znaczanie aktywności proteolitycznej trypsyny Zajęcia 3-godzinne część A, zajęcia 4-godzinne część A i B el ćwiczenia elem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodą oznaczania aktywności endopeptydaz na przykładzie trypsyny. Na zajęciach 3-godzinnych studenci oznaczają aktywność trypsyny wobec kazeiny, na ćwiczeniach 4-godzinnych porównują aktywność tego enzymu wobec dwóch białek substratowych różniących się zarówno zawartością kluczowych dla oznaczenia aminokwasów, jak i dostępnością hydrolizowanych przez enzym wiązań. Wprowadzenie Peptydazy (hydrolazy peptydowe E 3.4.) to enzymy, które rozrywają, przy udziale cząsteczki wody, wiązania peptydowe łączące aminokwasy w peptydach i białkach. Reakcja hydrolizy wiązania peptydowego prowadzi do odtworzenia grupy α-karboksylowej jednego, i grupy α-aminowej drugiego aminokwasu. W zależności od położenia hydrolizowanego wiązania wyróżnia się endopeptydazy (proteinazy), które rozszczepiają wiązania peptydowe położone w pewnej odległości od końca łańcucha oraz egzopeptydazy hydrolizujące wiązania peptydowe położone skrajnie. Egzopeptydazy działające przy -końcu peptydu nazywane są karboksypeptydazami, zaś te, które odszczepiają aminokwas N-końcowy aminopeptydazami. Znane są także omega peptydazy rozrywające wiązania peptydowe, którymi przyłączone są potranslacyjnie zmodyfikowane aminokwasy położone zarówno przy N-, jak i - końcu peptydu. Na podstawie mechanizmu katalizy endopeptydazy podzielono na następujące podpodklasy: serynowe (E 3.4.21), cysteinowe (E 3.4.22), aspartylowe (E 3.4.23), treoninowe (E 3.4.25), metaloproteinazy (E 3.4.24) oraz proteinazy o nieznanym mechanizmie katalizy (E 3.4.99). Ze względu na miejsce działania, peptydazy dzieli się także na wewnątrzkomórkowe (lizosomalne/wakuolarne i cytozolowe) oraz pozakomórkowe (peptydazy wydzielane przez komórki bakteryjne oraz zwierzęce peptydazy trawienne wydzielane do przewodu pokarmowego). Biologiczna rola peptydaz pozakomórkowych działających w przewodzie pokarmowym zwierząt polega na wstępnej hydrolizie białek pokarmowych. Do tej grupy enzymów zalicza się: pepsynę, chymozynę, trypsynę, chymotrypsynę, karboksypeptydazę A i elastazę. Endopeptydazy charakteryzują się niską specyficznością substratową, wykazują jednak preferencje wobec charakteru łańcuchów bocznych aminokwasów tworzących rozkładane wiązanie peptydowe. Przykładowo chymo hydrolizuje wiązania peptydowe powstałe z udziałem grupy karboksylowej aminokwasów aromatycznych (fenyloalanina, tyrozyna, tryptofan) lub aminokwasów o dużych, hydrofobowych łańcuchach bocznych np. metionina czy leucyna. Elastaza natomiast rozszczepia wiązania peptydowe utworzone przez aminokwasy o niewielkich, pozbawionych ładunku łańcuchach bocznych. Z kolei pepsyna wykazuje aktywność wobec wiązań peptydowych utworzonych z udziałem grupy aminowej aminokwasów aromatycznych i kwaśnych oraz między waliną i leucyną (Bańkowski 2006). Stąd też aktywność konkretnej endopeptydazy wobec konkretnego białka substratowego uwarunkowana jest zarówno składem aminokwasowym, jak i przestrzenną strukturą tego białka. Struktura ta może w sposób znaczący utrudniać działanie enzymów proteolitycznych. Dostępność wiązań peptydowych w białku substratowym zwiększyć można przez jego częściową lub całkowitą denaturację, dlatego niektóre produkty spożywcze będące doskonałym źródłem pełnowartościowych białek poddaje się obróbce termicznej przed spożyciem. Ponadto termiczna denaturacja prowadzi do inaktywacji białkowych inhibitorów endopeptydaz towarzyszących białkom roślinnym, szczególnie tym zgromadzonym w nasionach roślin strączkowych, w celu ochrony przed peptydazami trawiennymi szkodników magazynowych. 1
Peptydazy trawienne syntetyzowane są w postaci nieaktywnych prekursorów ulegających aktywacji proteolitycznej najczęściej inicjowanej przez trypsynę. Trypsyna (E 3.4.21.4). Enzym ten, podobnie jak chymo i elastaza, jest zaliczany do podpodklasy proteinaz serynowych, których centrum aktywne tworzą łańcuchy boczne seryny, kwasu asparaginowego i histydyny. Trypsyna katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych, w których grupy karbonylowe należą do argininy lub lizyny (rys. 1A). A) Lys 3 + Arg er + H 3 N HN N H H H H H H H Ser H H 3 H S Met Thr B) H 3 Ser Ala Asp Gly Lys Met Trp Gly Arg Gly Ala Lys ys Gly Ser Ala Asp Gly Lys Met Trp Gly Arg Gly Ala Lys ys Gly Rys. 1 Działanie trypsyny na białko: A) wiązania peptydowe hydrolizowane przez trypsynę, B) uwalnianie peptydów różnej długości. Produktem działania trypsyny na białko są peptydy o różnej długości łańcucha z resztą lizyny lub argininy na -końcu (Rys. 1B). Trypsyna jest syntetyzowana przez komórki trzustki w postaci nieaktywnego prekursora (proenzymu) trypsynogenu (pojedynczy łańcuch polipetydowy zawierający 247 reszt aminokwasowych), który ulega w jelicie cienkim aktywacji pod wpływem enterokinazy jelitowej (syn. enteropeptydaza). Proces aktywacji polega na odłączeniu sześcioaminokwasowego odcinka prekursorowego, co powoduje zmiany konformacyjne prowadzące do uzyskania przez cząsteczkę właściwości katalitycznych. Zaktywowane w ten sposób cząsteczki trypsyny aktywują kolejne cząsteczki trypsynogenu oraz prekursory innych peptydaz wydzielanych przez komórki trzustki do światła jelita cienkiego. ptimum ph działania trypsyny zawiera się w granicach 7 9. Ze względu na specyficzność działania, enzym ten jest stosowany do rozszczepiania białek na peptydy przed ich sekwencjonowaniem metodą Edmana metoda ta pozwala na poprawne ustalenie sekwencji peptydów zbudowanych maksymalnie z 50 aminokwasów. Metody oznaczania aktywności endopeptydaz bazują na fotometrycznym pomiarze ilości peptydów (produktów reakcji) uwolnionych z substratu białkowego przez enzym. Pomiaru tego dokonuje się po usunięciu z mieszaniny poreakcyjnej, przez wirowanie lub sączenie, pozostałości substratu: bezpośrednio: - wiązania peptydowe oraz pierścienie aromatyczne łańcuchów bocznych aminokwasów pochłaniają promieniowanie elektromagnetycznego o długości fali 280 nm - produkty hydrolizy barwnych białek azowanych 1 pochłaniają promieniowanie elektromagnetycznego o długości fali 340 nm 1 białka poddane reakcji sprzęgania z diazowanym kwasem sulfanilowym podstawianym do reszt histydyny i tyrozyny 2
pośrednio, po przeprowadzeniu reakcji zachodzącej pomiędzy łańcuchami bocznymi aminokwasów zawartych w uwolnionych peptydach a odczynnikami dającymi barwny produkt. Zasada metody Ansona. Metoda ta polega na pomiarze ilości tyrozyny i tryptofanu zawartych w peptydach uwolnionych przez enzym z substratu (np. kazeina, białka soi). Peptydy te, w odróżnieniu od białek, nie ulegają wytrąceniu pod wpływem 3% kwasu trichlorooctowego. Natomiast wytrącone kwasem białka usuwa się z mieszaniny przez wirowanie lub sączenie. Enzymatyczną hydrolizę białka (substratu) prowadzi się w ph 8,6 i temp. 37. znaczenie zawartości tyrozyny i tryptofanu w uwolnionych przez enzym peptydach wykonuje się przy użyciu odczynnika Folina. Końcowa barwa, której natężenie jest wprost proporcjonalne do ilości tyrozyny i tryptofanu w próbie, jest wynikiem redukcji odczynnika fosforomolibdenofosforowolframowego (odczynnik Folina) w środowisku zasadowym do błękitu fosforomolibdenowego, zachodzącej pod wpływem wymienionych aminokwasów. Stężenie barwnego produktu w próbie oznacza się mierząc pochłanianie (absorbancję) promieniowania świetlnego o długości fali 670 nm. Miarą aktywności trypsyny będzie ilość μmoli tyrozyny zawarta w uwolnionych peptydach. dczynniki 1. 0,1 M bufor Tris Hl o ph 8,6 2. 1% roztwór kazeiny w 0,1 M buforze Tris-Hl o ph 8,6 3. 1% roztwór denaturowanych białek soi w 0,1 M buforze Tris-Hl o ph 8,6 4. dczynnik Folina (iocalteu) 5. 0,5 M NaH 6. 7,5 % TA Wykonanie A. znaczenie aktywności kazeinolitycznej trypsyny 1. Hydroliza enzymatyczna kazeiny. trzymany w kolbie miarowej na 10 ml roztwór trypsyny (zadanie kontrolne) dopełnić do kreski 0,1 M buforem Tris-Hl (1) i dobrze wymieszać. Do trzech enzymatycznie czystych probówek (dwie pełne i jedna materiałowa) odmierzyć po 2 ml roztworu kazeiny (2) i umieścić je w łaźni wodnej w temp. 37. Po około 5 minutach do dwóch probówek z kazeiną ( pełne), nie wyjmując ich z łaźni wodnej, dodać po 1 ml enzymu z kolby z zadaniem kontrolnym, szybko wymieszać i inkubować wszystkie trzy w temp. 37 dokładnie przez 15 minut. Następnie do wszystkich trzech prób dodać po 2 ml TA (6), wyjąć probówki z łaźni wodnej i do materiałowej dodać 1 ml enzymu z kolby z zadaniem kontrolnym. Wszystkie trzy wymieszać i pozostawić przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu całkowitego wytrącenia osadu białka. Po tym czasie przesączyć do czystych probówek przez sączki bibułowe. 2. Fotometryczne oznaczanie tyrozyny w produktach hydrolizy enzymatycznej W celu oznaczenia ilości tyrozyny w produktach hydrolizy enzymatycznej należy do kolejnych trzech czystych probówek odmierzyć po 1 ml klarownego przesączu z dwóch prób pełnych i z materiałowej. Do wszystkich trzech probówek dodać po 2 ml 0,5 M NaH (5) oraz po 0,6 ml odczynnika Folina (4) - zawartość probówek dobrze wymieszać. Po 10 minutach odczytać absorbancję 3
prób pełnych i materiałowej w fotometrze przy długości fali 670 nm ustawionym na zero wobec wody destylowanej. B. znaczenie aktywności trypsyny wobec białek soi. znaczenie wykonać wg opisu zamieszczonego w punkcie A stosując w miejsce roztworu kazeiny (2) roztwór denaturowanych białek soi (3) bliczenie aktywności trypsyny 1. bliczyć średnią wartość absorbancji prób pełnych. 2. bliczyć różnicę średniej absorbancji prób pełnych i materiałowej. 3. Posługując się obliczoną różnicą absorbancji odczytać z krzywej wzorcowej ilość μmoli tyrozyny zawartej w 1 ml przesączu. 4. bliczyć aktywność enzymu w μmolach tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych w warunkach metody w ciągu 1 min przez 1 mg trypsyny [μmole tyrozyny min. -1 mg -1 trypsyny] uwzględniając: a. schemat rozcieńczeń trypsyny podany przez prowadzącego zajęcia b. czas trwania enzymatycznej hydrolizy substratu. Przykładowe obliczenia: pełnej nr 1 pełnej nr 2 Średnia absorbancji prób pełnych materiałowej Różnica absorbancji Ilość µmoli tyrozyny odczytana z krzywej wzorcowej dla różnicy absorbancji 0,212 0,218 0,215 0,030 0,185 0,2 Różnica absorbancji wynosi 0,185, czyli w 1 ml przesączu znajduje się 0,2 µmola tyrozyny. Ponieważ do reakcji barwnej pobrano 1 ml z 5 ml przesączu, ilość tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych z substratu przez 1 ml trypsyny wynosi 1 µmol. Aktywność trypsyny, zawartej w 10 ml roztworu, jest więc równa 10 µmolom tyrozyny. Wiedząc, że przed uzupełnieniem do objętości 10 ml kolbka zawierała 2 ml roztworu trypsyny przygotowanego przez rozpuszczenie 7 mg tego enzymu w 40 ml buforu możemy obliczyć aktywność trypsyny w następujący sposób: aktywność 2 ml wyjściowego roztworu trypsyny wynosi 10 µmoli tyrozyny aktywność 7 mg trypsyny jest równa 200 µmoli tyrozyny aktywność 1 mg trypsyny wynosi 28,57 µmoli tyrozyny, a po uwzględnieniu czasu trwania reakcji enzymatycznej wynoszącego 15 minut, aktywność ta będzie równa 1,91 µmola tyrozyny min. -1 mg -1 trypsyny Pytania 1. Jakie kryteria podziału stosuje się wobec peptydaz? 2. zym różnią się karboksypeptydazy od aminopeptydaz? Przedstaw wzór dowolnego tripeptydu i wskaż wiązanie peptydowe, które może zhydrolizować aminopeptydaza? 3. Wymień endopeptydazy działające w przewodzie pokarmowym i krótko je scharakteryzuj. 4. Podaj miejsce syntezy trypsynogenu i omów jego aktywację. 5. Jaką rolę w aktywacji trypsynogenu pełni enterokinaza? 6. Jakie praktyczne zastosowanie znalazła w badaniach biochemicznych? 4
7. mów metodę oznaczania aktywności trypsyny na ćwiczeniu. Jaką rolę spełnia w tej metodzie kwas trichlorooctowy (TA)? 8. Przedstaw, używając trzyliterowych skrótów nazw aminokwasów, fragment łańcucha polipeptydowego i wskaż miejsce działania trypsyny. Literatura 1. Anson, M.L. (1938) J. Gen. Physiol. 22, 79-89. 2. hen J-M., Kurko Z., Le Marechal., Toth., Tsakiris L., Raguenes., Ferec., Sahin-Toth M. (2003) Mol. Biol. Evol. 20(11), 1767-1777 3. Bańkowski E., Biochemia, MedPharm Polska, Wrocław 2006 5