metody emisyjne luminescencja - świecenie atomów lub cząsteczek, które nie jest wywołane głównie przez wysoką temperaturę generalnie świecenie zimnych cząsteczek
rodzaje luminescencji (czym wywołana?) fotoluminescencja (fluorescencja, fosforescencja) chemiluminescencja bioluminescencja mechanoluminescencja tryboluminescencja piezoluminescencja elektroluminescencja katodowa (bombardowanie elektronami) radioluminescencja sonoluminescencja
losy cząsteczki wzbudzonej VII III - fluorescencja IV - ISC VI - fosforescencja II, V - relaksacja wibracyjna VII - konwersja wewnętrzna diagram Jabłońskiego
wydajność kwantowa fluorescencji Φ = kwanty emitowane kwanty absorbowane Φ = predysocjacja przejścia międzysystemowe konwersja wewnętrzna wygaszanie stężeniowe O 2 itd. (zderzenia, rezonansowe przeniesienie energii) k i f k i czas życia fluorescencji (τ) typowy: 0,5-20 ns I o I = I 0 e t /τ [ ] [ ] t / τ S = S e 1 1 0 I o /e 0 τ czas
czynniki sprzyjające fluorescencji (zwiększające Φ) - sztywna struktura (preferencja aromat.) - lepkie medium - niskie temperatury - eliminacja wygaszaczy np. tlenu chinina
zasada Francka-Condona przesunięcie Stokesa Intensywność λ
widmo fluorescencji mało zależy od λ wzbudzenia
kuweta do pomiarów absorpcji kuweta do pomiarów fluorescencji
fluorymetria I f = k I 0 ε f cl ε f cl 0,01 c ~ ppm - ppb
fluorescencyjne oznaczanie kationów 8-hydroksychinolina moryna
aminokwasy odpowiedzialne za fluorescencję peptydów i protein mają grupy aromatyczne NH 2 O NH 2 O N H CH 2 C C H OH CH 2 C C H OH HO NH 2 CH 2 C C H O OH π π* dwa pasma: 210-220 nm i 260-280 nm
inne ważne biologicznie związki fluoryzujące również mają grupy aromatyczne R CH 2 CH 3 N N N Mg N N Fe N N CH 2 CH 2 COO- H N H H O CO 2 CH 3 CH 2 CH 2 CO 2 R CH 2 CH 2 COO- żelazoporfiryna (hem) chlorofil (jedna z form) ryboflavina (wit. B 2 )
absorpcja fluorescencja czas życia wydajność (ns) λ (nm) ε λ (nm) kwantowa tryptofan 2,6 280 5 600 348 0,20 tyrozyna 3,6 274 1 400 303 0,14 fenyloalanina 6,4 257 200 282 0,04 rozpuszczalnik aminokwas polipeptyd emisja wydajność emisja wydajność fenyloalanina DMSO * 282 0,02 284 0,006 tyrozyna DMSO 306 0,27 309 0,06 tyrozyna H 2 0 303 0,21 -- -- tryptofan DMSO 340 0,81 333 0,67 tryptofan H 2 0 340 0,19 333 0,02
Tryptofan jest ważną wewnętrzną sondą fluorescencyjną przy 295 nm fluorescencja Trp dominuje nad Phe i Tyr badanie mikrootoczenia w obecności surfaktantów, czynników denaturujących - zmiana otoczenia ekspozycja Trp (pierwotnie w otoczeniu niepolarnym) na środowisko wodne np. w wyniku ogrzewania - przesunięcie batochromowe pasma fluorescencji surfaktant może stworzyć środowisko niepolarne dla Trp - przesunięcie hipsochromowe
napełnianie buforem
sondy fluorescencyjne 2 bromek etidium (interkalator DNA) czerwonopomarańczowa fluorescencja zwiększona intensywność w kompleksie z DNA
Fluorescencyjnie aktywowane sortowanie komórek cytometry przepływowe fluorescencyjne znaczenie komórek znaczniki zależą od użytej lampy lampa UV (366 nm) (zwykle używana do pracy z DNA DAPI 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (niebieski)
Znaczenie przeciwciał fluoroforami po połączeniu z celem wizualizacja
chemiluminescencja luminol + H 2 O 2 katalizatory: związki żelaza (np. hemoglobina), miedzi, cyjanki
- - - - reakcja z O 2 daje nietrwały nadtlenek - - - - - - Dianion w stanie podstawowym (S 0 ) Dianion singletowy (S 1 ) stan wzbudzony Dianion trypletowy (T 1 ) stan wzbudzony wydajność kwantowa ~ 1%
+ H 2 O 2 + barwnik 2 CO 2 + barwnik* barwnik* barwnik + hν
kolor uczulacz niebieski zielony żółtozielony żółty pomarańczowy czerwony 9,10-difenyloantracen 9,10-bis(fenyloetynylo)antracen tetracen 1-chloro-9,10-bis(fenyloetynylo)antracen 5,12-bis(fenyloetynylo)naftacen, rubren, rodamina 6G rodamina B tetracen = naftacen rodamina 6G rodamina B rubren
biały fosfor (odkr.1669) O 2 ; H 2 O P 4 (PO) 2 * + HPO* zielona poświata
NO + O 3 NO 2 * + O 2 badanie czystości powietrza NO 2 * NO 2 + hν O 3 NO ; NO 2 konwerter NO NO 2 * red. NO 2 NO hν fotopowielacz (detektor)
ATP produkt* lucyferaza lucyferyna świetlików wydajność kwantowa 88% produkt + hν 510-670 nm
bioluminescencja planktonu