ROZDZIAŁ 7 Metody immunologiczne w diagnostyce Tomasz Francuz Teresa Jurczak Metody immunologiczne wykorzystujące do oznaczeń przeciwciała mają coraz większe zastosowanie w diagnostyce medycznej. Wypierają one starsze metody oparte o charakterystyczne reakcje chemiczne, gdyż są czulsze oraz bardziej specyficzne. Ich stosowanie często wiąże się z koniecznością coraz bliższej współpracy lekarza z laboratorium w którym wykonywane są oznaczenia. Z punktu widzenia lekarza-diagnosty niezwykle istotna staje się wiedza na temat zastosowanej w laboratorium metody oznaczania, jej czułości, specyficzności i wrażliwości na substancje interferujące. W metodach immunologicznych stosuje się przeciwciała, które mają różne właściwości w zależności od ich producenta, a co za tym idzie przydatność diagnostyczna oznaczeń często zależy od zastosowanego zestawu diagnostycznego. Olbrzymia różnorodność stosowanych metod, różniących się czułością, specyficznością, a także ceną zmusza do ich bliższego poznania, w celu dokonania właściwych wyborów. Wspólną cechą łączącą różne metody immunologiczne jest zastosowanie w nich przeciwciał mono- lub poliklonalnych lub ich fragmentów (Fab lub (Fab) 2 ). Metody detekcji powstałego kompleksu antygen-przeciwciało znacznie się różnią. Od zastosowanej metody detekcji zależy czułość, a często także specyficzność oznaczenia. 285
Budowa przeciwciała Przeciwciała występują w postaci monomerycznej (IgG, Ig, czasami IgA), dimerycznej (IgA) lub polimerycznej (IgM). Są glikoproteinami, zbudowanymi z czterech łańcuchów białkowych dwóch ciężkich (H heavy chain) i dwóch lekkich (L light chain). Końce aminowe polipeptydów tworzących łańcuchy zawierają po jednym regionie zmiennym (V L i V H regiony zmienne dla łańcucha lekkiego i ciężkiego), łańcuch lekki zawiera jeden region stały (C L ), a łańcuch ciężki aż trzy regiony stałe (C H1, C H2, C H3 ). Łańcuch ciężki ma mniej więcej dwukrotnie wyższą masę cząsteczkową (ok. 50 kda), niż łańcuch lekki (25 kda). Immunoglobulina w postaci monomerycznej ma masę ok. 150 kda. Łańcuchy lekkie i ciężkie połączone są ze sobą wiązaniami niekowalencyjnymi i kowalencyjnymi mostkami dwusiarczkowymi. W efekcie tworzą one symetryczną, podwójną strukturę. Regiony V obu łańcuchów tworzą tzw. miejsce wiążące antygen, odpowiedzialne za interakcję przeciwciała z antygenem. W efekcie każde monomeryczne przeciwciało posiada dwa identyczne miejsca wiązania antygenu (fragmenty Fab). Łańcuchy ciężkie połączone są razem dzięki podwójnemu wiązaniu dwusiarczkowemu pomiędzy regionami C H1 i C H2 łańcuchów ciężkich. Klasy i podklasy przeciwciał Wyróżniamy pięć podklas immunoglobulin, rozróżnianych na podstawie typu łańcucha ciężkiego. U człowieka immunoglobuliny klasy G stanowią około 75% wszystkich przeciwciał. Jako jedyne mogą przenikać przez łożysko i chronią rozwijający się płód. Występują one w czterech podklasach: IgG1-IgG4. Cechują się doskonałą specyficznością w stosunku do antygenów. Ponieważ podobne cechy (duża ilość i wysoka specyficzność) cechują IgG zwierzęce są one szeroko wykorzystywane w metodach immunologicznych. Ponieważ klasa przeciwciała jest determinowana przez regiony stałe łańcucha ciężkiego, istnieje możliwość stworzenia uniwersalnych przeciwciał przeciwko danej klasie immunoglobulin. Przeciwciała te rozpoznają epitopy znajdujące się na fragmencie Fc przeciwciała lub regionach stałych fragmentów Fab. Najczęściej tego typu przeciwciała stosuje się w testach pośrednich, znakując je markerem enzymatycznym lub fluorescencyjnym. W efekcie otrzymujemy uniwersalne przeciwciało rozpoznające określoną klasę immunoglobulin (np. IgG) pochodzących od określonego gatunku (np. królika, myszy). Przeciwciała poliklonalne i monoklonalne W testach immunologicznych używa się dwóch podstawowych typów przeciwciał: poliklonalnych i monoklonalnych. Przeciwciała poliklonalne uzyskuje się w wyniku 286
szczepienia organizmu gospodarza antygenem, przeciwko któremu chcemy uzyskać przeciwciało. Antygen, posiadający szereg determinant antygenowych może w efekcie wzbudzić reakcję kilku różnych klonów limfocytów B, które przy współpracy limfocytów Th przekształcają się w plazmocyty zdolne do biosyntezy i wydzielania poza komórkę przeciwciał. W surowicy organizmu gospodarza pojawiają się przeciwciała skierowane przeciwko różnym determinantom antygenowym podanego antygenu. Przeciwciała mogą także różnić się powinowactwem w stosunku do określonej determinanty. Ponieważ przeciwciała takie produkowane są przez różne klony komórek B, nazywamy je poliklonalnymi. Przed wykorzystaniem przeciwciał poliklonalnych oczyszcza się je z innych białek surowicy i izoluje określoną klasę (najczęściej IgG). Ponieważ przeciwciała przeciwko interesującemu nas antygenowi stanowią zaledwie 1-5% ogólnej puli przeciwciał, wymagają one dalszego oczyszczenia w tym celu najczęściej wykorzystuje się chromatografię powinowactwa. Ze względu na poliklonalny charakter przeciwciała, jest ono mniej wrażliwe na drobne zmiany budowy antygenowej antygenu, np. na jego polimorfizm, glikozylację, czy łagodną denaturację. W przypadku tego typu przeciwciał nie jest wymagana absolutna homologia pomiędzy antygenem, którym szczepiono organizm gospodarza, a antygenem wykrywanym. Może to stanowić pewien problem w metodach, w których chcemy uniknąć potencjalnych reakcji krzyżowych. O ile przeciwciała te łatwo uzyskać w dużych ilościach, to ze względu na sposób ich otrzymywania, poszczególne serie produkcyjne mogą się różnić, w efekcie przeciwciała z poszczególnych serii mogą posiadać nieco różne właściwości. Najczęściej jako organizm gospodarza wykorzystuje się myszy, szczury, króliki, owce, rzadziej konie i małpy. Im większy organizm tym więcej możemy uzyskać interesującego nas przeciwciała. Aby zwiększyć immunogenność antygenu często sprzęga się go z różnymi makromolekułami nośnikowymi, np. innymi białkami, lub dodaje się związków ułatwiających tworzenie dużych kompleksów, które są bardziej immunogenne i wywołują silniejszą odpowiedź immunologiczną. Jako nośniki najczęściej używa się albuminy surowicy bydlęcej (BSA), owalbuminy lub metaloproteiny hemolimfy Megathura crenulata (KLH - Keyhole limpet hemocyanin), ze względu na łatwość jej pozyskania i olbrzymią masę cząsteczkową (do 13 MDa). 287
Tabela 7.1. Porównanie przeciwciał poli- i monoklonalnych. Przeciwciała poliklonalne Przeciwciała monoklonalne Niedrogie w produkcji Drogie w produkcji Łatwe w produkcji Skomplikowana produkcja, wymagane duże umiejętności Szybko się je otrzymuje Dłuższy czas do otrzymania przeciwciała Przy okazji powstaje dużo niespecyficznych Otrzymuje się dużo specyficznych przeciwciał przeciwciał, lecz wysoka specyficzność może być problemem Rozpoznają różne epitopy na tym samym Rozpoznają tylko jeden epitop na antygenie antygenie Poszczególne serie przeciwciała mogą się różnić Po uzyskaniu hybridomy, uzyskuje się identyczne przeciwciała, stąd praktycznie brak różnic pomiędzy seriami W przeciwieństwie do przeciwciał poliklonalnych, przeciwciała monoklonalne pochodzą od jednego klonu limfocytów B. Ponieważ limfocyt B może syntetyzować tylko jeden typ immunoglobuliny, jeśli go namnożymy to otrzymamy komórki syntetyzujące identyczne przeciwciała. Będą one posiadały identyczne regiony zmienne, a co za tym idzie zdolność do łączenia się ze ściśle określoną determinantą antygenową. Jednak problemem w przypadku limfocytów B jest ich ograniczona zdolność do podziałów i ograniczony czas życia. Aby ominąć te ograniczenia, dokonuje się fuzji limfocyta B produkującego pożądane przeciwciało z komórką szpiczaka (nowotwór wywodzący się z plazmocytów) pochodzącego z tego samego gatunku co limfocyt. W efekcie uzyskujemy hybrydę o pożądanych właściwościach komórkę, która po limfocycie B ma zdolność do biosyntezy interesującej nas immunoglobuliny, a po komórce szpiczaka nieśmiertelność i zdolność do nieograniczonych podziałów. Otrzymane hybrydy (hybridoma) można hodować in vitro, co jest bardzo kosztowne. Stąd też najczęściej wszczepia się te komórki do jamy otrzewnowej organizmu gospodarza, gdzie się namnażają i produkują przeciwciała. Pozyskuje się je z płynu pobieranego z jamy otrzewnej, a następnie oczyszcza. Przeciwciała monoklonalne dają mniej reakcji krzyżowych, w efekcie ich zastosowanie w różnych metodach immunologicznych wiąże się z mniejszym sygnałem tła, z drugiej strony 288
ich wysoka specyficzność może utrudniać wiązanie się z nieco zmodyfikowanymi antygenami. Koniugaty przeciwciał Aby wykryć obecność przeciwciała w mieszaninie znakuje się go wybranym markerem. Jako marker można wykorzystać: izotopy, najczęściej 125 I obecnie rzadko stosowane. Powstające koniugaty mają krótki okres półtrwania (związany z okresem połowicznego rozpadu izotopu), w efekcie takie koniugaty nie mogą być przechowywane przez dłuższy czas. kompleks streptawidyna-biotyna. Przeciwciało zwykle znakuje się biotyną, która jest związkiem niskocząsteczkowym, łatwym do przyłączenia do immunoglobuliny. Tak znakowane przeciwciało wykrywa się wykorzystując powinowactwo awidyny do biotyny. Jednocześnie cząsteczka awidyny może być wyznakowana jedną z poniższych metod. enzymy najczęściej wykorzystuje się do znakowania peroksydazę chrzanową lub fosfatazę alkaliczną. Ten sposób znakowania jest prosty, tani, a otrzymane koniugaty cechują się dużą stabilnością, w efekcie tak znakowane przeciwciała można przechowywać miesiącami w temp. 4 C lub latami w stanie zamrożenia. związki fluorescencyjne najczęściej jest to fluoresceina (FITC) lub fikoerytryna (P). Obecnie mamy do dyspozycji kilkaset markerów, które mogą być sprzęgnięte z przeciwciałem. Powstające kompleksy są stabilne, a wykorzystanie fluorescencji znacznie zwiększa czułość metody. Dodatkową zaletą jest brak konieczności stosowania substratów dających zabarwienie, tak jak to było w przypadku znakowania enzymami. pierwiastki ziem rzadkich (terb, europ, lantan, dysproz) lub ich kryptaty. Połączenie z przeciwciałem jest stabilne, a unikalne właściwości fluorescencyjne metalu umożliwiają stosowanie na raz kilku przeciwciał, co obniża koszty oznaczeń. Ze względu na sposób detekcji, zastosowanie tego typu znakowania wiąże się z olbrzymią czułością. Procesowi koniugacji można poddać przeciwciało przeciwko interesującemu nas antygenowi (wykorzystujemy to w metodach bezpośrednich) lub częściej przeciwciała antyglobulinowe. W ten sposób dysponujemy uniwersalnym przeciwciałem. Przy jego pomocy możemy wykryć dowolne przeciwciało należące do klasy przeciwko której skierowane jest przeciwciało antyglobulinowe (metody pośrednie). 289
Metody Ze względu na wykonanie i sposób detekcji metody immunologiczne możemy podzielić na: metody homogenne w których cała reakcja odbywa się w jednej fazie. W fazie wodnej znajdują się zarówno przeciwciała jak i antygeny, które wykrywamy. metody heterogenne w tych metodach jeden z komponentów, najczęściej przeciwciało jest zaabsorbowane na powierzchni nośnika, najczęściej płytki polistyrenowej lub mikrocząsteczki, pozostałe etapy reakcji odbywają się w środowisku wodnym. Ze względu na sposób wykrywania związania się przeciwciała metody dzielimy na: RIA (radioimmunoassay) przeciwciało znakowane jest izotopem promieniotwórczym, wykrywa się jego obecność przy pomocy licznika scyntylacyjnego, IA (enzymeimmunoassay) przeciwciało znakowane jest enzymatycznie, jego obecność wykrywa się poprzez dodanie substratu dla zastosowanego enzymu, który po reakcji zmienia kolor. Przykładowe substraty wymieniono w tabeli 7.2. LIA (luminoimmunoassay) przeciwciało znakowane jest enzymatycznie tak jak w metodzie IA, z tym, że do detekcji wykrywa się substrat, który w wyniku przekształcenia przez enzym (najczęściej HRP peroksydaza chrzanowa) emituje foton. W efekcie metoda jest nawet 1000-razy czulsza niż IA. Do jej wad należy nieco wyższa cena (wyższa cena substratu) oraz konieczność posiadania specjalistycznego sprzętu luminometru. Jako substrat najczęściej wykorzystuje się lucyferynę, która utleniając się emituje światło: lucyferyna + O 2 + ATP oksylucyferyna + foton + AMP + PPi FIA (fluoroimmunoassay) przeciwciało znakowane jest fluorescencyjnie (np. FITC lub P), pomiar wykonuje się przy pomocy fluorymetru. Tabela 7.2. Substraty dla enzymów stosowane w technikach IA. nzym Substrat Kolor OPD (ortofenylodiamina) żółty Peroksydaza TMB chrzanowa (HRP) niebieski (3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna) Fosfataza alkaliczna Fosforan p-nitrofenolu żółty (AP) 290
Technika MIT Jedną z najprostszych technik homogennych jest technika MIT (nzyme Multiplied Immunoassay). Służy ona do wykrywania i pomiaru stężenia leków w surowicy krwi, a także szybkiego wykrywania różnych niskocząsteczkowych związków. Ponieważ większość leków ma stosunkowo niską masę cząsteczkową, zazwyczaj zawierają one jedną determinantę antygenową. W efekcie do cząsteczki leku przyłącza się najczęściej tylko jedno przeciwciało, co utrudnia jej wykrycie innymi technikami. W technice MIT do badanej próbki (np. surowicy) dodaje się znaną ilość antygenu (leku) którego obecność chcemy wykryć, lecz znakowanego enzymem lub markerem fluorescencyjnym. W efekcie w surowicy znajduje się nieokreślone stężenie poszukiwanego antygenu i ściśle określone stężenie antygenu znakowanego. Do takiej mieszaniny dodaje się przeciwciał przeciwko poszukiwanemu antygenowi, o takich właściwościach, że jeśli połączą się one z antygenem znakowanym, to zablokują aktywność przyłączonego do niego enzymu lub wyciszą fluorescencję przyłączonego markera fluorescencyjnego. W efekcie im w badanej próbce jest mniej antygenu, tym więcej przeciwciała połączy się z antygenem znakowanym, hamując reakcję enzymatyczną lub wyciszając fluorescencję. Z kolei im w próbce więcej badanego antygenu, tym więcej zaabsorbuje on przeciwciała, w efekcie większa ilość antygenu związanego z markerem będzie wolna, co spowoduje wzrost szybkości reakcji enzymatycznej lub wzrost fluorescencji w przypadku zastosowania markera fluorescencyjnego. 291
I tap II tap antygen poszukiwany przeciwciało wolne (w roztworze) antygen kontrolny znakowany enzymem Metodą MIT monitoruje się stężenie niektórych leków (np. stosowanych w leczeniu padaczki), wykrywa obecność substancji toksycznych i leków w surowicy i w moczu. Technika ta jest prosta, szybka i stosunkowo tania. LISA Obecnie najpopularniejszą metodą oznaczania stężenia analitu jest LISA (nzyme-linked immunosorbent assay) i jej pochodne. Jest to metoda heterogenna, w której przeciwciało lub oznaczana substancja opłaszczona jest na fazie stałej, którą stanowi odpowiednio aktywowana płytka polistyrenowa. Zazwyczaj stosuje się płytki 96-dołkowe, 384-dołkowe, a w pełni zautomatyzowanych laboratoriach także płytki 1536-dołkowe. Dzięki temu jednorazowo można wykonać odpowiednio 96, 384 lub 1536 oznaczeń (tak naprawdę mniej, gdyż próbki muszą być oznaczane co najmniej w duplikatach, część dołków jest także zajęta przez krzywe kalibracyjne). W przypadku LISA i innych nowoczesnych metod immunologicznych, stosuje się płytki co najmniej 96-dołkowe. Cena oznaczenia obejmuje cenę za płytkę, stąd też w przypadku mniejszych laboratoriów lub rzadziej oznaczanych analitów laboratoria 292
gromadzą próbki przez dłuższy czas, w celu zapełnienia całej płytki. W takim przypadku czas oczekiwania na wyniki znacznie się wydłuża. Sama metoda zajmuje około 3-6 godzin. W zwykłej metodzie IA poszukiwany antygen opłaszcza się bezpośrednio na płytce polistyrenowej. Płytka posiada powierzchnię o wysokim powinowactwie do białek, DNA i polisacharydów. Po opłaszczeniu poszukiwanym antygenem niezwiązane miejsca na płytce blokuje się jakimś neutralnym związkiem, najczęściej jest to albumina bydlęca (BSA). Po przepłukaniu dołka, dodaje się przeciwciała przeciwko poszukiwanemu analitowi. Przeciwciało to może być znakowane mówimy wtedy o metodzie bezpośredniej, lub nieznakowane. W tym drugim przypadku musimy dodać surowicy antyglobulinowej przeciwko naszemu pierwszemu przeciwciału, znakowanej w jeden z wcześniej wymienionych sposobów. W przypadku, kiedy stosujemy pierwszorzędowe przeciwciało i surowicę antyglobulinową mówimy o metodzie pośredniej. Obecnie częściej stosuje się tzw. metodę kanapkową (sandwich). W tej metodzie płytka opłaszczona jest przeciwciałami skierowanymi przeciwko poszukiwanemu antygenowi. Są to tzw. przeciwciała wychwytujące (capture antibody). Po zablokowaniu niezwiązanych miejsc, dodaje się badaną próbkę. Przeciwciała wychwytujące opłaszczone na płytce wyłapują z roztworu poszukiwany analit. Po przepłukaniu dołka, na płytce zostają przeciwciała związane z wychwyconym analitem. Następnie do dołka dodaje się przeciwciało detekcyjne łączące się z inną determinantą antygenową analitu (detection antibody), które może być znakowane (metoda kanapkowa bezpośrednia) lub nieznakowane. W tym drugim przypadku wymagane jest podobnie jak we wcześniej opisanej technice dodanie surowicy antyglobulinowej ze znakowanymi przeciwciałami (metoda pośrednia). 293
antygen poszukiwany przeciwciało zaadsorbowane na polistyrenie przeciwciało sprzężone z enzymem Rysunek 7.2. Metoda kanapkowa bezpośrednia. Do płytki przytwierdzone zostały przeciwciała, które wychwytują z próbki oznaczany analit. Następnie dodaje się przeciwciał znakowanych enzymem. antygen poszukiwany przeciwcia ło zaadsorbowane na polistyrenie przeciwciało wolne (w roztworze) surowica antyglobulinowa sprzężona z enzymem Rysunek 7.3. Metoda kanapkowa pośrednia. Reakcję przeprowadzamy tak jak w metodzie bezpośredniej, z tym, że przeciwciało detekcyjne nie jest znakowane. Wymaga to dodania kolejnego przeciwciała (drugorzędowego) przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu. Przeciwciała drugorzędowe jest znakowane. 294
Metoda kanapkowa posiada wiele zalet w stosunku do zwykłych metod IA: jest zdecydowanie czulsza, dzięki wychwytywaniu analitu przez przeciwciało wychwytujące, daje dokładniejsze wyniki wiązania analitu z płytką nie zaburza współistnienie innych substancji występujących w próbce, można nią łatwo oznaczać stężenie substancji, które nie wiążą się bezpośrednio z powierzchnią płytki, np. lipidy, drobnocząsteczkowe sacharydy, peptydy, jest szybsza czas wiązania analitu z przeciwciałem jest krótszy niż czas wymagany do wiązania analitu z powierzchnią płytki (2 godziny vs. 8-12 godzin). Warto też porównać metody bezpośrednie z metodami pośrednimi. W metodach bezpośrednich: czas wykonania jest krótszy, gdyż wymagana jest inkubacja tylko z jednym przeciwciałem, ponieważ mamy tylko jedno przeciwciało mogą one być tańsze i prostsze w wykonaniu, wadą jest konieczność posiadania koniugatu przeciwciała przeciwko poszukiwanemu antygenowi. Nie zawsze tego typu koniugaty są dostępne, a proces znakowania przeciwciała zazwyczaj podwyższa jego koszt. Z kolei metody pośrednie mają istotne zalety: potencjalnie są czulsze. Dodanie kolejnego przeciwciała wzmacnia sygnał i w efekcie ułatwia detekcję analitu. nie musimy posiadać znakowanego przeciwciała pierwszorzędowego. Zamiast tego używamy uniwersalnej (skierowanej przeciwko dowolnym immunoglobulinom określonej klasy pochodzącym z określonego zwierzęcia) surowicy antyglobulinowej. Jest ona tańsza w produkcji. niestety wadą jest dłuższy czas wykonania, co wynika z konieczności inkubacji z dwoma przeciwciałami, koszty mogą być podobne jak metod bezpośrednich lub nieco wyższe. Jeśli w wymienionych wcześniej metodach znakowanie przeciwciała enzymem zastąpimy znakowaniem fluorochromem to otrzymamy metodę FIA, a jeśli jako enzym zastosujemy lucyferazę lub peroksydazę i dodamy substratu luminescencyjnego to otrzymamy metodę LIA. Metody LIA nazywane bywają metodami III generacji (metody IA to metody II generacji, a obecnie rzadko stosowane metody RIA to metody I generacji). Dla lekarza niezwykle ważna jest znajomość metod stosowanych przez laboratorium. Metody III 295
generacji są najczulsze i najdokładniejsze, lecz także najdroższe. Wymagają one specjalistycznego sprzętu (luminometru), w efekcie nie każde laboratorium ich używa. W niektórych przypadkach metoda, którą posługuje się laboratorium ma znaczenie. Tak jest np. w przypadku oznaczania stężenia TSH. Najpopularniejsze metody II generacji cechują się średnią czułością, natomiast najczulsze są metody III generacji (tabela 7.3). Tabela 7.3. Porównanie czułości różnych technik immunologicznych służących do oznaczania stężenia TSH. Generacja testu Czułość I generacja (RIA) 1-2 µui/ml II generacja (IA) 0,1-0,2 µui/ml III generacja (LIA) 0,01-0,02 µui/ml W efekcie testy II generacji nie zawsze poprawnie rozróżniają osoby na granicy prawidłowej funkcji tarczycy i jej nadczynności, a także pacjentów z subkliniczną niedoczynnością tarczy. Testy III generacji nie mają z tym najmniejszych problemów. W efekcie to jaki test zlecamy zależy od stanu klinicznego pacjenta, spodziewanych rezultatów i postaci diagnozowanej choroby. Przy okazji warto też wspomnieć, że testy wykrywające ten sam antygen, lecz różnych producentów mogą znacznie różnić się czułością i specyficznością, a co za tym idzie przydatnością diagnostyczną. Dla przykładu w tabeli 7.4 podano czułość, specyficzność, dodatnią i ujemną wartość predykcyjną dla wybranych testów LISA wykrywających HBsAg (dane z HBsAg Assays: Operational Characteristics Report 2 WHO). Widzimy, że o ile ujemna wartość predykcyjna testów (NPV) jest zbliżona i sięga prawie 100%, to dodatnia wartość predykcyjna (PPV) znacznie się różni i jest niewielka, w przypadku, kiedy prawdopodobieństwo zakażenia HBV jest mniejsze niż 5-10%. W efekcie o ile ujemny wynik testu praktycznie wyklucza zakażenie HBV, to wynik pozytywny niekoniecznie może być wystarczającym dowodem na zakażenie (wyjątkiem jest prezentowany test 4, który także w tym przypadku miał PPV równe 100%). Stąd też niektórzy pacjenci mogą wymagać dodatkowego potwierdzenia zakażenia innymi testami np. molekularnymi (real-time PCR, western blot). Podobna zasada dotyczy wszystkich testów immunologicznych. Stąd ścisła współpraca lekarza z laboratorium jest warunkiem absolutnie niezbędnym dla przeprowadzenia poprawnego procesu diagnostycznego. 296
Tabela 7.4. Porównanie różnych testów wykrywających obecność HBsAg. Parametr Test 1 Test 2 Test 3 Test 4 Czułość (CI) 100% 100% 100% 100% (96,3-100%) (96,3-100%) (96,3-100%) (96,3-100%) Specyficzność (CI) 99,4% (96,9-100%) 98,3% (95,2-99,7%) 98,9% (96-99,9%) 100% (97,0-100%) 1% 62,7% 37,3% 47,9% 100% PPV 5% 89,9% 75,6% 82,7% 100% 10% 94,9% 86,7% 91,0% 100% 1% 100% 100% 100% 100% NPV 5% 99,9% 100% 100% 100% 10% 100% 100% 100% 100% Technika kompetycyjna Jedną z odmian testów jest technika kompetycyjna (rys. 7.4). W technice tej na płytce zaabsorbowane są przeciwciała przeciwko poszukiwanemu antygenowi. Po dodaniu próbki, część przeciwciał zwiąże się z antygenem. Następnie dodaje się antygenu znakowanego im więcej analitu było w próbce tym mniej antygenu znakowanego się przyłączy (miejsca wiązania będą wysycone), w efekcie intensywność reakcji enzymatycznej będzie mniejsza. Technika ta wymaga tylko jednego przeciwciała, dlatego doskonale nadaje się w sytuacji w której oznaczamy niskocząsteczkowe antygeny posiadające tylko jedną determinantę antygenową. 297
I tap II tap antygen pos zukiwany przeciwciało zaadsorbowane na polistyren ie antygen kon trolny sprzężony z enzymem Rysunek 7.4. Technika kompetycyjna. Metody TRF Metody TRF (time-resolved fluorescence) wykorzystują do detekcji koniugaty sprzężone z lantanowcami. Cechują się one zdolnością do fosforescencji (często nieprawidłowo nazywaną fluorescencją). W przypadku fluorescencji, charakteryzującej fluorochromy, pod wpływem światła o określonej długości fali (ekscytacja) dochodzi do praktycznie natychmiastowej (opóźnienie od femto do pikosekund) emisji światła o większej długości fali (emisja) przez fluorochrom. Długość fali ekscytacji i emisji są charakterystyczne dla każdego fluorochromu, co umożliwia ich rozróżnienie. W przypadku zjawiska fosforescencji, pod wpływem ekscytacji dochodzi do emisji promieniowania ale z opóźnieniem wynoszącym od nanosekund nawet do kilku sekund. misja promieniowania utrzymuje się zatem przez pewien czas od chwili zakończenia pobudzenia. Takimi właściwościami cechują się m.in. niektóre lantanowce: terb, dysproz, europ i samar. Początek emisji dla lantanowców waha się od 16 µs dla dysprozu aż do 1050 µs dla terbu. Dzięki temu fosforescencję lantanowców można łatwo odróżnić od autofluorescencji wykazywanej przez wiele substancji znajdujących się w surowicy krwi i innych materiałach biologicznych. Powoduje to, że metody wykorzystujące lantanowce należą do najczulszych metod detekcji, zdolnych do wykrywania 298
substancji w stężeniach femtomolowych. Ponieważ każdy z lantanowców ma charakterystyczną długość fali wzbudzenia, emisji oraz czas pomiędzy wzbudzeniem a emisją, fosforescencję pochodzącą od poszczególnych lantanowców można łatwo rozróżnić, co stwarza możliwości multipleksowania oznaczeń wykonania jednoczasowo w tej samej próbce oznaczeń 1-4 różnych analitów. Powoduje to znaczne obniżenie kosztów analizy. Wadą metody DLFIA i metod opartych na TRF jest konieczność posiadania specjalistycznego sprzętu fluorymetru zdolnego do pomiarów fluorescencji w funkcji czasu od kilku do kilku tysięcy mikrosekund od zakończenia wzbudzenia. Ponieważ koszty tego typu aparatury przekraczają 100 tys. zł, niewiele laboratoriów może się posługiwać metodami DLFIA. Niemniej, są to metody o doskonałej czułości, powtarzalności, a multipleksowane są tańsze od innych metod analitycznych. DLFIA Metoda DLFIA (Dissociation-nhanced Lanthanide Fluorescent Immunoassay) jest metodą heterogenną, na którą patent posiada firma Perkin-lmer. Wykorzystuje ona do detekcji przeciwciała sprzężone z lantanowcami: terbem, dysprozem, europem lub samarem. Przebieg metody zbliżony jest do techniki LISA, z tym że przeciwciała są znakowane lantanowcami a nie enzymatycznie. W efekcie w jednym dołku można oznaczać do czterech różnych analitów, przy tym samym nakładzie pracy mamy możliwość oznaczenia czterech różnych substancji. W efekcie potencjalnie może to znacznie obniżyć koszty oznaczenia. Wysoka czułość (możliwość detekcji analitów w stężeniach femtomolowych) powoduje, że do oznaczenia potrzebne jest mniej przeciwciał, co jeszcze bardziej obniża koszty. Niestety metoda ta wymaga bardzo kosztownej aparatury. Metody TRF homogenne Odmianą metod TRF są metody homogenne, takie jak HTRF. Metody te wykorzystują zjawisko fluorescencji opóźnionej w czasie (fosforescencji, TRF) w połączeniu ze zjawiskiem FRT (Förster Resonance nergy Transfer). Zjawisko to polega na bezpośrednim przekazywaniu energii wzbudzenia z akceptora na donor. Zarówno akceptor, jak i donor w technice TRF są fluorochromami, to znaczy, że donor posiada charakterystyczną długość fali wzbudzenia, a akceptor charakterystyczną długość fali emisji. Zjawisko FRT zachodzi wyłącznie jeśli odległość pomiędzy donorem a akceptorem nie przekracza 10 nm. 299
Absorpcja fotonu misja fotonu Transfer energii Odległość Förstera Rysunek 7.5. Zasada metody FRT. W metodach tych akceptorem może być zarówno typowy fluorochrom, jak i kryptat lantanowca. W tym drugim przypadku mamy możliwość połączenia techniki FRT z charakterystycznym dla lantanowców opóźnieniem emisji promieniowania. W efekcie dostajemy jedne z najczulszych (możliwość detekcji attomolowych (10-18 ) i niższych stężeń analitu) i najbardziej specyficznych metod. W metodach tych najczęściej stosuje się dwa różne przeciwciała skierowane przeciwko różnym determinantom antygenowym tego samego analitu. Jedno z przeciwciał znakowane jest donorem, a drugie akceptorem. W przypadku przyłączenia do analitu obu przeciwciał donor i akceptor znajdują się w odległości mniejszej niż odległość Förstera (typowo <10 nm) i zachodzi zjawisko przekazywania energii, obserwujemy więc emisję fotonów o częstotliwości charakterystycznej dla zastosowanego akceptora. Jeśli dojdzie do niespecyficznego związania się jednego z przeciwciał z analitem nie zachodzi zjawisko FRT i nie obserwujemy emisji promieniowania. W efekcie specyficzność tej techniki jest zdecydowanie wyższa niż innych technik immunologicznych. Opisana metoda, jako metoda homogenna jest niezwykle prosta do przeprowadzenia zazwyczaj do badanej próbki dodaje się tylko koktajlu przeciwciał (dwóch przeciwciał znakowanych akceptorem i donorem), po krótkiej inkubacji można wprost odczytać wyniki. Metoda nie wymaga żadnych etapów płukania i dodawania kolejnych reagentów, jest więc szybka. Wadą metody, podobnie jak w przypadku metody DLFIA jest konieczność posiadania odpowiedniego sprzętu, który niestety jest bardzo drogi. 300
Inne metody wykrywania białek Przedstawione do tej pory metody cechowały się ogromną czułością, ale wymagały także specjalistycznego sprzętu, co podwyższa koszty ich wykonania. W wielu przypadkach wysoka czułość nie jest wymagana, a bywa wręcz wadą. W osoczu krwi występuje wiele diagnostycznie ważnych białek, których stężenie mieści się w przedziale od miligramów do gramów na litr, jak np. CRP, haptoglobiny, fibrynogen, immunoglobuliny i inne. Jakkolwiek białka te można oznaczać metodami wcześniej wymienionymi, to wymagają one wstępnego rozcieńczenia badanego materiału kilkaset do kilkuset tysięcy razy, co jest niewygodne i wprowadza dodatkowy błąd. Stąd też ciągle stosuje się metody starsze, mnie czułe, ale doskonale nadające się do oznaczania analitów występujących w surowicy w większym stężeniu. Do metod tych zaliczamy metody nefelometryczne, turbidymetryczne, immunodyfuzję i immunofiksację. Nefelometria i turbidymetria Metody te polegają na pomiarze rozproszenia (nefelometria) lub absorpcji (turbidymetria) światła przechodzącego przez niejednorodny roztwór. Odmiana tej metody wykorzystująca przeciwciała to immunonefelometria i immunoturbidymetria. Po dodaniu do próbki badanej przeciwciała zachodzi reakcja antygen-przeciwciało, w wyniku której w roztworze mogą wytrącać się precypitaty kompleksów antygen-przeciwciało. Precypitacja ta widoczna jest w roztworze jako zmętnienie. Jest ono tym większe im więcej oznaczanego antygenu było w roztworze. W efekcie wzrost rozproszenia światła lub wzrost absorpcji jest proporcjonalny do stężenia badanego analitu. Metody te cechują się stosunkowo niewielką czułością (w zakresie miligramów do setek miligramów na dl), lecz czułość można poprawić opłaszczając przeciwciała na cząsteczkach lateksu, w efekcie tworzą się większe kompleksy immunologiczne, bardziej pochłaniające lub rozpraszające światło. Po takiej modyfikacji czułość metody rośnie 10-100 razy, umożliwiając oznaczanie białek w stężeniach poniżej 1 mg/dl. Metodami tymi oznacza się często stężenie CRP (hscrp), D-dimerów, czynnika reumatoidalnego i innych analitów występujących w stosunkowo wysokim stężeniu. Metoda ta nie wymaga skomplikowanego sprzętu, odczyt możliwy jest przy pomocy zwykłego spektrofotometru. Immunodyfuzja Kolejną powszechnie stosowaną metodą o niskiej czułości jest immunodyfuzja, najczęściej w postaci odmiany metody immunodyfuzji radialnej (wg Mancini). W metodzie tej przeciwciało przeciwko poszukiwanemu antygenowi jest immobilizowane w agarze. Agar z 301
przeciwciałem rozlewa się na płytki petriego, a następnie wycina w nim dołki, do których dodaje się próbki badanej. W wyniku dyfuzji próbki badanej w agarze dochodzi do reakcji pomiędzy przeciwcialem w agarze a dyfundującym antygenem. W miejscu, w którym stężenie antygenu odpowiada mniej więcej stężeniu przeciwciała tworzą się duże kompleksy immunologiczne mające zdolność do precypitacji. Precypitację kompleksów widzimy w postaci białego okręgu na agarze wokół miejsca nałożenia próbki. W miejscu, w którym stężenie antygenu jest dużo wyższe niż przeciwciała kompleksy nie mogą się utworzyć, gdyż zbyt mała ilość przeciwciał uniemożliwia kompleksowanie sąsiednich antygenów. Z kolei w miejscu, gdzie stężenie antygenu jest niższe niż przeciwciała, nadmiar przeciwciał również uniemożliwia tworzenie większych kompleksów, a w efekie precypitację. Ponieważ w wyniku dyfuzji antygen rozchodzi się w agarze, jego stężenie maleje z kwadratem odległości od dołka w którym nałożono próbę badaną. Stąd średnica powstającego okręgu precypitacji jest proporcjonalna do początkowego stężenia antygenu w próbce. Mierząc tą średnicę możemy półilościowo oznaczyć stężenie badanej substancji. Czułość metody można poprawić wybarwiając agarozę barwnikami specyficznie łączącymi się z białkiem. Metądą immunodyfuzji radialnej oznacza się stężenie immunoglobulin, α 2 -makroglobuliny, albuminy, CRP, łańcuchów lekkich immunoglobulin typu i. Metoda jest bardzo tania i nie wymaga żadnego sprzętu odczyt następuje przy pomocy linijki. Wadą metody jest długi czas dyfuzji wymaga ona 24-48 a czasami więcej godzin inkubacji. Agaroza z immobilizowanymi przeciwciałami Pierścień precypitacji proporcjonalny do stężenia antygenu Dołek na próbkę 302
Rysunek 7.6. Immunodyfuzja radialna wg Mancini. Immunofiksacja Metoda ta obecnie jest najczęściej wykonywana jako połączenie immunofiksacji i elektroforezy (IF immunofixation electrophoresis). W pierwszym etapie badaną próbkę rozdziela się na żelu lub membranie, identycznie jak w przypadku elektroforezy białek. Daną próbkę rozdziela się na kilku ścieżkach. Po przeprowadzeniu elektroforezy poszczególne ścieżki rozdziela się, a następnie żel lub błonę inkubuje z przeciwciałami. W miejscu gdzie przeciwiciało zwiąże się z antygenem tworzą się precypitaty, które można łatwo wykryć wybarwiając rozdział. Metoda ta jest stosunkowo szybka (wykonanie trwa ok. 1-3 godzin), tania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Wykorzystuje się ją najczęściej do oznaczania półilościowego i jakościowego immunoglobulin ich łańcuchów ciężkich oraz łańcuchów lekkich typu i. Materiałem badanym najczęściej jest surowica, mocz lub płyn mózgowordzeniowy. Najczęściej metodę tą stosuje się w diagnostyce chorób rozrostowych wywodzących się z limfocytów B (np. chłoniaków lub szpiczaków). Rozdziały inkubowane ze specyficznymi przeciwciałami Rozdział wzorcowy wybarwiony na białko Kierunek elektroforezy Rysunek 7.7. Imunofikcacja i wykrywanie immunoglobulin oraz ich łańcuchów lekkich. 303
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA ĆWICZNI 1 OZNACZANI STĘŻNIA NDOTLINY W OSOCZU MTODĄ LISA Immunoenzymatyczne oznaczanie endoteliny opiera się na technice kanapkowej. ndotelina obecna w badanej próbce wiąże się z wcześniej płaszczonymi na płytce przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko endotelinie. Składniki, które nie zostały związane w pierwszej reakcji immunologicznej są wypłukiwane. Druga reakcja immunologiczna polega na łączeniu kompleksów immunologicznych ze sprzężonymi z peroksydazą przeciwciałami monoklonalnymi. Po przemyciu, które usuwa nie związane koniugaty, dodaje się substratu dla peroksydazy. W wyniku reakcji enzym-substrat powstaje barwny produkt. Reakcja enzymatyczna jest zatrzymywana przez dodanie odczynnika przerywającego reakcję, którym jest kwas siarkowy. ndotelina jest ilościowo oznaczana poprzez pomiar absorbancji przy użyciu czytnika do LISA. Długość fali 492 nm. ZASADA MTODY Osocze uzyskane z krwi pobranej na antykoagulant (wersenian dwupotasowy - DTA). Osocze lipemiczne lub hemoliza nie wpływają na oznaczenie. ODCZYNNIKI Przeciwciała opłaszczające (przeciwciała monoklonalne przeciwko endotelinie) Wzorzec endoteliny - 1,0 pmol/l Koniugat (monoklonalne przeciwciała mysie anty-igg sprzężone z peroksydazą) Substrat dla peroksydazy TMB (tetrametylobenzydyna) 0,3% roztwór H2O2 Roztwór hamujący reakcję 1 mol/l H2SO4 Mieszanina płucząca 304
WYKONANI Płytka serologiczna jest opłaszczona przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko endotelinie. Na płytkę serologiczną odpipetować: Próba ślepa Próba wzorcowa Próba badana Wzorzec endoteliny - 200 µl - Próba badana - - 200 µl Płytki przykryć plastikową taśmą i inkubować 10 min. w temperaturze 37 C w cieplarce. Dołki opróżnić odwracając płytkę jednym energicznym ruchem. Pozostawić na ligninie na chwilę, dnem do góry. Płukać 3-krotnie po 350 µl mieszaniną płuczącą, opróżniając dołki - jak podano wyżej. Koniugat 200 µl 200 µl 200 µl Płytki przykryć taśmą i inkubować 10 min. w 37 C. Płukać 3-krotnie mieszaniną płuczącą - jak podano wyżej. Substrat 200 µl 200 µl 200 µl H 2 O 2-20 µl 20 µl H 2 O 20 µl - - Inkubacja płytki przez 10 min. w temperaturze 37 C. H 2 SO 4 20 µl 20 µl 20 µl Pomiar absorbancji przy użyciu czytnika do LISA. Długość fali 492 nm. OBLICZNIA gdzie: A B A W A 0 A B - A 0 x 1,0 = stężenie endoteliny (pmol/l) A W - A 0 absorbancja próby badanej absorbancja próby wzorcowej absorbancja próby zerowej 1,0 stężenie wzorca endoteliny 305