trxb - Mutanty te nie produkują białek reduktazy glutationowej gor i/lub reduktazy tioredoksyny TrxB dzięki czemu cytoplazma komórek takich szczepów jest środowiskiem o potencjale znacznie mniej redukującym niż szczepów produkujących te białka W szczepach gor - i/lub trxb - uzyskujemy większą szansę na powstanie w eksprymowanym białku mostków disiarczkowych i zmniejszamy szansę na powstanie ciał inkluzyjnych lub degradację białek źle złożonych

22 Mutanty gor - i/lub trxb - BL21trxB(DE3) jest mutantem trxb - Szczepy Origami(DE3), OrigamiB(DE3) i Rosetta-gami(DE3) są mutantami zarówno trxb - jak i gor - Szczepy posiadające mutacje trxb - jak i gor - mają większy potencjał tworzenia mostków disiarczkowych i zapewniają wyższą rozpuszczalność białek eksprymowanych do cytoplazmy niż szczepy zawierające tylko mutacje trxb -

23 Ekspresja genów heterologicznych bogatych w rzadkie kodony w E. coli może napotkać na problemy na etapie translacji powodujące: Przyhamowanie translacji białka Przedwczesną terminację translacji białka Translacyjne przesunięcie ramki odczytu Błędne podstawienie innym t-rna

24 Szczepy E. coli doposażone w t-rna dla rzadkich kodonów

25 Szczepy E. coli doposażone w rzadkie kodony Należą do nich szczepy klasy Rosetta, Rosetta 2 i Rosettagami 2 posiadające uniwersalną pulę t-rna umożliwiającą wydajną ekspresję genów heterologicznych kodowanych przez tzw. rzadkie kodony u E. coli Szczepy Rosetta zapewniają wystraczający udział t-rna 6 rzadkich kodonów u E. coli tj. AUA, AGG, AGA, CUA, CCC i GGA Szczepy Rosetta2 zapewniają wystraczający udział t-rna 7 rzadkich kodonów u E. coli tj. AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA oraz dodatkowo CGG

26 Szczepy Rosetta E. coli niosą plazmidy serii prare niosące geny kodujące 6 rzadkich kodonów eksprymowanych z własnych promotorów

27 Szczepy Rosetta2 E. coli niosą plazmidy serii prare2 niosące geny kodujące 7 rzadkich kodonów eksprymowanych z własnych promotorów

28 Mutanty reca1 - Szczepy E. coli reca1 - zapewniają większą stabilność plazmidów niosących geny zawierające sekwencję repetytywne, których obecność w komórce może powodować utratę profaga lde3 Szczepami E. coli reca1 - są szczepy klasy HMS174, NovaBlue, RosettaBlue oraz BLR

29 Mutanty auksotrofowe Met - Szczepy auksotrofowe E. coli Met - nie produkują endogenej metioniny, są wstanie rosnąć na pożywce wzbogaconej o ten aminokwas Jeżeli do pożywki zamiast Met dodamy 35 S-met lub selenometioninę znakowaną dla celów krystalograficznych możemy produkować w tych szczepach białka szczególnie dobrze nadające się do uzyskiwania ich modeli 3D o wysokiej rozdzielczości Mutantami auksotrofowymi Met - są szczepy E. coli klasy B834

30 Szczepy E. coli bez sufixu DE3 np. szczep BL21 nie jest szczepem ekspresyjnym w ujęciu systemu Tabora-Studiera, ponieważ nie produkuje polimerazy RNA faga T7 z promotorów pt7

31 Szczep BL21 może być wykorzystany do ekspresji białek spod promotorów takich jak lac, tac, trc i trp Ekspresja spod promotora T7 w szczepie BL21 jest możliwa, jeżeli komórki tego szczepu transformowane wybranym plazmidem serii pet zostaną zainfekowane fagiem lce6 Rozwiązanie to jest stosowane gdy produkt genu wklonowanego do plazmidu pet jest tak toksyczny dla komórek E. coli, że uniemożliwia to jego ekspresję w szczepach E. coli lde3

32 pet System Manual - Novagem

33