POLITECHNIKA GDAŃSKA

Transkrypt

1 PLITECHIKA GDAŃSKA WYDZIAŁ CHEMICZY KATEDRA TECHLGII CHEMICZEJ Ćwiczenia laboratoryjne CHEMIA I TECHLGIA MATERIAŁÓW BARWYCH SPEKTRFLURYMETRIA GDAŃSK RK 2011

2 1. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie Studentów z podstawami fizycznymi zjawiska fluorescencji oraz właściwościami fizykochemicznymi substancji wykazujących fluorescencję. Zilustrowane zostaną także czynniki wpływające na intensywność fluorescencji. Studenci zapoznają się z podstawowymi czynnościami i sprzętem stosowanym w analizie ilościowej przy wykorzystaniu spektrofluorymetrii. Zostaną zaprezentowane możliwości wykorzystania odpowiedniego oprogramowania spektrofluorymetru do obróbki uzyskanych danych i prowadzenia pomiarów w różnych trybach. 2. Wprowadzenie 2.1. Informacje ogólne Luminescencją określamy ogólnie promieniowanie, które nie jest pochodzenia termicznego. W zależności od rodzaju wzbudzenia można wyróżnić: fotoluminescencję, katodoluminescencję, radioluminescencję, rentgenoluminescencję, elektroluminescencję, tryboluminescencję, sonoluminescencję, chemiluminescencję, elektrochemiluminescencję oraz bioluminescencję. Fotoluminescencja, będąca tematem ćwiczenia, jest luminescencją wywołaną absorpcją promieniowania świetlnego w zakresie ultrafioletowym i widzialnym. W zależności od czasu pomiędzy pochłonięciem a wyemitowaniem energii wyróżnia się fluorescencję i fosforescencję. Z fluorescencją mamy do czynienia, gdy od pochłonięcia światła przez cząsteczkę do emisji nie upłynęło więcej niż 10-8 s. Jeśli czas pomiędzy pochłonięciem energii a jej emisją jest dłuższy niż 10-8 s mówimy wówczas o fosforescencji. Zjawisko fluorescencji i fosforescencji ilustruje diagram Jabłońskiego. Diagram Jabłońskiego 2

3 Zdolność luminescencji posiada wiele substancji m.in. cząsteczki aromatyczne i heterocykliczne, cząsteczki licznych barwników (np. fluoresceina, eozyna), cząsteczki o znaczeniu biologicznym (aromatyczne aminokwasy, zasady nukleinowe, chlorofil i karotenoidy oraz niektóre witaminy i hormony). Przykłady związków wykazujących fluorescencję zamieszczono poniżej. H 2 C 2 H 5 H 2 CH 3 rywanol -metyloakrydon antracen perylen H (C 2 H 5 ) 2 + (C 2 H 5 ) 2 Cl _ CH CH fluoresceina rodamina B CH=CH 2 CH 3 H CH chinina kumaryna Przykłady związków wykazujących fluorescencję. Świecenie roztworów charakteryzują: - widma absorpcji i emisji - wydajność - czas trwania (czas zaniku świecenia) - anizotropia emisji (polaryzacja). Zależność pomiędzy widmami absorpcyjnymi i emisyjnymi ustalili Stokes i Lommel. Pasmo fluorescencji i jego maksimum są przesunięte w stronę długofalową względem pasma absorpcji i jego maksimum. Dodatkowo stwierdzili, że pasma fluorescencji i absorpcji częściowo się nakrywają. Dodatkowo Stokes stwierdził, że częstość światła fluorescencji jest zawsze mniejsza niż częstość światła wzbudzającego. Reguła Stokesa jest spełniona, gdy stosujemy światło wzbudzające leżące w obszarze widma absorpcji. Gdy fluorescencja jest wzbudzana światłem o częstości w obszarze nakładania się widm absorpcji i fluorescencji reguła Stokesa jest naruszona. 3

4 Cechą charakterystyczną fotoluminescencji jest widmo promieniowania absorbowanego i emitowanego. Pasma absorpcji i fluorescencji wieloatomowych cząsteczek mają się do siebie jak zwierciadlane odbicia. Reguła ta została odkryta przez icholsa i Merrita, a zbadana szczegółowo przez Lewszyna. Ilustruje ją poniższy, bardzo schematyczny, rysunek. Symetria zwierciadlana widm absorpcji i fluorescencji Ścisła symetria zwierciadlana widm absorpcji i fluorescencji jest obserwowana tylko w nielicznych przypadkach. Istnieje wiele czynników, które wpływają na obniżenie wydajności kwantowej fluorescencji danej substancji. W ciekłych roztworach zjawisko to zależy m.in. od: - natury rozpuszczalnika, - temperatury - stężenia substancji luminezującej - natury i stężenia obcych domieszek (tzw. wygaszaczy) - ph. Możemy mówić o zjawiskach statycznego i dynamicznego wygaszania fluorescencji. Procesy statyczne związane są m.in. z asocjacją dwóch lub więcej molekuł substancji w stanie podstawowym. Dimery nie wykazują właściwości fluorescencyjnych. W odróżnieniu od statycznego procesu wygaszania, dynamiczne wygaszanie fluorescencji zależy od prędkości dyfuzji i stężenia substancji luminezującej. Molekuła wzbudzona spotyka się z molekułą gaszącą, niezdolną do fluorescencji. a skutek tego substancja fluoryzująca traci bezpromieniście swoją energię ( traci fluorescencję ). Zależność pomiędzy stężeniem wygaszacza a zmianą intensywności fluorescencji opisuje równanie Sterna-Volmera: 4

5 Io = 1+ K I gdzie: I oraz I o intensywność fluorescencji odpowiednio w obecności i nieobecności substancji wygaszającej, K sv stała Sterna-Volmera, [Q]- stężenie substancji wygaszającej. Z dynamicznym wygaszaniem fluorescencji mamy także do czynienia w niskich temperaturach, gdzie lepkość rozpuszczalnika jest większa, co powoduje mniejszą ruchliwość molekuł aniżeli w wyższych temperaturach. W wielu układach statyczne i dynamiczne gaszenie fluorescencji może zachodzić jednocześnie. Schemat blokowy spektrofluorymetru z ustawieniem prostopadłym detektora ilustruje rysunek poniżej. SV [Q] Aparatura do pomiaru natężenia fluorescencji może różnić się określonymi rozwiązaniami w zależności od producenta. ie mniej jednak zasadniczymi elementami aparatu są: - Źródło promieniowania wzbudzającego: najczęściej lampy rtęciowe i ksenonowe. - Monochromator promieniowania wzbudzającego. Monochromator przepuszcza promieniowanie z zakresu nadfioletu, zatrzymuje natomiast emitowane przez lampę promieniowanie widzialne. - Uchwyt próbek - Monochromator promieniowania emitowanego. Zadaniem tego monochromatora jest przepuszczenie widzialnego promieniowania fluorescencyjnego i zaabsorbowanie promieniowania nadfioletowego, które może być rozproszone w kierunku detektora. 5

6 - Detektor. Jako detektory stosowane są: fotoogniwa, fotokomórki, fotopowielacze elektronowe. Te ostatnie stosowane są w spektrofluorymetrach. Spektrofluorymetr aparat zaopatrzony w siatki dyfrakcyjne. Fluorymetr układ uproszczony, gdzie zastosowano filtry interferencyjne jako monochromatory Charakterystyka metod fluorymetrycznych Spektrofluorymetria opiera się na pomiarze natężenia promieniowania fluorescencyjnego emitowanego po odpowiednim wzbudzeniu substancji badanej. W analityce wykorzystuje się zależność natężenia fluorescencji od stężenia analitu. Co jest oczywiste, metody te mogą być zastosowane do oznaczania substancji wykazujących fluorescencję np. oznaczanie wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych. Znane i stosowane są odczynniki, które zdolne są do selektywnego oddziaływania z analitem (kationy metali, aniony organiczne i nieorganiczne, obojętne cząsteczki, związki biologicznie czynne), w wyniku czego zmienia się obraz fluorescencji: następuje jej wzmocnienie lub wygaszanie. Pomiary fluorescencyjne mają zastosowanie do oznaczania analitów na niskim poziomie stężeń (nawet 0,01 ppm). ie mogą być zastosowane do oznaczania substancji stanowiących podstawowe składniki próbek. Zalety: - duża czułość (przewyższająca metody spektrofotometryczne). - dobra precyzja - dokładność - selektywność. Między innymi z tych powodów w wielu tzw. technikach sprzężonych np. w wysokosprawnej chromatografii stosuje się detektory spektrofluorymetryczne Literatura 1. W. Szczepaniak Metody instrumentalne w analizie chemicznej. PW, W-wa, D. Kealey, P.J. Haines Chemia analityczna. PW, W-wa, T. Pluciński: Doświadczenia chemiczne Wydawnictwo Adamantan, W-wa

7 3. Metodyka badawcza W trakcie ćwiczenia do pomiarów spektrofluorymetrycznych zostanie wykorzystany spektrofluorymetr Aminco Bowman Series Do rejestracji widm absorpcyjnych zostanie wykorzystany spektrofotometr UV-Vis UICAM UV 300 series. Wszystkie pomiary zostaną wykonane w kuwetach kwarcowych o drodze optycznej 1 cm. Roztwory robocze zostaną przygotowane w kolbach miarowych o określonej pojemności z użyciem wody demineralizowanej jako rozpuszczalnika. 4. Wykonanie doświadczeń dczynniki Fluoresceina Jodek potasu Bromek potasu Chinina Rywanol tabletki Kwas siarkowy Wodorotlenek sodu Szkło miarowe (kolby, pipety), gruszki do zasysania roztworów Aparatura Spektrofluorymetr Aminco Bowman Series Wygaszanie fluorescencji fluoresceiny przez jony halogenkowe. a. Przygotować roztwór podstawowy fluoresceiny (ok M) w 0,1 M ah. Przygotować roztwory robocze w kolbach miarowych o pojemności 25 ml przez odpowiednie rozcieńczenie roztworu podstawowego tj. 2 ml roztworu podstawowego. Jeden z roztworów uzupełnić do kreski wodą demineralizowaną. b. Zarejestrować widmo absorpcyjne fluoresceiny. a tej podstawie określić parametry pomiaru widma emisyjnego (długość fali wzbudzenia). c. Zarejestrować widmo emisyjne fluoresceiny. d. Przygotować 0,5 M roztwór jodku potasu (25 ml) w wodzie. e. Przygotować serię roztworów (kolby miarowe 25 ml) zawierających 2 ml roztworu podstawowego fluoresceiny oraz kolejno: 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5 ml 0,5 M roztworu jodku potasu. 7

8 f. Przygotować 0,5 M roztwór chlorku/bromku potasu (wskaże prowadzący ćwiczenie). Przygotować analogiczną serię roztworów jak w przypadku jodku potasu. Zarejestrować widma emisyjne dla przygotowanych roztworów Wygaszanie stężeniowe. Sporządzić roztwór rywanolu w wodzie (tabletka 100 mg w 1 l ciepłej wody). 10 ml, 1 ml oraz 0,1 ml przygotowanego roztworu rywanolu rozcieńczyć do 100 ml wodą. Porównać intensywność świecenia poszczególnych roztworów w świetle ultrafioletowym. Zarejestrować widmo absorpcyjne roztworu rywanolu. kreślić długość fali wzbudzenia i zarejestrować widmo emisyjne. Porównać widma emisyjne roztworów o różnych stężeniach Intensywność fluorescencji a ph Przyłączenie lub odszczepienie protonu może wpływać na zmianę właściwości spektroskopowych w tym także fluorescencji. Wpływ ph na właściwości fluorescencyjne zostanie zilustrowany na przykładzie roztworu chininy. We wskazanych fiolkach umieścić przygotowany roztwór chininy. Do jednego z roztworów dodać 1 ml roztworu ah. Porównać fluorescencję obu roztworów w świetle lampy UV. astępnie do zalkalizowanego roztworu dodawać kroplami (nie mieszając) roztwór kwasu siarkowego. bserwować zmianę fluorescencji w świetle ultrafioletowym. 5. pracowanie wyników 5.1. Wygaszanie fluorescencji fluoresceiny przez jony halogenkowe. a podstawie przeprowadzonych pomiarów ocenić zdolność wygaszania fluorescencji fluoresceiny przez odpowiednie jony halogenkowe wykorzystując równanie Sterna-Volmera. Wyznaczyć stałą wygaszania. Przeprowadzić dyskusję wyników. dpowiedzi uzasadnić Wygaszanie stężeniowe. Wyjaśnić wpływ stężenia substancji fluoryzującej na intensywność fluorescencji. dpowiedź uzasadnić Intensywność fluorescencji a ph Wyjaśnić wpływ ph na zmianę fluorescencji roztworu chininy. dpowiedź uzasadnić ilustrując ją odpowiednimi wzorami. 8