Zarówno u organizmów eukariotycznych, jak i prokariotycznych proces replikacji ma charakter semikonserwatywny.

Transkrypt

1 HIPTEZY WYJAŚIAJĄCE MECHAIZM REPLIKACJI C. Model replikacji semikonserwatywnej zakłada on, że obie nici macierzystej cząsteczki DA są matrycą dla nowych, dosyntetyzowywanych nici REPLIKACJA każda z dwóch cząsteczek DA powstałych po replikacji zawiera jedną nić starą oraz jedną nić nową Zarówno u organizmów eukariotycznych, jak i prokariotycznych proces replikacji ma charakter semikonserwatywny. REPLIKACJA DA Inicjacja- rozpoznanie miejsc zapoczątkowania replikacji Elongacja- wydłużanie nowych nici DA na matrycy łańcuchów oryginalnych Terminacja- proces kompletowania nowych łańcuchów (helisy) DA 1

2 IICJACJA REPLIKACJI DA RI (origins of replications), to miejsce zapoczątkowania replikacji, u organizmów prokariotycznych zawsze tylko jedno w chromosomie i mające specyficzną budowę U Eucariota takich miejsc może być wiele w jednym chromosomie i są one trudne do rozpoznania, posiadają 3 domeny wzajemnie ze sobą współpracujące IICJACJA REPLIKACJI DA Białka wiążące (RPA replication protein A lub SSB- single strand binding proteins) jednoniciowy DA Topoizomeraza DA Helikaza DnaB rozplata podwójną strukturę DA Enzymy odpowiedzialne za syntezę DA to polimerazy DA Rodzaj polimerazy DA rganizmy Liczba podjednostek Aktywność Funkcja Polimeraza I Procaryota oraz 5-3 Replikacja (usuwanie starterów RA) i naprawa DA Polimeraza II Procaryota aprawa DA Polimeraza III Procaryota ok Replikacja DA* Polimeraza α Eucaryota 4 - Synteza starterów RA Polimeraza β Eucaryota 1 - aprawa DA Polimeraza γ Eucaryota Replikacja mtda Polimeraza δ Eucaryota 2 lub Replikacja DA* Polimeraza ε Eucaryota min Replikacja DA (?) 2

3 Do zapoczątkowania elongacji niezbędny jest starter (krótka sekwencja syntetyzowana bezpośredni na nici matrycowej) U Procaryota starter (RA) o długości 5 nukleotydów syntetyzowany jest przez prymazę (polimeraza RA) U Eucaryota startery (RA) o długości 10 nukleotydów + 30 nukleotydów syntetyzowane są (na obu niciach) przez polimerazę α U Procaryota występuje replisom (kompleks helikazy, prymazy i polimerazy III), który przesuwa się wzdłuż nici DA U Eucaryota enzymy i białka uczestniczące w replikacji tworzą kompleksy zwane fabrykami replikacyjnymi, przez które przesuwa się nić DA ić oryginalna: 3 -TCAGCGCGACCATAAGACATAGACATATACAGATGA-5 kierunek rozplecenia helisy 5 -AGUCGCGCTGGTATTC TGTATC TGTATATGTCTACT-3 Fragment kazaki 3 -TCAGCGCGACCATAAGACATAGACATATACAGUGA-5 Krótki starter RA 5 -AGTCGCGCTGGTATTC TGTATC TGTATATGTCTACT-3..kierunek rozplecenia helisy ić oryginalna: Replikacja na nici wiodącej Polimerazy DA przyłączają deoksynukleozydotrójfosforany zawsze od końca 5 do 3 Uwalnia się energia 3

4 Fragmenty kazaki- to polinukleotydowe łańcuchy DA syntetyzowane na nici opóźnionej U Procaryota mają długość pz U Eucaryota są krótkie ok 200pz i odpowiadają długości DA z jednego nukleosomu Replikacja na nici opóźnionej 5 3 Fragmenty kazaki Polimeraza DA Matryca DA Przyłączenie złego nukleotydu Przyłączenie prawidłowego nukleotydu pozwala na dalsze wydłużanie nici dłączenie niesparowanego nukleotydu 3-5 (aktywność egzonukleazy) Synteza kontynuowana jest w kierunki 5-3 4

5 procaryota eucaryota TERMIACJA REPLIKACJI DA U Procaryota w chromosomie znajdują się sekwencje terminacyjne, do których specyficznie wiążą się białka, które tylko z jednej strony blokują aktywność DnaB helikazy TERMIACJA REPLIKACJI DA U Eucariota funkcjonują dwa zaproponowane modele terminacji syntezy DA 5

6 Ekspresja genów DA transkrypcja Splicing (wycinanie intronów) pre-mra mra odwrotna transkrypcja replikacja translacja łańcuch amin./ białko białko funkcjonalne modyfikacja potranslacyjna Transkrypcja Synteza łańcucha pojedynczej nici RA bezpośrednio na matrycy DA Syntetyzowana nić RA jest komplementarna do opóźnionej nici DA: 3-5 Ma wbudowany uracyl zamiast tyminy Polimeraza RA nie wymaga do syntezy starterów! Synteza rybonukleotydów RA H 2 - P CH 2 H - P CH 2 H H n-1 H H 2 + n P P P CH 2 H H ATP RA H 2 H 2 - n-1 P CH 2 H n H - P CH 2 H 2 H 2 H - P CH 2 H H n P P - pirofosforan = PPi 6

7 Promotor genu Sekwencja DA posiadająca miejsce specyficzne dla inicjacji transkrypcji Sekwencja DA, do której wiąże się polimeraza RA, zapoczątkowując transkrypcję Miejsce wiązania i miejsce inicjacji transkrypcji nie muszą być tą samą sekwencją! Eukariotyczny promotor Liczby oznaczają % sekwencji, w których dany nukleotyd występuje w danej pozycji wg innych: T A T A W A A R (W = A lub T; R puryna) Promotor genu Wyspa CpG 7

8 Promotor genu Tylko 24% promotorów w ludzkich genach zawiera kasetę TATA; 46% promotorów zawiera sekwencję IR a wśród nich 35% zawiera również kasetę TATA większość genów bez kasety TATA to geny cytohomeostatyczne minimalnym inicjatorem jest YR (pirymidyna a następnie puryna jako pierwszy nukleotyd ulegający transkrypcji) Transkrypcja u Eucaryota U Eucaryota występują trzy polimerazy RA: I, II, III r Miejsce syntezy Co syntetyzuje? I jąderko rra (28S; 18S; 5,8S) II nukleoplazma mra, snra, mira III nukleoplazma tra, 5S rra 8

9 Transkrypcja RA Inicjacja transkrypcji W skład kompleksu inicjującego transkrypcję wchodzą powszechne (podstawowe) czynniki transkrypcyjne (ang. general (basic) transcription factors). azewnictwo podstawowych czynników transkrypcyjnych TFIIA transcription factor kolejny czynnik umer polimerazy, z którą współdziała Inicjacja transkrypcji Czynniki transkrypcyjne wiążą się z sekwencjami promotorowymi (TATA, IR, DPE )i rekrutują polimerazę RA. DA wiąże się najpierw w zamkniętym kompleksie. astępnie polimeraza RA denaturuje fragment DA o długości pz (kompleks otwarty). Miejsce, w którym pierwszy nukleotyd jest włączony do transkrypcji, jest ponumerowane "+1" i jest nazywane miejscem rozpoczęcia transkrypcji. Dopiero po syntezie pierwszych 8 lub 9 zasad transkryptu, uwalniane są czynniki transkrypcyjne a polimeraza opuszcza region promotora. 9

10 TFIID łączy się z DA. TFIID składa się z kilkunastu podjednostek białkowych TBP rozpoznaje kasetę TATA i wiąże się z nią z wysokim powinowactwem. Inicjacja transkrypcji TBP (ang. TATA-box binding protein). Pozostałe podjednostki nazywają się TAF (ang. TBP-associated factors) Terminacja transkrypcji- Poliadenylacja Splicing- wycinanie intronów w mra Gen globiny pz: 622 w eksonach, 893 w intronach Gen owoalbuminy pz: 8 krótkich eksonów (1858pz) Gen owotransferyny pz: 10 krótkich eksonów (2200pz) 10

11 Splicing- wycinanie intronów w mra W trakcie transkrypcji syntetyzowany RA jest włączany w kompleksy białkowe tworzą się splajsosomy. W splajsosomach dochodzi do wycinania intronów i składania mra. W skład splajsosomów wchodzą różne snrp ( snurps ; ang. small nuclear ribonucleoproteins). Każdy snrp to kompleks kilku lub kilkunastu łańcuchów polipeptydowych i krótkiego RA (snra to przeciętnie nukleotydów) Alternatywne wycinanie prowadzi do powstawania podobnych białek różniących się obecnością jakiejś domeny co powoduje różną podatność na regulację oraz różną aktywność biologiczną Introny zawierają niezmienne sekwencje 5'-GU i 3'-AG na swoich granicach (reguła GU-AG) Alternatywny splicing 11

12 Transkrypcja rra Jednostki transkrybowane (trancription units) Jednostki nietranskrybowane mra mała podjednostka - wiązanie mra Rybosom duża podjednostka - katalityczna miejsce A (aminoacylowe) miejsce P (peptydylowe) powstający polipeptyd 12

13 Translacja synteza białka na matrycy mra przebiega w rybosomach kod genetyczny interpretują cząsteczki tra Translacja tra 13