PODSTAWY IMMUNOHISTOCHEMII. Odpowiedź immunologiczna. Determinanty antygenowe (epitopy) Surowice. Antygeny

Transkrypt

1 PODSTAWY IMMUNOHISTOCHEMII Odpowiedź immunologiczna zachodzi pomiędzy antygenem, a układem odpornościowym wyróżniamy dwa rodzaje odpowiedzi: humoralną i komórkową Antygeny substancje obce dla organizmu, najczęściej o strukturze wielkocząsteczkowej zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej (tu: produkcji przeciwciał) - IMMUNOGENNOŚĆ *** zdolne do swoistego reagowania z produktem reakcji immunologicznej (przeciwciałami) - ANTYGENOWOŚĆ Determinanty antygenowe (epitopy) - fragmenty cząsteczki antygenu, z którymi reagują przeciwciała *** - wyjątek: hapteny Struktura cząsteczki immunonoglobulin klasy IgG,, domeny H poliwalentne Surowice monowalentne L polik liklonalne monoklonalne Fab 2x 1

2 Otrzymywanie przeciwciał poliklonalnych Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych immunizacja zwierząt kilkukrotne podanie parenteralne antygenu z adjuwantem pobranie krwi i uzyskanie oczyszczonej surowicy C. Milstein: Monoclonal Antibodies. Scientific American 1980, vol. 243, issue 4, pp The 1984 Nobel Prize in Physiology or Medicine: Niels K. Jerne, Georges J.F. Köhler and César Milstein Reakcja antygen-przeciwcia przeciwciało stereospecyficzne łączenie przeciwciała i determinanty antygenowej - odległość pomiędzy cząsteczkami nm sprzyja powstawaniu bardzo licznych wiązań van Der Waalsa i innych słabych oddziaływań nie powstają wiązania kowalencyjne Reakcja antygen-przeciwcia przeciwciało, a metoda IHC - każda substancja (białko) pochodzące ce od jednego gatunku jest antygenem dla osobnika innego gatunku - immunoglobuliny jednego gatunku stanowią antygen dla osobników w innego gatunku Metody immunohistochemiczne dzięki wykorzystaniu swoistych przeciwciał pozwalają na identyfikację w materiale histologicznym specyficznych białek (antygeny) dzięki czułym metodom detekcji umożliwiaj liwiają rozpoznanie bardzo małych ilości antygenu Znakowanie przeciwciał MIKROSKOPIA ŚWIETLNA enzymy fluorochromy MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA ferrytyna złoto koloidalne 2

3 Znakowanie enzymami E Enzymy stosowane w IHC peroksydaza chrzanowa (HRP) alkaliczna fosfataza (AP) oksydaza glukozowa (Aspergillus niger) β-galaktozydaza (E. coli) Chromogeny PEROKSYDAZA 3,3 diaminobenzydyna (DAB) 3amino-9etylokarbazol (AEC) 4chloro-1naftol (CN) Znakowanie fluorochromami FOSFATAZA ALKALICZNA new fuchsin fast red F Fluorochromy Fluorochromy - przykłady ENERGIA światło wzbudzenia F światło emisji ENERGIA pochodne fluoresceiny (np. FITC), Cy2, AlexaFluor 488 pochodne rodaminy (np. TRITC), Cy3, Texas Red, AlexaFluor 555 pochodne kumaryny (np. AMCA), AlexaFluor 405 FITC wzbudzenie - max. 494 nm emisja - max. 520 nm Mikroskop epifluorescencyjny Cy5, AlexaFluor 647 emisja w widmie podczerwieni 3

4 reakcja bezpośrednia reakcja pośrednia dwuetapowa znacznik np. fluorochrom przeciwciało pierwotne przeciwciało wtórne - znakowane reakcja pośrednia PAP (peroxidase anti-peroxidase peroxidase) reakcja pośrednia ABC (avidin-biotin complex) HRP przeciwciało wtórne - biotynylowane HRP reakcja pośrednia LAB (labeled avidin*-biotin biotin) Reakcja z polimerami reakcja dwuetapowa HRP przeciwciało wtórne - biotynylowane *... lub streptavidin (LSAB) 4

5 OBRAZY Uwagi praktyczne utrwalanie materiału i odtwarzanie miejsc wiązania przeciwciał (metody przygotowania skrawków) preinkubacja z normalną, nieimmunogenną surowicą blokowanie endogennej aktywności enzymatycznej inkubacje z przeciwciałami (rozcieńczenia, czas) oraz płukanie w buforze pomiędzy etapami (przyklejanie skrawków) podwójne barwienia reakcje kontrolne tło i podbarwianie problemy z fluorochromami Mózg czł człowieka - astrocyty Zawią Zawiązek koń kończyny wzrastają wzrastające wł włókna nerwowe GFAP GAPGAP-43 HE Migdał Migdałek podniebienny CD20 Płuca ciał ciałka neuroepitelialne (NEBs) NEBs) w drogach oddechowych CD3 CGRP PARV 5

6 Unerwienie tę tętnicy w mięś niu szkieletowym mięśniu GAP-43 PGP 9.5 Zwó Zwój mię międzykrę dzykręgowy Blaszka miaż miażdżycowa w aorcie Jelito cienkie śródścienne sploty nerwowe: Auerbacha Meissnera PGP 9.5 PGP 9.5 GAP-43 CGRP Oil red - barwienie potró niowe potrójne: kom. mięś mięśniowe gładkie, adkie, limfocyty T, T, makrofagi SMA SMA CD3 CD68 CD3 CD68 Linia komó komórek HeLa IMMUNOCYTOCHEMIA α tubulin Komó Komórki biał białaczkowe linia K562 AIF Hoechst Caspase 3 Hoechst 6