- - - - - Ocena ekspresji Fas i FasL na limfocytach krwi obwodowej chorych na raka krtani Evaluation of Fas and FasL expression on peripheral blood lymphocytes in patients with laryngesl cancer 1, Krzysztof Kupisz 1 2, Adrian Andrzejczak 3, Eliza Trzaskowska 3, Krystian Kotiuszko 3 3 SUMMARY The aim of the study was evaluation of Fas and FasL receptors` expression on peripheral blood lymphocytes in patients with laryngeal cancer. The study was conducted in a group of 62 patients with different clinical stages of the disease. The study material consisted of the peripheral blood obtained from the studied population, from which T lymphocytes were isolated and incubated with monoclonal antibodies. To evaluate antigens` expression, a results were compared with the measurements taken in 20 healthy individuals crease in the Fas and FasL receptors` expression on CD+ lymphocytes was found in comparison with the expression of these proteins observed in the control group. Moreover, a higher level of Fas expression was observed on the peripheral blood lymphocytes of patients with stage I clinical advance ment of laryngeal cancer in comparison with those who had more advanced stages of the disease (Groups II, III, IV), which may be indicative of higher activation and susceptibility of peripheral blood lymphocytes to apoptosis in patients with the early stage of the disease. A negative (reverse) correlation was also found between Fas and FasL re ceptors` expression and the organ advancement of laryngeal cancer, which may provide further evidence that together with the progress of the disease the susceptibility of peripheral blood lymphocytes to apoptosis decreases. apoptoza limfocytów T, Fas, FasL, rak krtani Key words: T lymphocyte apoptosis, Fas, FasL, laryngeal cancer by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów Otrzymano/Received: 28.02.2011 Zaakceptowano do druku/accepted: 02.04.2011 Wojewódzkiego Szpitala Specjalistycznego Kierownik: dr n med. K. Kupisz Laryngologicznej Akademii Medycznej Kierownik: prof. dr hab. med. J. Klatka /Authors contribution: jest Konflikt interesu Adres do korespondencji/ Address for correspondence: 20-718 Lublin tel. 81-5257890 fax 81-5374536 ela701@wp.pl Jednym z mechanizmów immunosupresji w przebiegu choroby nowotworowej jest apoptotyczna śmierć komórek układu odpornościowego. Do czynników biorących udział w indukcji apoptozy limfocytów należą m.in. antygen Fas (CD95) zwany czynnikiem śmierci i FasL [1]. Receptor błonowy Fas/APO-1 (CD95) należy do rodziny receptorów czynnika martwicy nowotworów (TNF; tumor necrosis factor) i jest zewnątrzkomórkowym czynnikiem inicjującym programowaną śmierć komórki. Ekspresja receptora CD95 występuje na subpopulacjach limfocytów T (TCR g/d+) pamięci immunologicznej CD45RO zarówno CD4, jak i CD8 oraz na limfocytach TCD45RO (TCR g/d+). Antygen Fas występuje również na niewielkim odsetku spoczynkowych komórek krwi obwodowej T i B i na ok. 5% komórek NK oraz subpopulacji monocytów [2, 3]. Cząsteczka FasL (ligand dla antygenu Fas) jest powierzchniową molekułą również należącą do nadrodziny TNF, białkiem wykazującym silną cytotoksyczność przeciwko Fas+ komórkom [4, 5]. FasL stwierdza się prawie wyłącznie na aktywowanych limfocytach. Ekspresję FasL wykazano również na komórkach niektórych nowotworów, jak szpiczak plazmocytowy, chłoniaki pochodzące z komórek NK czy raki płaskonabłonkowe regionu głowy i szyi [6]. Połączenie Fas FasL indukuje proces apoptozy w komórkach z ekspresją Fas. Receptory Fas i FasL są odpowiedzialne za wyhamowanie odpowiedzi immunologicznej i uczestniczą w cytotoksyczności indukowanej przez limfocyty T [7 9]. Obecność FasL na komórkach nowotworowych jest rodzajem immunosupresji, w której nowotwór wymyka się spod nadzoru immunologicznego i niszczy cytotoksyczne limfocyty T, pokonując je ich własną bronią FasL. Aktywowane limfocyty T wykazują ekspresję zarówno receptora Fas, jak i FasL. Interakcja dwóch aktywowanych limfocytów T może prowadzić do przekazania sygnału śmierci i zainicjowania procesu apoptozy, będącej wynikiem śmierci bratobójczej. 33 Otolaryngol Pol 2011; 65 (3a): 33-38
- - - - - 34 Ekspresja Fas na limfocytach CD3+ (MFI) 140 120 100 80 60 40 20 0 Kontrolna I II III IV Celem pracy była oceny ekspresji białek Fas i FasL na limfocytach T CD3+, subpopulacjach CD4+ i CD8+ u chorych na raka krtani oraz na limfocytach T w grupie ludzi zdrowych. Ponadto przeanalizowano zależność pomiędzy ekspresją badanych białek Fas i FasL na limfocytach T u chorych z rakiem krtani, a stopniem zaawansowania klinicznego i narządowego choroby oraz obecnością przerzutów do regionalnych węzłów chłonnych. ±Odch std. ±Błąd std. Średnia Ryc. 1.- w grupie kontrolnej Ekspresja Fas na limfocytach CD3+ (MFI) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 I II, III, IV ±Odch std. ±Błąd std. Średnia Ryc. 2. Porównanie ekspresji receptora Fas na limfocytach - Badaniem objęto 62 chorych z rakiem krtani (57 mężczyzn i 5 kobiet) w wieku od 41 do 81 lat. Badaną populację podzielono na grupy różniące się stopniem zaawansowania klinicznego raka krtani (I, II, III, IV stopień) i grupy różniące się zaawansowaniem narządowym (cecha T). Materiał do badań stanowiła krew obwodowa, z której izolowano komórki jednojądrzaste. Uzyskane z krwi limfocyty T inkubowano z przeciwciałami monoklonalnymi sprzężonymi z fluorochro- T4 T3 T2 T1 T4 T3 T2 T1 mami (FITC, PE) i poddawano analizie w cyrometrze przepływowym. Do badań zastosowano przeciwciała monoklonalne: anty-cd3, anty-cd4, anty-cd8, sprzężone z FITC bądź PE firmy Caltag. Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzono za pomocą programu Statistica v.7.1(statsoft Polska). Ze względu na skośny rozkład oceniony za pomocą testu Shapiro-Wilka do porównania dwóch grup niezależnych zastosowano test Manna-Whitney a, a dla więcej niż dwóch grup test ANOVA Krusaka-Wallisa. Do oceny zależności pomiędzy dwoma cechami zastosowano test współczynnika korelacji r-spearmana. Wyniki Korelacja ekspresji Fas na limfocytach CD3+ ze stopniem zaawansowania narządowego raka krtani Wsp. korelacji: r= -0,4695 p<0,0001 Ekspresja Fas na limfocytach CD3+ (MFI) Regresja 95% p.ufności 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Ryc. 3. Korelacja ekspresji FasL na limfocytach CD3+ ze stopniem zaawansowania narządowego raka krtani Wsp. korelacji: r=-0,3708, p=o,oo1 Ekspresja FasL na limfocytach CD3+ (MFI) Regresja 95% p.ufności 0 20 40 60 80 100 120 Ryc. 4. Na podstawie przeprowadzonych badań, nie stwierdzono różnic w odsetku limfocytów CD3+ z ekspresją receptora
- - - - - Fas pomiędzy badaną grupą chorych, a grupą kontrolną. Stwierdzono natomiast znamienne statystycznie różnice MFI. W badanej grupie chorych wykazano istotnie mniejszą ekspresję Fas na limfocytach CD3+ krwi obwodowej w porównaniu z wartościami ekspresji Fas w grupie kontrolnej (p<0,0001) (Tab. I). Rozpatrując wyniki badań uzyskane w poszczególnych grupach, stwierdzono znamienne statystycznie obniżenie poziomu Fas na limfocytach CD3+ w każdej grupie chorych, będących w różnym stopniu zaawansowania klinicznego choroby, w odniesieniu do grupy kontrolnej. Podobne spostrzeżenia zaobserwowano w populacjach limfocytów CD4+ i CD8+. Ekspresja receptora Fas na limfocytach CD4+ i CD8+ była istotnie niższa we wszystkich grupach chorych znajdujących się w różnym stadium zaawansowania klinicznego raka krtani w porównaniu z grupą kontrolną (Ryc. 1, Tab. II). Analizując wyniki badań pomiędzy grupami chorych różniących się stopniem zaawansowania klinicznego raka krtani, stwierdzono znamienną statystycznie różnicę w ekspresji Fas na limfocytach CD3+ w grupie I w porównaniu z pozostałymi grupami chorych. W grupie chorych będących w I stopniu zaawansowania choroby ekspresja receptora Fas na limfocytach CD3+ (MFI) była istotnie większa (p=0,04; P<005) (średnia 49,3 ± 28,627) niż w pozostałych grupach chorych (33,783 ± 22,246 ) (Ryc. 2). Uzyskane wyniki świadczą o nasileniu apoptozy w limfocytach krwi obwodowej u chorych będących w początkowym stadium choroby. Ponadto stwierdzono statystycznie znamienną (p<0,0001) zależność pomiędzy ekspresją receptora Fas na limfocytach CD3+ a zaawansowaniem narządowym choroby. W badanej grupie chorych wraz ze wzrostem wielkości guza (cecha T) stwierdzono mniejszą ekspresję Fas na limfocytach CD3+ (Ryc. 3). Dokonując oceny ekspresji FasL w badanej grupie, wykazano istotną statystycznie mniejszą ekspresję FasL na limfocytach CD3+ w badanej grupie chorych (p<0,001) w porównaniu z ekspresją FasL na limfocytach CD3+ w grupie kontrolnej. Podobne spostrzeżenia uzyskano w subpopulacjach CD4+ i CD8+, stwierdzono bowiem mniejszą ekspresję FasL na limfocytach CD4+ i CD8+ w badanej grupie chorych na raka krtani w porównaniu z grupą kontrolną (Tab. III). Wyniki przeprowadzonych badań nie wykazywały natomiast znamiennych statystycznie różnic pomiędzy ekspresją receptora FasL na limfocytach CD3+ pomiędzy grupą chorych będących we wczesnym stadium raka krtani a pozostałymi grupami chorych, z większym zaawansowaniem narządowym choroby. Zaobserwowano natomiast istotną statystycznie (p<0,0001), ujemną korelację pomiędzy poziomem ekspresji receptora FasL na limfocytach CD3+ a stopniem zaawansowania narządowego raka krtani. Wraz z postępem choroby ekspresja FasL na limfocytach CD3+ była mniejsza. Podobnych obserwacji dokonano w subpopulacjach CD4+ i CD8+. Wraz ze wzrostem masy guza poziom ekspresji FasL na limfocytach CD4+ i CD8+ zmniejszał się (Ryc. 4). Nie zaobserwowano natomiast istotnych różnic w ekspresji Fas i FasL pomiędzy grupą chorych, u których nie stwierdzono przerzutów do regionalnych węzłów chłonnych (N ), a grupą chorych ze zdiagnozowanymi przerzutami (N+). Omówienie Przeprowadzone przez nas badania nie wykazały różnic w odsetku limfocytów Fas+ pomiędzy badaną grupą chorych a grupa kontrolną, stwierdzono natomiast istotnie niższą ekspresję Fas na powierzchni limfocytów T CD3+ i w subpopulacjach CD4+ i CD8+ w badanej grupie chorych w porównaniu z ekspresją Fas w grupie kontrolnej. Obserwacje dokonane przez Cardi G. i wsp. [10] są zbliżone do wyników własnych. W grupie chorych z rakiem nerki autorzy dokonali oceny ekspresji Fas na limfocytach krwi obwodowej i limfocytach naciekających guz, a uzyskane wyniki porównali z wartościami uzyskanymi w grupie kontrolnej. Uzyskane przez nich wyniki wskazywały na obniżenie ekspresji Fas na limfocytach CD3+ krwi obwodowej w porównaniu z wartościami obserwowanymi w grupie kontrolnej. Autorzy ci zauważyli również, że ekspresja Fas w subpopulacjach CD4+ i CD8+ nie wykazywała różnicy pomiędzy badaną grupą chorych, a grupą kontrolną. Ekspresja receptora Fas na limfocytach naciekających guz TIL była większa od wartości obserwowanych na limfocytach krwi obwodowej. Jednakże inne od naszych były spostrzeżenia Kim J. i wsp. [11]. Dokonali oni oceny ekspresji czynników pro- i antyapoptotycznych w grupie 77 chorych leczonych z powodu nowotworów złośliwych głowy i szyi. W grupie poddanej badaniu było 26 chorych z rakiem krtani. Jednym z ocenianych parametrów było białko Fas. W zaprezentowanych wynikach procent limfocytów CD3+ i subpopulacji CD8+ wykazujący ekspresję Fas+ był większy w grupie chorych poddanych badaniu w porównaniu z wartościami obserwowanymi w grupie kontrolnej. Podobnie Badania Hoffmanna i wsp. [12] przeprowadzone w grupie 37 pacjentach leczonych z powodu nowotworów złośliwych głowy i szyi wykazały większy odsetek limfocytów Fas+ we krwi obwodowej w grupie chorych poddanych badaniu, w porównaniu z odsetkiem Fas+ obserwowanym w grupie kontrolnej. Hoser G. i wsp. [13] w badaniach przeprowadzonych w grupie 18 chorych z wczesnym rakiem płuca także mieli odmienne spostrzeżenia od naszych, stwierdzili bowiem większy odsetek limfocytów z ekspresją Fas w porównaniu z odsetkiem limfocytów Fas+ w grupie kontrolnej. W naszych badaniach zaobserwowaliśmy również istotnie większą ekspresję Fas na limfocytach T CD3+ oraz w subpopulacji CD4+ w grupie chorych będących w I stopniu zaawansowania klinicznego 35
- - - - - 36 Tabela I. kontrolnej Mediana Min. Maks. p Badana Kontrolna Tabela II. Mediana Min. Maks. p Kontrolna Mediana Min. Maks. p Kontrolna Mediana Min. Maks. p Kontrolna Tabela III. Mediana Min. Maks. p Badana Kontrolna
- - - - - raka krtani, w porównaniu z grupami o większym zaawansowaniu choroby (II IV). Uzyskane wyniki mogą świadczyć o większej podatności limfocytów na apoptozę u chorych będących w początkowych okresach choroby. W badaniach własnych nie stwierdzono istotnych różnic w ekspresji Fas na limfocytach krwi obwodowej u chorych z przerzutami do regionalnych węzłów chłonnych w porównaniu z ekspresją Fas w grupie chorych (N-). Rozbieżności w wynikach badań prezentowanych w literaturze, dotyczących ekspresji Fas na limfocytach krwi obwodowej u chorych leczonych z powodu nowotworów złośliwych, mogą wynikać z faktu prowadzenia badań w grupach mało liczebnych, niejednorodnych pod względem stopnia zaawansowania klinicznego choroby czy w końcu być wynikiem stosowania różnych przeciwciał i metod analitycznych. Wspomniane rozbieżności utrudniają przeprowadzenie rzetelnej analizy porównawczej. Jednak uzyskane w badaniach własnych obserwacje zmuszają do głębszego zastanowienia się nad rolą czynników regulujących apoptozę w limfocytach krwi obwodowej na drodze pozareceptorowej (Fas-niezależnej). Cząsteczka FasL prezentowana na aktywowanych limfocytach T jest elementem immunologicznej synapsy dla receptora Fas na powierzchni komórki nowotworowej i jest odpowiedzialna za inicjację procesu apoptozy w komórkach neoplazmatycznych. Jednak efekt końcowy uzależniony jest od stanu całego układu immunologicznego. W badaniach własnych dokonano oceny poziomu ekspresji receptora FasL na powierzchni limfocytów T CD3+ oraz w subpopulacjach limfocytów CD4+ i CD8+. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono mniejszą ekspresję receptora FasL na powierzchni limfocytów w badanej grupie chorych w porównaniu z ekspresją FasL na limfocytach w grupie kontrolnej. Stwierdzono też ujemną korelację ekspresji cząsteczki FasL ze stopniem zaawansowania narządowego raka krtani. Wraz ze wzrostem masy guza ekspresja FasL na limfocytach T krwi obwodowej w badanych subpopulacjach limfocytów była mniejsza. Uzyskane wyniki mogą sugerować coraz mniejszą zdolność limfocytów T do inicjacji apoptozy w komórkach nowotworowych. Z jednej strony w początkowych okresach choroby nowotwór wymyka się spod nadzoru immunologicznego, nasilając apoptozę w komórkach odpornościowych, na co mogą wskazywać wyniki badań Kim i wsp. [11], którzy, analizując grupę pacjentów z nowotworami regionu głowy i szyi, zanotowali zwiększoną apoptozę limfocytów T we krwi na skutek wzmożonej ekspresji proapoptptycznych białek na komórkach jednojądrzastych. Z drugiej natomiast strony układ immunologiczny może reagować wydłużeniem czasu życia limfocytów T, jednak zdolność do unicestwiania komórek nowotworowych jest zmniejszona. Wnioski 1. Przeprowadzone badania wykazały niższą ekspresję Fas i FasL na limfocytach T CD3+, CD4+, CD8+ krwi obwodowej w badanej grupie chorych w porównaniu z ekspresją Fas na limfocytach w grupie kontrolnej. Uzyskane wyniki mogą wskazywać na mniejszą podatność limfocytów na apoptozę, a tym samym wydłużenie czasu ich przeżycia. 2. Poziom ekspresji Fas w subpopulacjach limfocytów T CD3+, CD4+ i CD8+ był znacząco wyższy w grupie chorych będących w I stadium zaawansowania klinicznego raka krtani w porównaniu z grupami o większym zaawansowaniu choroby (Grupy II, III, IV), co może wskazywać na większą aktywację i podatność na apoptozę limfocytów krwi obwodowej u chorych we wczesnym okresie choroby. 3. Wraz ze wzrostem masy guza ekspresja receptora Fas i FasL na limfocytach CD3+, CD4+ i CD8+ była mniejsza. Wykazana ujemna korelacja ekspresji receptora Fas i FasL z zaawansowaniem narządowym choroby może być kolejnym dowodem na to, że wraz z postępem choroby podatność limfocytów krwi obwodowej na apoptozę maleje. 1. Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science. 1995; 267: 1449 1456. 2. Roliński J. Apoptoza w układzie odpornościowym Rola Fas, bcl-2 i interleukiny 2. Post. Biol. Kom. 1979; 24 (4), 561 574. 3. Roliński J. Znaczenie cytokin i ich receptorów w regulacji apoptozy limfocytów u chorych na przewlekłą białaczkę limfatyczną B-komórkową. Rozprawa habilitacyjna AM Lublin 1999. 4. Suda T, Nagata S. Purification and characterization of the Fas ligand that induces apoptosis. J. Exp. Med. 1994; 179: 873 879. 5. Suda T, Takahashi T, Golstein P, Nagata S. Mollecular cloning and expression of the Fas ligand: a nowel member of the tumor necrosis faktory family. Cell 1993; 75: 1169 1178. 6. Villugger A, Egle A, Marschitz I, Kos M, Böck G, Ludwig H, Geley S, Kofler R, Greil R. Constitutive expression of Fas (Apo-1/CD95) ligand on multiple myeloma cells: A potential mechanism of tumor-induced suppression of immune surveillance. Blood 1997; 90: 12 20. 7. Cheng J, Zhou T, Liu C, Shapiro JP, Brauer MJ, Kiefer MC, Barr PJ, Mountz JD. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble from of the Fas molecule. Science 1994; 263: 1759 1762. 8. Mountz JD, Edwards CK. Murine models of autoimmunity: T-cell and B-cell defects. Curr. Opin. Reumatol. 1992; 4: 612 620. 9. Mountz JD, Wu J, Cheng J, Zhou T. Autoimmune disease. A problem of defective apoptosis. Arthritis. Reum. 1994; 37: 1415 1420. 37
- - - - - 38 10. Cardi G, Heaney JA, Schned AR, Ernstoff MS. Exspression 12. Hoffmann TK, Dworacki G, Tsukihiro T, et al. Spontaneus of Fas (APO-1/CD95) in tumor-infiltating and peripheral apoptosis of circulating T lymphocytes In patients with head blood lymphocytes in patients with renal cell carcinoma. and Neck cancer and its clinical importance. Clin. Cancer Cancer Res., 1998, 58: 2078 2080. Res. 2002, 8: 2553 62. 11. Kim JW, Tsukishiro T, Johnson JT, Whiteside TL. Expression of proi antiapoptotic proteins In circulating CD8+ T of Fas receptor on peripheral blond lymphocytes from pa- 13. Hoser G, Wasilewska D, Domagała-Kulawik J. Exspression cells of patients with squamous cell carcinoma of the head tients with non-small cell lung cancer. Folia Histochem Cytobiol. 2004; 42(2): and neck. Clin. Cancer Res. 2004; 10: 5101 5110. 249 52.