(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11)

RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 186517 (21 ) Numer zgłoszenia: 322504 (22) Data zgłoszenia: 26.02.1996 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 26.02.1996, PCT/AU96/00098 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 03.10.1996, W096/30503, PCT Gazette nr 44/96 (13) B1 (51) IntCl7 C12N 9/96 C12Q 1/52 C12Q 1/58 (54)Odczynnik i sposób określania stężenia analitu w próbce płynu ciała (30) Pierwszeństwo: 28.03.1995,AU,PN2006 (73) Uprawniony z patentu: THERMO TRACE Ltd., Clayton, AU (43) Zgłoszenie ogłoszono: 02.02.1998 BUP 03/98 (72) Twórcy wynalazku: Joseph De Giorgio, Clayton, AU W ayne Jensen, Clayton, AU (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.01.2004 WUP 01/04 (74) Pełnomocnik: Witek Rafał, POLSERVICE (57)1. Odczynnik do mierzenia stężenia analitu u pacjenta polegającego na pomiarze stopnia utlenienia koenzymu, znam ienny tym, że zawiera układ redukujący koenzym składający się z pary enzym i substrat, przy czym stopień specyficzności między enzymem i substratem jest mniejszy niż 50% w oparciu o równoważność molową umożliwiając stałą regenerację koenzymu w trakcie przechowywania odczynnika, natomiast analit jest wybrany z grupy zawierającej transaminazę, transaminazę asparaginianową, transaminazę alaninową, moczniki amoniak. PL 186517 B1

Odczynnik i sposób określania stężenia analitu w próbce płynu ciała Zastrzeżenia patentowe 1. Odczynnik do mierzenia stężenia analitu u pacjenta polegającego na pomiarze stopnia utlenienia koenzymu, znamienny tym, że zawiera układ redukujący koenzym składający się z pary enzym i substrat, przy czym stopień specyficzności między enzymem i substratem jest mniejszy niż 50% w oparciu o równoważność molową umożliwiając stałą regenerację koenzymu w trakcie przechowywania odczynnika, natomiast analit jest wybrany z grupy zawierającej transaminazę, transaminazę asparaginianową, transaminazę alaninową, mocznik i amoniak. 2. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomnianą parą enzym/substrat jest dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa/d-glukoza. 3. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że jest w postaci jednej fiolki. 4. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że ciągła regeneracja koenzymu zachodzi z prędkością w zakresie 0,01-0,9 mabs/minutę przy 340 nm, w temperaturze 18-25 C. 5. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że enzym jest enzymem mikrobiologicznym. 6. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że stopień specyficzności między wspomnianym enzymem i wspomnianym 2 substratem jest mniejszy niż 10% w oparciu o równoważność molową. 7. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że gdy analitem jest transaminaza alaninowa zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, L-alaninę, dehydrogenazę L-mleczanową (LDH), dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH), K2HPO4, 2-oksoglutaran oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HCl, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu. 8. Odczynnik według zastrz. 7, znamienny tym, że posiada skład określony w tabeli 1, korzystnie określony w tabeli 2. 9. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że gdy analitem jest transaminaza asparaginianowa zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, L-asparaginian, dehydrogenazę L-mleczanową (LDH), dehydrogenazę maleinianową (MDH), dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH), K2HPO4, 2-oksoglutaran oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu. 10. Odczynnik według zastrz. 8, znamienny tym, że posiada skład określony w tabeli 3, korzystnie określony w tabeli 4. 11. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że gdy analitem jest mocznik zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, ureazę, a-ketoglutaran, fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH), K2HPO4, dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH), oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HCl, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu. 12. Odczynnik według zastrz. 10, znamienny tym, że posiada skład określony w tabeli 5A, korzystnie określony w tabeli 5B. 13. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że gdy analitem jest amoniak zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, a-ketoglutaran, fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH), K2HPO4, dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH), oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HCl, EDTA-disodowy, ADP-K, albuminę surowicy bydlęcej i azydek potasu. 14. Odczynnik według zastrz. 12, znamienny tym, że posiada skład określony w tabeli 6A, korzystnie określony w tabeli 6B. 15. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że analitem jest transaminaza.

186 517 3 16. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest transaminaza. 17. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest transaminaza asparaginianowa. 18. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest transaminaza alaninowa. 19. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest mocznik. 20. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest amoniak. 21. Sposób określania stężenia analitu w próbce płynu ciała, znamienny tym, że próbkę płynu ciała kontaktuje się z odczynnikiem zawierającym koenzym i mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym odczynnik zawierający wspomniany koenzym stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzym składający się z pary enzym i substrat, przy czym wspomniany enzym wykazuje niepełną specyficzność wobec wspomnianego substratu, a stopień specyficzności między wspomnianym enzymem i wspomnianym substratem jest mniejszy niż 50% w oparciu o równoważność molową umożliwiając stałą regenerację koenzymu w trakcie przechowywania odczynnika, natomiast wspomniany analit wybiera się z grupy zawierającej transaminazę, transaminazę asparaginianową, transaminazę alaninową, mocznik i amoniak. 22. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że stosuje się odczynnik w postaci jednej fiolki. 23. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że ciągła redukcja koenzymu zachodzi z prędkością w zakresie 0,01-0,9 mabs/minutę przy 340 nm, w temperaturze 18-25 C. 24. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że stosowanym enzymem jest enzym mikrobiologiczny. 25. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że stosowaną parą enzym/substrat jest dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa/d-glukozę. 26. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że stopień specyficzności między enzymem i substratem jest mniejszy niż 10% w oparciu o równoważność molową. 27. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że analitem jest transaminaza. 28. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że transaminaząjest transaminaza asparaginianowa. 29. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że transam inaząjest transaminaza alaninowa. 30. Odczynnik według zastrz. 20, znamienny tym, że analitem jest mocznik. 31. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest amoniak. * * * Wynalazek ten dotyczy odczynników stosowanych w enzymatycznych metodach określania stężenia analitów w próbce płynu ciała. W szczególności, wynalazek ten dotyczy odczynników stosowanych w metodach, w których ilość utlenionego koenzymu w próbce, w której zachodzi reakcja, odpowiada bezpośrednio stężeniu analitu obecnego w próbce. Wynalazek dotyczy także ulepszonych sposobów przeprowadzania określenia stężenia analitu. Anality, które można określić przy użyciu odczynników według wynalazku, obejmują transaminazy, amoniak, mocznik, dehydrogenazę mleczanową, triglicerydy oraz salicylany. Aminotransferaza asparaginianowa jest enzymem którego wysoki poziom znajduje się w sercu, wątrobie, w krwinkach czerwonych i mięśniach szkieletowych. Katalizuje on następującą reakcję: asparaginian + 2-oksoglutaran <-> szczawiooctan + glutaminian Podwyższony poziom aminotransferazy asparaginianowej w surowicy stwierdza się w wielu chorobach wątroby, gdzie zachodzi niszczenie komórek wątroby, zwłaszcza np. w zapaleniu wątroby. Wyższe poziomy są także notowane po zawale mięśnia sercowego i przy chorobie mięśni.

4 186 517 Enzym aminotransferaza alaninowa znajduje się także w wysokich stężeniach w wątrobie i w mniejszym stopniu w sercu, nerkach i mięśniach szkieletowych. Katalizuje on następującą reakcję: alanina + 2-oksoglutaran <-> pirogronian + glutaminian Wzrosty poziomu tego enzymu w surowicy stwierdza się zazwyczaj w schorzeniach wątroby, zwłaszcza w zapaleniu wątroby. Pośrednie określenie ilościowe enzymów, w szczególności transaminaz aminotransferazy asparaginianowej i aminotransferazy alaninowej w próbce płynów ciała, może dotyczyć, w przeciwieństwie do próbki ślepej, w której miała miejsce przemiana enzymatyczna analitu związanego z interesującym enzymem. Aby dokonać enzymatycznej konwersji analitu, specyficzny dla substratu enzym (transaminazę), pozostawia się pod działaniem substratów enzymu znanego, jako użytecznego w kwantyfikacji interesującego enzymu. Zmianę w układzie reakcji, biorąc pod uwagę próbkę ślepą, można kalkulować różnymi metodami, mierzącymi zmianę w absorbancji układu. Zmiana w absorbancji koreluje bezpośrednio z ilością transaminazy obecnej w próbce. Chociaż metody tradycyjne, takie jak określanie kolorymetryczne, rozwinęły się odpowiednio, analiza enzymatyczna okazała się w ogromnej mierze bardziej dokładna, niezawodna i prosta od tych innych metod, jeśli chodzi o określanie poziomu transaminazy. Powszechnie stosowana metodą kwantyfikacji transaminazy w próbce jest użycie sprzężonej reakcji enzymatycznej w sposób kinetyczny. W przypadku aminotransferazy asparaginianowej (AST), szczawiooctan utworzony przez AST ulega przemianie do maleinianu, przez włączenie dehydrogenazy maleinianowej (MDH) w układ oznaczenia. Towarzyszy temu utlenienie koenzymu dinukleotydu nikotynamido- -adeninowego (NADH do NAD4), co można śledzić spektrofotometrycznie, przy 340 nm. w ten sposób sekwencja reakcji jest zazwyczaj następująca: L-asparaginian + 2-oksoglutaran < AST > szczawiooctan + L-glutaminian szczawiooctan + NADH < ---> L-maleinian + NAD+ pirogronian z próbki + NADH < > mleczan + NAD+ Od trzeciej reakcji oczekuje się eliminacji możliwej obecności wysokich poziomów pirogronianu w próbkach pacjenta. Teoria opóźnienia włączenia wysokich poziomów enzymu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) jest taka, że jeśli włącza się wysoki poziom do odczynnika, w wypadku gdy próbka pacjenta posiada wysoki poziom pirogronianu, obecność NADH i LDH szybko wyeliminuje pirogronian z próbki przez przemianę go do mleczanu, nie ingerującego w reakcję. Potrzeba obciążenia odczynnika LDH, w celu eliminacji tej pobocznej reakcji, może wpłynąć na stabilność odczynnika przez wprowadzenie więcej zanieczyszczeń. Dla aminotransferazy alaninowej (ALT), szczawiooctan utworzony przez ALT ulega przemianie do mleczanu, przez wprowadzenie dehydrogenazy mleczanowej do mieszaniny reakcyjnej. Towarzyszy temu utlenienie koenzymu NADH do NAD+, które znowu można śledzić spektrofotometrycznie, przy 340 nm. w ten sposób sekwencja reakcji przeprowadzana z użyciem odczynnika, jest następująca: L-alanina + 2-oksoglutaran <..ALT > pirogronian + glutaminian pirogronian + NADH < LD- > mleczan + NAD+ pirogronian z próbki + NADH mleczan + NAD+ Teoria i metodologia pomiaru ALT jest podobna do odczynnika AST z wyjątkiem tego, że przy ALT do pomiaru wymagany jest tylko jeden enzym endogeniczny, dokładnie LDH (w przeciwieństwie do AST, gdzie wymagane są LDH i MDH). Do odczynników ALT wprowadza się mniej zanieczyszczeń jako takich, co generalnie oznacza, że ich odtworzona przechowalność może być nieco dłuższa niz odczynników AST.

186 517 5 Dla obu odczynników tempo tworzenia NAD+ koreluje ze stężeniem transaminazy pierwotnie obecnej w próbce. Mocznik jest głównym produktem metabolicznym, zawierającym azot, w katabolizmie białek, syntetyzowanym w wątrobie przez enzymy wątrobowe wątroby, i wydzielanym przede wszystkim przez nerki. Podniesione poziomy mocznika w surowicy mogą być konsekwencją upośledzenia funkcji nerek, choroby wątroby, zmian w diecie, zastoinowej niewydolności serca, cukrzycy i infekcji. Poziom mocznika w ludzkiej surowicy i moczu można wykrywać metodami bezpośrednimi i pośrednimi. Metody bezpośrednie zwykle dotyczą odmian reakcji Fearona. W tym układzie reakcyjnym, diacetyl reaguje z mocznikiem, aby utworzyć chromogen diazyne, który można mierzyć spektrofotometrycznie, dzięki jego silnej absorbancji przy 540 nm. Najbardziej powszechna metoda pomiaru mocznika w ludzkiej surowicy i moczu dotyczy układu pośredniej sprzężonej reakcji enzymatycznej. Ureazę, pierwszy enzym w układzie reakcyjnym, stosuje się do przemiany mocznika w amoniak i jony wodorowęglanowe. Dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH), dru^i enzym w układzie reakcyjnym sprzęga NADH i jon amonowy, w celu wytworzenia NAD i glutaminianu. Reakcję tę śledzi się spektrofotometrycznie przy 340 nm, gdy NADH ulega przemianie do NAD+. Alternatywnie, można kwantyfikować jon amonowy, przez potencjometrię lub konduktometrię. W ten sposób proces reakcyjny zwykle stosowany do określania stężenia mocznika jest następujący: Mocznik + H20 > 2NH3 + C 0 2 NH3 + a-ketoglutaran + NADH GLDH > L-glutaminian + NAD+ Mierzy się obniżenie absorbancji przy 340 nm, gdy NADH przechodzi w NAD+ i jest ono proporcjonalne do stężenia mocznika w pierwotnej próbce. Głównym źródłem krążącego amoniaku jest przewód pokarmowy. Amoniak metabolizowany jest w wątrobie, ulega przemianie do mocznika w cyklu mocznikowym. Podniesiony poziom amoniaku w ludzkiej surowicy jest najczęściej związany z zaawansowaną chorobą wątroby. Hiperamonemia wywiera toksyczny wpływ na centralny układ nerwowy. Poziom amoniaku w ludzkiej surowicy mierzy się najczęściej bezpośrednią jednoetapową metodą enzymatyczną, obejmującą dehydrogenazę glutaminianową. W tej reakcji, przemianę amoniaku, a-ketoglutaranu i NADH (lub NAPH) w glutaminian i NAD+ (lub NADP+) mierzy się spektrofotometrycznie przy 340 nm. Powszechnie stosowana sekwencja reakcji, do określania stężenia amoniaku w próbce, jest następująca: NH3 + a-ketoglutaran + NADPH GLDH > L-glutaminian + NADP+ Mierzy się zmniejszenie absorbancji przy 340 nm, gdy NADPH przechodzi w NADP+, i jest ono proporcjonalne do stężenia amoniaku w próbce pacjenta. W przeszłości, jak wspomniano powyżej, odczynniki z transam inazą obarczone były słabą odtw orzoną stabilnością. Stabilność tych odczynników, zw łaszcza w form acie pojedynczej fiolki, ograniczona je st zwykle do około jednego m iesiąca m aksym alnie, w w a- runkach schłodzenia. Powód tej niestabilności można by przypisać zarówno degeneracji składników endogennych, ja k i niestabilności NADH w roztworze. Główne pow ody niestabilności NADH w roztworze wiążą się bezpośrednio z obecnością endogenicznych enzymów odczynnikowych, mianowicie LDH i M DH w odczynniku A ST i LDH w odczynniku ALT. Handlowe preparaty enzymów endogenicznych M DH i LDH, czy to pochodzenia zwierzęcego, czy drobnoustrojowego, zaw ierają zanieczyszczenia, które ostatecznie wpływają na odtw orzoną stabilność NADH i w konsekw encji stabilność odczynników. Zanieczyszczeniami tymi są zazwyczaj niskie poziom y AST i ALT, enzymy pożądane do pomiaru, oraz oksydaza NADH, z których wszystkie inicjują utlenienie NADH w odczynniku. ph odczynnika także może mieć wpływ na niestabilność NADH, ponieważ NADH będzie się szybko rozpadać w roztworze, zwłaszcza w środowisku kwaśnym. Większość od-

6 186 517 czynników do określania transaminazy, wytwarza się się przy zakresie ph 7,3-8,0. Bardziej zasadowy odczynnik, większa stabilność NADH w roztworze. Ponadto, odczynniki amoniakowe i mocznikowe także obarczone są problemami ze stabilnością i stabilność tych odczynników w formacie pojedynczej fiolki oraz w niskich temperaturach, zwykle ogranicza się do maksimum jednego miesiąca w przypadku amoniaku, i dwóch miesięcy w przypadku mocznika. Powód tej niestabilności mógłby być związany z rozpadem endogenicznych składników w odczynnikach, niestabilnością NADH lub NADPH w roztworze i zanieczyszczeniem amoniakiem, obecnym w wodzie, użytej do odtworzenia proszku odczynników. Główne powody niestabilności NADH lub NADPH w roztworze w iążą się bezpośrednio z obecnością endogenicznych enzymów odczynnikowych. ph odczynnika także może mieć wpływ na niestabilność NADH lub NADPH, jako, że NADH i NADPH będą się szybko rozpadać w roztworze, zwłaszcza w środowisku kwaśnym. NADPH powszechnie używa się w odczynnikach amoniakowych (chętniej niż NADH), w celu przezwyciężenia ingerencji w test przez endogeniczną dehydrogenazę mleczanową w surowicach pacjentów. Endogeniczną dehydrogenaza mleczanowa i pirogronian z próbek pacjentów będzie specyficznie reagować z NADH w następującej sekwencji reakcji: pirogronian z próbki + NADH < > mleczan + NAD+ Na utrzymanie NAPH w roztworze będzie także miała wpływ obecność zanieczyszczeń w handlowych preparatach dehydrogenazy glutaminianowej, które zapoczątkowują utlenianie NAPH w odczynniku amoniakowym. Podobnie, obecność zanieczyszczeń handlowych preparatów ureazy i dehydrogenazy glutaminianowej, będzie inicjować utlenianie NADH w odczynniku mocznikowym. Jednym ze środków przezwyciężenia tej trudności, związanej ze stabilnością NADH i NADPH w roztworze, było wytworzenie zredukowanego koenzymu w odczynniku, tuż przed jego użyciem. Jeden taki sposób opisano w australijskim zgłoszeniu patentowym AU-A-61906/90 dla F. Hoffmann La Roche AG, nawiązując szczególnie do podobnych układów enzymatycznych do pomiaru wodorowęglanu i amoniaku w surowicy. W tym opisie zredukowany koenzym wytwarza się in situ, albo równocześnie, albo przed ponownym utlenieniem koenzymu przez analit, substrat i specyficzne enzymy. Osiąga się to przez włączenie do mieszaniny reakcyjnej enzymu i substratu enzymu, umożliwiając redukcję utlenionego koenzymu. Specyficzną reakcją ujawnioną i opisaną dzięki uprzejmości F. Hoffmann La Roche AG jest: NADH' + Glukozo-6-fosforan (G-6-P ) H+ + NADH + 6-fosfoglukonolakton Dehydrogenaza Glukozo-6-fosforanu (G-6-P) Udostępnia to zredukowany dinukleotyd nikotynamidoadenozynowy. Problemem związanym z tym sposobem wytwarzania NADH jest to, że stabilna konfiguracja odczynnika dla pojedynczej fiolki, nie jest możliwa. Do pewnego stopnia F. Hoffmann La Roche AG pokonał ten problem, przez podzielenie układu odczynników na 2 fiolki. Pierwszy odczynnik obejmuje w przypadku kwantyfikacji amoniaku, NADP+ i G-6-P, a drugi odczynnik a-ketoglutaran, G6PDH i GLDH. Reakcja określania przebiega więc następująco:

186 517 7 Odczynnik 1 NADP+ + G-6-P Odczynnik 2 a-ketoglutaran + G-6-PD + GLDH < - (A)---dodana surowica pacj enta dodana surowica (B) pacjenta V koenzym zredukowany V koenzym utleniony gdzie (A) i (B) oznaczają alternatywne, równoważne drogi. Jednakże trudności w tym układzie odczynników pozostają. Poza faktem, że dwie fiolki z odczynnikiem wymagają większych kosztów, zapasów i strat, wymagane są bardzo dokładne poziomy glukozo-6-fosforanu, a ponadto układ ogranicza użycie szczególnych chemicznych analizerów. Gdy odczynniki połączy się, wytworzenie NADH z NAD+ ma miejsce przez wyczerpanie glukozo-6-fosforanu. Ponieważ glukozo-6-fosforan w ten sposób wyczerpuje się, na stabilność połączonych odczynników poważny wpływ miałoby, jeśli dwa odczynniki miałyby być połączone, lecz nie od razu użyte. Jeśli poziomy glukozo-6-fosforanu są niedokładne lub nadmierne, czas związany z inkubacją odczynnika staje się krytyczny. Rezultatem tego mogą być fałszywie niskie zmiany absorbancji i rażąco niedokładne wyniki. Wcześniejszym roztworem także związanym z pomiarem poziomów analitów opisanym w opisie patentowym US 4 394 449 dla Modrovicha, stosuje pary substrat/enzym, w celu wytworzenia zredukowanego koenzymu tak, jak w roztworze Roche'a, jednkaże w tym wypadku głukozo-6-fosforan wytwarza się z glukozy zgodnie z następującym: D-glukoza + ATP heksokinaza > ADP+ glukozo-6-fosforan NAD+ reaguje następnie z utworzonym glukozo-6-fosforanem w obecności enzymu dehydrogenazy glukozo-6- fosforanu, aby wytworzyć NADH. Modrovich włącza także do preparatu zarówno NADH jak i NAD+ tak, że gdy NADH utleni się lub zniszczy, NAD+ obecny w odczynniku, pomoże regenerować NADH. Jest to także odczynnik dwufiolkowy. Wcześniejszej alternatywy dostarcza Klose i in., w opisie patentowym US 4 019 961. Wynalazek ten polega na etapach różnych oddzielnych reakcji i układzie regeneracji enzymatycznej. Układ ten ma tę wadę, że polega na przeprowadzeniu etapów różnych reakcji i etapów separacji, co czyni go testem zużywającym czas. Ponadto, ten układ odczynników jest odpowiedni tylko dla substratów, które można fosforylować. Generalnym problemem związanym z mechanizmem wytworzenia NADH i NADPH adoptowanym przez każdy z opisanych tu powyżej wynalazków, czyli NAD+ + glukozo-6-fosforan ~6~pp --» NADH + 6-fosfoglukonolakton + H+ jest to, ze pojedynczy etap reakcji z użyciem jednej fiolki jest niemożliwy, ponieważ gdy tylko doda się surowicy pacjenta do odczynnika, zachodzą dwie równoczesne reakcje: (a) obniżenie absorbancji z powodu przemiany NADH (lub NADPH) w NAD+ (NADP+),

8 186 517 (b) wytworzenie NADH (NADPH) z NAD+ (NADP+) co daje w wyniku wzrost absorbancji. Te dwie reakcje zachodzą z podobnymi prędkościami z rezultatem netto, będącym fałszywie niską zm ianą absorbancji i rażąco niedokładnymi wynikami. W związku z tym, celem tego wynalazku jest dostarczenie układu odczynników do stosowania przy określaniu poziomów analitów w surowicy, co zasadniczo udoskonali problemy układów odczynników z wcześniejszego stanu wiedzy, stosowanych w analizie enzymatycznej poziomów analitów w surowicy, polegających na utlenieniu koenzymu, szczególnie tych problemów, które dotyczą endogenicznych lub egzogenicznych zanieczyszczeń odczynnika. Dalszym celem tego wynalazku jest dostarczenie ulepszonego sposobu określania stężenia poziomów analitów w próbce pacjenta, sposobu zwalczania problemów, związanych z metodami z wcześniejszego stanu wiedzy, włączając przedwczesne utlenienie determinanta koenzymu, oraz konieczność układu wielu fiolek, aby zminimalizować degradację odczynnika. Istota wynalazku. Tak określone cele zostały zrealizowane w niniejszym wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest odczynnik do mierzenia stężenia analitu u pacjenta polegającego na pomiarze stopnia utlenienia koenzymu charakteryzujący się tym, że zawiera układ redukujący koenzym składający się z pary enzym i substrat, przy czym stopień specyficzności między enzymem i substratem jest mniejszy niż 50% w oparciu o równoważność molową umożliwiając stałą regenerację koenzymu w trakcie przechowywania odczynnika, natomiast analit jest wybrany z grupy zawierającej transaminazę, transaminazę asparaginianową, transaminazę alaninową, mocznik i amoniak. Korzystnie wspomnianą parą enzym/substrat jest dehydrogenaza glukozo- 6-fosforanowa/D-glukoza. Korzystnie odczynnik według wynalazku jest w postaci jednej fiolki. Korzystnie ciągła regeneracja koenzymu zachodzi z prędkością w zakresie 0,01-0,9 mabs/minutę przy 340 nm, w temperaturze 18-25 C. Korzystnie enzym jest enzymem mikrobiologicznym. Korzystnie stopień specyficzności między wspomnianym enzymem i wspomnianym substratem jest mniejszy niz 10% w oparciu o równoważność molową. Korzystnie, gdy analitem jest transaminaza alaninowa zawiera dehydrogenazę glukozo- 6-fosforanową, D-glukozę, L-alaninę, dehydrogenazę L-mleczanową (LDH), dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH), K2HPO4, 2-oksoglutaran oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu. w korzystnej realizacji takiego odczynnika posiada on skład określony w tabeli 1, korzystniej określony w tabeli 2. Korzystnie, gdy analitem jest transaminaza asparaginianowa zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, L-asparaginian, dehydrogenazę L-mleczanową (LDH), dehydrogenazę maleinianową (MDH), dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH), K2HPO4, 2-oksoglutaran oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu. w korzystnej realizacji takiego odczynnika posiada on skład określony w tabeli 3, korzystnie określony w tabeli 4. Korzystnie, gdy analitem jest mocznik zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, ureazę, a-ketoglutaran, fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH), K2HPO4, dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH), oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu. w korzystnej realizacji takiego odczynnika posiada on skład określony w tabeli 5A, korzystnie określony w tabeli 5B. Korzystnie, gdy analitem jest amoniak zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, a-ketoglutaran, fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH), K2HPO4, dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH), oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, ADP-K, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu. W korzystnej realizacji takiego odczynnika posiada on skład określony w tabeli 6 A, korzystnie określony w tabeli 6B. W korzystnej realizacji odczynnika według wynalazku analitem jest transaminaza. Korzystnie analitem jest transaminaza asparaginianowa. Równie korzystnie analitem jest transa-

186 517 9 minaza alaninowa. Równie korzystnie analitem jest mocznik. Równie korzystnie analitem jest amoniak. Przedmiotem wynalazku jest także sposób określania stężenia analitu w próbce płynu ciała charakteryzujący się tym, że próbkę płynu ciała kontaktuje się z odczynnikiem zawierającym koenzym i mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym odczynnik zawierający wspomniany koenzym stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzym składający się z pary enzym i substrat, przy czym wspomniany enzym wykazuje niepełną specyficzność wobec wspomnianego substratu, a stopień specyficzności między wspomnianym enzymem i wspomnianym substratem jest mniejszy niż 50% w oparciu o równoważność molową umożliwiając stałą regenerację koenzymu w trakcie przechowywania odczynnika, natomiast wspomniany analit wybiera się z grupy zawierającej transaminazę, transaminazę asparaginianową, transaminazę alaninową, mocznik i amoniak. Korzystnie stosuje się odczynnik w postaci jednej fiolki. Korzystnie ciągła redukcja koenzymu zachodzi z prędkością w zakresie 0,01-0,9 mabs/minutę przy 340 nm, w temperaturze 18-25 C. Korzystnie stosowanym enzymem jest enzym mikrobiologiczny. Korzystnie stosowaną parą enzym/substrat jest dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa/d-glukozę. Korzystnie stopień specyficzności między enzymem i substratem jest mniejszy niż 10% w oparciu o równoważność molową. Korzystnie analitem jest transaminaza, korzystnie transaminazą jest transaminaza asparaginianowa, albo transaminaza alaninowa. Korzystnie analitem jest mocznik, albo amoniak. Szczegółowy opis wynalazku Dostarcza się odczynnika do enzymatycznego określania stężenia analitu u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przechowywania wspomnianego odczynnika. Dostarcza się także odczynnika do enzymatycznego określania stężenia transaminazy u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przechowywania wspomnianego odczynnika. Dostarcza się także odczynnika do enzymatycznego określania stężenia transaminazy asparaginianowej u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przechowywania wspomnianego odczynnika. Dostarcza się także odczynnika do enzymatycznego określania stężenia aminotransferazy alaninowej u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przechowywania wspomnianego odczynnika. Dostarcza się także odczynnika do enzymatycznego określania stężenia mocznika u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przechowywania wspomnianego odczynnika. Dostarcza się także odczynnika do enzymatycznego określania stężenia amoniaku u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przechowywania wspomnianego odczynnika. W szczególnej realizacji układ redukujący koenzymu obejmuje enzym i substrat, przy czym wspomniany enzym posiada niecałkowitą specyficzność dla wspomnianego substratu,

10 186 517 wynikiem czego jest zredukowany współczynnik reaktywności wzajemnej. Odczynnik taki występuje w konfiguracji pojedynczej fiolki. W tym szczegółowym opisie, term in,»niecałkowita specyficzność stosuje się ze względu na pary enzym i substrat, w którym wybrany substrat nie jest naturalnym substratem wybranego enzymu, a więc ma mniej niż 100% specyficzności wzajemnej dla enzymu, o który chodzi. Wynalazek ten opiera się na odkryciu, że przez sprzężenie enzymu i substratu o niecałkowitej specyficzności w stosunku do siebie, tempo redukcji koenzymu jest poważnie spowolnione. Przez spowolnienie reakcji redukcji, podstawowe składniki odczynnika mogą być zawarte w jednej fiolce do przechowywania, zawartość stabilizuje się przeciw zanieczyszczeniom przez niski poziom ciągłej regeneracji koenzymu. Przez spowolnienie procesu, regeneracja NADH i NADPH może zachodzić bez wpływu na pomiar analitów. Regeneracja może zachodzić w odczynniku nie będącym w użyciu i prędkość, z jaką zachodzi regeneracja, może być doskonale dostrojona przez wyregulowanie charakteru wybranej pary enzym/substrat i jej poziomu. W kolejnej postaci realizacji wynalazku, dostarcza się odczynnika do stosowania w enzymatycznym określaniu stężenia analitu u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, charakteryzującego się tym, że wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić regenerację wspomnianego koenzymu z prędkością 0,01-0,9 mabs/minutę, przy 340 nm. Korzystnie tempo regeneracji odczynnika zgodnie z tym aspektem wynalazku wynosi 0,05-0,4 mabs/minutę, a najkorzystniej tempo regeneracji wynosi 0,05-0,25 mabs/minutę w temperaturze pokojowej (18-25 C) i przy 340 nm. W zalecanej postaci realizacji wynalazku stopień specyficzności między substratem i enzymem układu redukującego koenzymu, wynosi korzystnie mniej niż 100%, korzystniej mniej niż 50%, a najkorzystniej mniej niż 10% w oparciu o równoważność molową. Optymalnie, można stosować parę enzym/substrat posiadającą reaktywność wzajemną mniejszą niż 5% w oparciu o równoważność molową. Koenzymami stosowanymi w odczynniku według wynalazku są zredukowany dinukleotyd nikotynamido-adeninowy (NADH) i zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH), chociaż odpowiednie mogą być także analogi koenzymu, takie jak fosforan dinukleotydu nikotynamido-hipoksantynowego lub tionadh. Niespodziewanie, odkryto, że odczynniki według wynalazku dostarczają dalszych korzyści, szczególnie jeśli chodzi o odczynniki amoniakowe i mocznikowe. Poziomy NADH i/lub NADPH będą wyczerpywane w odczynnikach amoniakowych i mocznikowych, przez obecność zanieczyszczenia amoniakowego, wprowadzonego z wodą używaną do odtworzenia proszku odczynników. Podobnie, amoniak z powietrza, który rozpuszcza się w ciekłym odczynniku mocznikowym/amoniakowym z upływem czasu, będzie wyczerpywał poziomy NADH i/lub NADPH. Obecność zanieczyszczającego amoniaku w odczynniku amoniakowym i mocznikowym, może prowadzić nie tylko do niedokładnych określeń mocznika i amoniaku, lecz może oznaczać, że reakcja z a-ketoglutaranem i NADH w obecności GLDH, zajdzie przed dodaniem próbek. Prowadzi to do wyczerpania poziomów NADH lub NADPH i w ten sposób do błędów w określaniu stężeń amoniaku i mocznika w próbkach. Jednakże, niniejszy wynalazek pozwala na usunięcie zanieczyszczeń amoniakiem, a także na regenerację NADH lub NADPH, aby umożliwić dokładne określenie stężenia amoniaku i mocznika w próbkach pacjentów. Enzymami korzystnie wykorzystywanymi w układzie redukcyjnym koenzymu przy określaniu zawartości transaminazy w próbce surowicy, mogą być dehydrogenaza glukozo-6- fosforanowa (G-6-P-DH) lub dehydrogenaza glukozowa. Enzymami korzystnie wykorzystywanymi w układzie redukcyjnym koenzymu przy określaniu zawartości mocznika lub amoniaku w próbce surowicy, mogą być dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa (G-6-P-DH) lub dehydrogenaza glukozowa.

186 517 11 Odpowiednie m ogą być także enzymy, takie jak dehydrogenaza mrówczanowa, dehydrogenaza glicerolowa, dehydrogenaza leucynowa. Odpowiednie mogą być także dehydrogenaza L-alaninowa, dehydrogenaza 3a-hydroksysteroidowa, dehydrogenaza L-mleczanowa (z Lactobacillus sp) lub dehydrogenaza glicerolo-3-fosforanowa. Zalecanym enzymem stosowanym w odczynniku do określania poziomu transaminazy/amoniaku i m ocznika, jest dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa. Można ją otrzymać z każdego odpowiedniego źródła, takie jak Leuconostoc mesenteroides, Bacilłus stearothermophilus, Zymomonas mobilus lub drożdże. Enzymy takie pochodzą korzystnie ze źródeł drobnoustrojowych. Odkryto, że włączenie do odczynnika enzymów ze źródeł drobnoustrojowych minimalizuje obecność endogenicznych zanieczyszczeń, takich jak oksydaza NADH i proteazy, które dotychczas poważnie wpływały na stabilność odczynników. Enzymy drobnoustrojowe posiadają także dodatkową korzyść większej termostabilności, a tym samym poprawienia długookresowej stabilności w roztworze. Bardziej zalecanym źródłem dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej jest Leuconostoc mesenteroides. Jeśli stosuje się glukozo-6-fosforan od Bacillus stearothermophilus lub Zymomonas mobilus, prędkość reakcji zmniejsza się. Podobnie, jeśli jako źródło dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu stosuje się drożdże, musi być użyty koenzym NADPH, jako alternatywa dla NADH, ponieważ dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa drożdży jest specyficzna tylko dla NADP+. Odpowiednia ilość dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, obecna w odczynnikach według wynalazku, będzie się zmieniać zgodnie z pożądanym tempem regeneracji. Jednakże, szczególnie zalecaną dla odczynnika AST, jest ilość około 2000 jednostek/litr, aby pozwolić na degradację z upływem czasu w roztworze. Dla ALT szczególnie zaleca się stężenie 2000 jednostek/litr. Zalecanym stężeniem dla odczynnika mocznikowego jest 2000 jednostek/litr, a zalecanym stężeniem dla odczynnika amoniakowego jest 3500 jednostek/litr. Biorąc pod uwagę, że wybór substratu i enzymu musi być taki, że w układzie redukcyjnym koenzymu mają one niecałkowitą specyficzność w stosunku do siebie, odpowiednie substraty do użytku w odczynniku według wynalazku obejmują: rybozo-5-fosforan, glukozo-1-fosforan, kwas 6-fosfoglukonowy, 2-deoksyglukozo-6-fosforan, 2-deoksy-2-fluoroglukozo-6-fosforan, 2-deoksy- 2-chloroglukozo-6-fosforan, 2-deoksy-2,2-difluoroglukozo-6-fosforan, 2-0 -metyloglukozo-6-fosforan, mannozo-6-fosforan, glukozoamino-6-fosforan, 3-deoksyglukozo-6-fosforan, 3-deoksy-3- fluoroglukozo-6-fosforan, 3-0-metyloglukozo-6-fosforan, allozo-6-fosforan, ahrozo-6-fosforan, 4-deoksy-4-fluoroglukozo-6-fosforan, galaktozo-6-fosforan, 5-tioglukozo-6-fosforan, analogi fosfonianowe, glukozo-6-stallan, [3-D-glukoza, D-galaktoza, 2-deoksyglukoza, arabinoza, ksyloza, 1-sorboza, D-mannoza, D-fruktoza, D-laktoza, D-sorbital, D-mannitol, sacharozą, inozytol, maltoza. Przy użyciu NADH, jako zalecanego koenzymu w odczynniku, zalecanym połączeniem enzym/substrat jest dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa(g-6-p-dh)/d-glukoza. Zalecanymi alternatywnymi substratami w stosunku do D-glukozy są takie, dla których, w stosunku do specyficzności miedzy glukozo-6-fosforanem (G-6-P) i G-6-P-DH, prędkość reakcji między enzymem G-6-P-DH i wybranym substratem jest mniejsza niż 50%, korzystniej mniej niż 10%, a najkorzystniej mniej niż 5% w stosunku do specyficzności między glukozo-6- fosforanem (G-6-P) i G-6-P-DH. Biorąc znowu pod uwagę wymaganą prędkość regeneracji, poziom D-glukozy najbardziej odpowiedni dla odczynników według wynalazku, a zatem zalecany, wynosi około 100 mmoli/litr, chociaż można stosować poziomy do 1000 mmoli/litr. Rozpuszczalność D-glukozy w odczynniku staje się zagadnieniem przy wyższych stężeniach. Gdy stosuje się zalecane połączenie D-glukozy/dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, można wprowadzić do kompozycji jony fosforanu potasu, w postaci dwuzasadowego fosforanu potasu. Zmieniający się poziom jonów fosforanowych może być odpowiedni w zależności od żądanej prędkości regeneracji. Jednkaże, gdy stężenie D-glukozy wynosi np. około 100 mmoli/litr (lecz może się zmieniać między 20 i 200 mmoli/litr), a odpowiadający poziom dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej wynosi około 2000 jednostek/litr (lecz może się zmieniać między 500 i 3500 jednostek/litr), odpowiedni poziom jonów fosforanowych, może wynosić 2,0-20 mmoli/litr. Zwiększenie stężenia jonów fosforanowych zwiększy tempo regeneracji. Zalecanym poziomem dodatku jonów fosforanowych jest około 10 mmoli/litr dla AST

12 186 517 i około 5 mmoli dla ALT. Dla odczynnika mocznikowego zalecane stężenie dodawanych jo - nów fosforanowych wynosi około 5 mmoli, a także około 5 mmoli dla odczynnika amoniakowego. Gdy wykorzystuje się zalecane połączenie D-glukozy i dehydrogenazy glukozo-6- fosforanowej, lub rzeczywiście w każdym układzie, w którym nie wytwarzają się wolne jony fosforanowe, zasadniczo należy wprowadzić wolne jony fosforanowe do odczynnika. W szczególności, wolne jony fosforanowe wymagane są do utworzenia niespecyficznego kompleksu z D-glukozą, w celu inicjacji regeneracji w obecności dehydrogenazy glukozo-6- fosforanowej. Zalecaną alternatywą do użycia D-glukozy/G-6-P-DH jest użycie dehydrogenazy glukozowej (GLD) zgodnie z następującą reakcją, w której D-glukoza jest 100% reaktywnym substratem: D-glukoza + NAD+ GLD- -> D-glukono-5-lakton + NADH + H+ Jeśli stosuje się dehydrogenazę jako enzym, zalecanymi substratami dla redukcji koenzymu NAD i ich relatywnym stopniem reaktywności wzajemnej w porównaniu z D-glukozą są: Substrat Relatywna aktywność Ksyloza 8,9% L-sorboza 0,3% D-mannoza 2,4% D-fruktoza 0,8% D-galaktoza 0,1% D-laktoza 1,2% D-sorbitol 0,1% Inozytol 0,2% Maltoza 3,9% w których cyfry oznaczają tempo reakcji w stosunku do dehydrogenazy glukozowej w obecności naturalnego substratu 1 p-d-glukozy. Alternatywnie, użycie dehydrogenazy glicerolowej (GLY.DH) jako enzymu, odpowiednie substraty w reakcji glicerol + NAD+ GLP PH > dihydroksyaceton + NADH + H+ oraz ich aktywność w stosunku do glicerolu ( 100%) są następujące: Substrat Relatywna aktywność Glicerolo-amonochlorohydryna 48,5% Glikol etylenowy 7,8% 2,3-Butadienol 52,6% w których jako enzym stosuje się dehydrogenazę leucyny (L.D), zgodnie z reakcją substrat + NAD+ + H2O < LD > a-ketoizokapronian + NH3 + NADH + H+ odpowiednie substraty i ich aktywność w stosunku do L-leucyny (100%) są następujące: Substrat Relatywna aktywność L-walina 74% L-izoleucyna 58% L-norwalina 41% L-norleucyna 10% L-metionina 0,6% L-cysteina 0,3% Jeśli jako enzym stosuje się dehydrogenazę L-alaninową (A.D), w układzie reakcyjnym podobnym do użytego dla dehydrogenazy leucynowej, odpowiednim substratem i jego aktywnością w stosunku do L-alaniny (100%) jest

186 517 13 Substrat Relatywna aktywność L-seryna 5% Jako enzym można także użyć dehydrogenazę 3a-hydroksysteroidową (H.DH), w połączeniu z substratami wymienionymi poniżej. Ich aktywności w stosunku do kwasu cholowego wymieniono także. Substrat Relatywna aktywność Kwas litocholowy 96% Kwas etiocholowy 60% Gdzie jako enzym stosuje się dehydrogenazę L-mleczanową (LDH) z Lactobacillus sp, w następującej reakcji pirogronian + NAD + H+ < ^DH > L-mleczan + NAD+ przy czym odpowiednie substraty i ich aktywności w stosunku do L-mleczanu są następujące: Substrat Relatywna Aktywność 2-oksoglutaran 0,09% szczawiooctan 36% Gdy koenzymem jest NADP+, np. z drożdży, zalecanymi połączeniami substrat/enzym są: G-6-P-HD/galaktozo-6-P 25% G-6-P-DH/2-deoksyglukozo-6-P 18% G-6-P-DH/glukozoamino-6-P 2% Cyfry z prawej strony oznaczają reaktywność w stosunku do pary G-6-P-DH/G-6-P. Jest także możliwe użycie NADP+ jako koenzymu, aby połączyć jako enzym/substrat dehydrogenazę glicerolo-3-fosforanowąz fosforanem dihydroksyacetonu. Jak opisano we wstępie do tego szczegółowego opisu, innymi wymaganiami odczynnika według wynalazku, do stosowania w określaniu poziomów AST w surowicy, są dehydrogenaza mleczanowa, dinukleotyd nikotynamido-adeninowy, zredukowany (NADH), dehydrogenaza maleinianowa (MDH), asparaginian i 2-oksoglutaran. W przypadku ALT dehydrogenaza maleinianowa nie jest wymagana, a zamiast asparaginianu, pożądana jest L-alanina. W przypadku odczynnika mocznikowego, wymagana jest także ureaza oraz a-ketoglutaran, chociaż a-ketoglutaran jest także pożądany przy odczynniku amoniakowym. Asparaginian dostępny jest w postaci różnych soli, takich jak sole sodowe i potasowe. Zalecaną solą według wynalazku jest sól potasowa, ponieważ wydaje się, że jest ona bardziej rozpuszczalna i mniej uwodniona niż sól sodowa. Zakres stężenia dopuszczalnego w odczynnikach według wynalazku, wynosi 180-240 mmoli/litr. Najbardziej zalecane jest ostateczne stężenie wynoszące około 200 mmoli/litr i należy zauważyć, że jest poziom zalecany przez IFCC. Zakres 2-oksoglutaranu uważany za korzystny dla odczynników według wynalazku wynosi około 1-15 mmoli/litr, jednakże zauważa się, że wysokie stężenia tego substratu mogły ograniczać ilość NADH, którą można dodać do kompozycji, ponieważ 2-oksoglutaran absorbuje się przy 340 nm, dostarczając tła absorbancji dla absorbancji NADH. Ograniczając ilość 2-oksoglutaranu dodanego do kompozycji, odczynnik można wykorzystać bez trudności na większości analizerów spektralnych. Zalecane stężenie tego substratu dla odczynników AST i ALT wynosi około 12 mmoli/litr, co jest znów poziomem zalecanym przez IFCC. Dla odczynników mocznikowego i amoniakowego zalecane stężenie wynosi około 7,5 mmola/litr. Poleca się, aby ilość alaniny w odczynniku ALT była obecna w pewnych granicach, z powodu rozpuszczalności tego składnika. W szczególności, zalecanym zakresem jest 200-500 mmoli/litr, mimo, ze przy wyższym zakresie nie obserwuje się widocznego podniesienia aktywności katalitycznej. Najbardziej korzystnym stężeniem tego substratu jest około 400 mmoli/litr, z powodu rozpuszczalności tej substancji. Poziom koenzymu w odczynniku będzie się zmieniał zgodnie z następującymi czynnikami: liniowość wymagana w pomiarze wybrana długość fali stosunek objętości próbki do odczynnika układ fotometryczny wybranego analizera

14 186 517 Zazwyczaj, zwiększenie objętości próbki poprawia czułość, lecz zmniejsza liniowość uzyskanego odczytu, natomiast zmniejszenie objętości próbki polepsza liniowość kosztem straty czułości. Zalecaną długością fali dla pomiaru jest 320-400 nm, jednakże poziom użytego koenzymu powinien być ustawiony tak, że absorbancja korzystnie nie przekracza 2,0 A. Zalecaną długością fali absorbancji według wynalazku jest 340 nm. MDH korzystnie uzyskuje się ze źródeł drobnoustrojowych tak, aby ograniczyć ryzyko endogenicznych zanieczyszczeń i ponieważ wykazuje podwyższoną charakterystykę ze względu na stabilność termiczną. Odpowiedni zakres poziomów to 150-1500 jednostek/litr, bardziej korzystny to 200-800 jednostek/litr. Najbardziej korzystnym poziomem według wynalazku jest około 250 jednostek/litr. W odczynniku AST, LDH bierze udział w usuwaniu endogenicznego pirogronianu z próbki. Poziom LDH korzystnie wprowadzonego do odczynnika AST według wynalazku był taki, że 1,0 mmol/litr próbki pirogronianu oczyszczał się w ciągu 1 minuty, wykorzystując stosunek próbki do odczynnika 1:10. Poziom ten określono na około 2000 jednostek/litr. W odczynniku ALT, LDH bierz udział w dwóch reakcjach, (i) w sprzężonej reakcji enzymu do pomiaru ALT oraz (ii) w usuwaniu endogenicznego pirogronianu z próbki. Poziom wprowadzonego LDH, jak przy odczynniku AST był taki, że odczynnik usunie do 1,0 mmola/litr pirogronianu z próbki w 1 minutę. Główną reakcję można więc mierzyć po 1 minucie bez zakłóceń, pochodzących od endogenicznego pirogronianu z próbki. Minimalny poziom LDH wymagany do klirensu endogenicznego pirogronianu w próbce, określono na 1500 jednostek/litr. Zalecana ilość wprowadzona do odczynnika ALT według wynalazku wyniosła około 2000 jednostek/litr. W odczynniku mocznikowym, minimalna aktywność ureazy, wymagana przy ph 8,5, jako enzymu nie ograniczającego prędkości w kinetycznym modelu testowania, wynosi około 5000 jednostek/litr. Można włączyć ilości w nadmiarze, aby zwiększyć stabilność długoterminow ą odczynnika. Zalecany rodzaj pomiaru analitu w odczynnikach mocznikowym i amoniakowym opiera się na zasadach kinetycznych. Ponieważ dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH) jest enzymem ograniczającym prędkość w preparacie, poziom aktywności GLDH włączonego do odczynnika, jest krytyczny dla liniowości testu. Poziom wymaganej aktywności GLDH będzie się także zmieniał, jako funkcja ph układu odczynnika. Odpowiedni zakres aktywności GLDH może się zmieniać między 250-10000 jednostek/litr. Najbardziej odpowiednimi enzymami są enzymy pochodzenia drobnoustrojowego, jako że handlowe preparaty GLDH ze źródeł zwierzęcych są zwykle mniej stabilne i prawdopodobnie zawierają wyższe poziomy aktywnej oksydazy NADH, jako zanieczyszczenia. Zalecaną aktywnością GLDH dla odczynnika mocznikowego, przy ph 8,50, jest około 500 jednostek/litr i dla odczynnika amoniakowego, przy ph 8,50, jest około 8500 jednostek/litr. Odczynniki według wynalazku mogą zawierać w dodatku do redukującego układu koenzymu i innych podstawowych substratów i enzymów koniecznych do określenia stężenia analitu, konserwanty, środki chelatujące, środki powierzchniowo czynne, inhibitory proteazy, bufory, kofaktory, środki przeciwbakteryjne i inne składniki, które pełnią funkcje wzmocnienia stabilności, lecz nie wpływają materialnie na charakterystykę wynalazku. Pierwotnymi kryteriami wyboru buforu jest dobra zdolność buforowania przy wybranym ph, z minimalnym wiązaniem kationu dwuwartościowego. ph i układ buforowy dla odczynników AST i ALT wybiera się zgodnie z zaleceniami Międzynarodowej Federacji Chemii Klinicznej (IFCC) dla pomiaru transaminaz. Generalną praktyczną regułą jest to, że bufor można uznać za skuteczny, jeśli pka wynosi ± 1,0 jednostek ph z wybranego ph. Zalecane ph odczynnika według wynalazku wynosi 7-9. Dla transaminazy asparaginianowej, optymalna aktywność katalityczna zachodzi przy ph około 7,0-8,2, w temperaturze 30 C. Najbardziej zalecane ph dla odczynnika AST wynosi około 8,1 ± 0,1 w temperaturze 20 C, ponieważ przy tym ph NADH jest stabilny. Dla odczynnika ALT, maksymalna aktywność katalityczna zachodzi przy ph, wynoszącym około 7,3-7,9 w temperaturze 20 C. Najbardziej zalecanym ph dla odczynnika ALT jest 7,7 w temperaturze 20 C. Przy tych zalecanych ph osiąga się

186 517 15 kompromis miedzy optymalną aktywnością enzymu i stabilnością enzymów i koenzymu w roztworze. Niższe ph może dać w wyniku zwiększenie degradacji koenzymu. Zalecanym układem buforowym dla odczynnika mocznikowego jest Tris przy ph 8,50, chociaż zakres 7,6-9,5 można uznać za dopuszczalny. Zalecanym stężeniem buforu, dla skutecznego zdolności buforowania, jest 100 mm Tris, chociaż można stosować zakres 20-200 mm Tris. W tym układzie buforowym można stosować szeroki zakres alternatywnych buforów, co dostarcza skutecznej zdolności buforowania, w zakresie 7,5-9,5. Zalecanym układem buforującym dla odczynnika amoniakowego jest Tris przy ph 8,5-9,0, chociaż każde ph w zakresie 7,5-9,5 można uznać za dopuszczalne. Zalecanym stężeniem buforu dla skutecznej zdolności buforowania jest 100 mm Tris, chociaż można użyć wszystko w zakresie 20-200 mm Tris. Odpowiednie bufory dla odczynników AST i ALT obejmują HEPES, kwas 4-morfolinopropanosulfonowy (MOPS) lub kwas 2-[tris(hydroksymetylo)metyloamino]-l-etanosulfonowy (TES) albo dietanoloamina albo inne dobre bufory, Tricine, Bicine, TEA i TAPS, TAPSO i POPSO. Zalecanym buforem według wynalazku jest TRIS, o całkowitym stężeniu korzystnie wynoszącym 30-150 mmoli/litr, a korzystniej około 70-100 mmoli/litr, chociaż preferuje się około 80 mmoli/litr. Przy wyższych stężeniach buforu AST jest silnie hamowany. Zauważono, że bufory fosforanowe wydają się zwiększać tempo rozkładu NADH i hamować łączenie pirydoksalo-5-fosforanu(p-5-p) z apoenzymem transaminazy. Testowaną próbkę można rozcieńczyć jeśli trzeba, każdym odpowiednim rozcieńczalnikiem, takim jak woda dejonizowana lub roztwór soli. W dodatku do wyżej wymienionych buforów odpowiednich dla odczynników AST i ALT, następujące dobre bufory są także odpowiednie dla odczynników mocznikowych i amoniakowych: CAPSO, CHES i AMPSO. Odpowiednie są także konserwanty, takie jak azydek sodu (NaN^), kwas hydroksybenzoesowy, gentamycyna, Thymol i konserwanty pozbawione rtęci dostępne od Boehringer Mannheim, takie jak metyloizotiazolon. Odpowiednim poziomem jest taki, że konserwant zachowuje swoje właściwości konserwujące przez co najmniej 6-8 miesięcy, przy przechowywaniu w temperaturze 2-8 C, bez inhibicji enzymów obecnych w odczynniku. Odpowiednim zakresem spełniającym te kryteria jest 0, 1-1,0 g/litr. Różne środki chelatujące, takie jak EDTA, EGTA, kwas N-(2-hydroksyetylo)etylenodiaminotrioctowy (HEDTA), itd. są także odpowiednie jako niespecyficzne środki stabilizujące. W odczynnikach AST i ALT według wynalazku, korzystnie wykorzystuje się EDTA, przy poziomie około 2,0-10,0 mmoli/litr, w celu stabilizacji 2-oksoglutaranu. Jest on dostępny jako sól tetrasodowa, a także sól potasowa, ale zalecaną solą według wynalazku jest sól disodowa. W odczynnikach mocznikowym i amoniakowym, EDTA obecna jest w zakresie 0,2-10 mm. Szczególnie zalecanym stężeniem EDTA jest 1 mm. Środki stabilizujące enzymy można także wprowadzić do odczynników według wynalazku. Zalecanym środkiem stabilizującym jest albumina surowicy bydlęcej, klasy pozbawionej proteazy. Inne odpowiednie mogą zawierać gamma globulinę bydlęcą, N-acetylo cysteinę i glicerol. Jeśli trzeba, można także dodać odpowiednich środków przeciw pienieniu. Środki powierzchniowo czynne, które można stosować, obejmują środki powierzchniowo czynne Zwitterionic i niejonowe środki powierzchniowo czynne, o poziomach, nie hamujących enzymów obecnych w odczynnikach. W innym aspekcie wynalazku dostarcza się ulepszonego sposobu enzymatycznego określenia stężenia analitu w próbce płynów ciała, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym ulepszenie obejmuje stabilizację odczynnika, zawierającego wspomniany koenzym przeciw utlenieniu, przez układ redukujący koenzymu, zawierający parę enzym i substrat wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w okresie przechowywania wspomnianego odczynnika. Dostarcza się także ulepszonego sposobu enzymatycznego określania stężenia transaminazy w próbce płynów ciała, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym ulepszenie obejmuje stabilizację odczynnika, zawierającego wspomniany koenzym przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, zawierający parę enzym i substrat wybraną tak,