Ćwiczenie 3 Elementy syntezy i chromatografii luminoforów organicznych. Akrydyna należy do znanych luminoforów organicznych (rysunek poniżej). Z powodu licznych zastosowań praktycznych, zagadnienia syntezy tego typu układu są przedmiotem wielu badań. Reakcje większości akrydyn na atomie azotu z elektrofilami są, ogólnie rzecz biorąc, podobne do reakcji, którym ulega pirydyna i jej pochodne. Schemat najważniejszych tego typu przemian w przypadku najprostszego azaanalogu benzenu przedstawiono poniżej. N Kwasy protonowe tworzą odpowiednie sole, kwasy Lewisa związki koordynacyjne, metale przejściowe kompleksy, fluorowce- addukty, a halogenki alkilowe i acylowe oraz aktywne estry alkilowe czwartorzędowe sole. Aktywowane alkeny i alkiny dają czwartorzędowe sole (reakcja Michaela), a wodorotlenki i nadkwasy organiczne utleniają pirydyny do N-tlenków. Podstawniki elektronodonorowe, szczególnie w pozycji para, aktywują atom azotu, zaś podstawniki elektronoakceptorowe mają wpływ przeciwny. Z kolei objętościowe podstawniki w pozycjach orto osłaniają dostęp do pary elektronowej atomu azotu i często utrudniają większość wspomnianych reakcji.
Związkami akrydyny o szczególnym znaczeniu praktycznym jest kwas akrydynylo-9- karboksylowy oraz 9-akrydon. Estry aromatyczne tego kwasu są zdolne do wydajnej chemiluminescencji w środowisku alkalicznym, bez konieczności stosowania katalizatora, w związku z czym znalazły zastosowanie w ultraczułych technikach analitycznych (umożliwiają wykrycie analitu na poziomie dochodzącym do 10-15 mola). Wydajność całkowita emisji światła tego typu układów dochodzi do 7 %, co określa się mianem wydajnej chemilumninescencji. Metoda otrzymywania wspomnianych estrów aromatycznych polega na reakcji chlorku kwasu akrydynylo-9-karboksylowego z odpowiednim fenolem w obecności N,N-dimetylo-4- aminopirydyny jako katalizatora. Prawdopodobny mechanizm działania katalizatora przedstawiono poniżej. R O C Cl N(CH 3 ) 2 + + O H N Ph N(CH 3 ) 2 N - HCl O C R OPh + N(CH 3 ) 2 N Cl C R O Reakcja przebiega wydajnie w temperaturze pokojowej w obecności czynnika wiążącego chlorowodór, trietyloaminy. Aby umożliwić rozpuszczanie w wodzie tego typu pochodnych, a także zwiększyć wydajność procesu chemiluminescencji, estry tego typu poddaje się czwartorzędowaniu. Ze względu na obecność dezaktywującej grupy estrowej w pozycji 9 rdzenia akrydyny, konieczne jest użycie efektywnego czynnika alkilującego, np. trifuorometanosulfonianu metylowego. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) jest szybką, tanią i czułą techniką diagnostyczną o ogromnym znaczeniu praktycznym we współczesnej syntezie organicznej. Pozwala ona monitorować przebieg reakcji, określać wstępnie czystość związków oraz dobierać układy rozpuszczalników stosowane następnie do preparatywnego oczyszczania pochodnych metodami chromatografii cieczowej. Ujemną cechą chromatografii TLC jest zależność rezultatów od bardzo wielu czynników, które nie zawsze można kontrolować (jest ich około 25). Oto niektóre z nich: - rodzaj fazy stacjonarnej, - skład fazy ruchomej, - stopień wysycenia parami rozpuszczalnika komory chromatograficznej, - rozmiar ziaren i grubość warstwy fazy stacjonarnej, - nierównomierności fazy stacjonarnej, - wielkość sygnału startowego (stężenie i objętość próbki nanoszonej), - temperatura, - dodatki obecne w fazie stałej (np. wskaźniki fluorescencyjne) - zanieczyszczenia obecne w fazie ruchomej, - długość drogi rozdziału i inne. W czasie rozdziału chromatograficznego tzw. prostego wielokrotnie powtarzane są procesy adsorpcji i desorpcji zachodzące pomiędzy fazą ciekłą (zwykle mało lub średnio polarną), a stałym podłożem o charakterze polarnym (typowo rolę tę pełni tlenek krzemu (IV) lub tlenek glinu). Uproszczony mechanizm tego procesu chromatograficznego przedstawiono poniżej.
Równowagi pojawiające się w trakcie procesu chromatograficznego. A: adsorpcja, G nośnik fazy stałej (zwykle szkło lub folia Al), M faza ruchoma (rozpuszczalnik), ο - powierzchnia fazy stacjonarnej. Składnik oznaczony trójkątem preferuje przebywanie na powierzchni fazy stałej (tzn. adsorpcję na powierzchni), gdyż jest bardziej polarny. Z kolei drugi składnik, oznaczony kółkiem, przebywa chętniej w fazie ruchomej, ze względu na swoją niższą polarność. W trakcie napływania świeżej fazy ruchomej te cząsteczki, które pozostały w rozpuszczalniku przepływają dalej. Obsadzają one dostępne wolne miejsca na powierzchni fazy stacjonarnej, która jednak preferuje składnik bardziej polarny. Innymi słowy dla składnika bardziej polarnego równowaga przesunięta jest w stronę adsorpcji, zaś dla składnika mniej polarnego w stronę rozpuszczania. Po wielu powtórkach takich procesów, substancje ulegają mniej lub bardziej dokładnemu rozdzieleniu. Cząsteczki substancji oznaczonej kółkami wędrują szybciej, ze względu na swoją niższą polarność. Z kolei cząsteczki substancji oznaczonej trójkątami wędrują wolniej, gdyż jako bardziej polarne silniej oddziałują z fazą stałą. Poniżej podano najważniejsze parametry stosowane w chromatografii TLC. - współczynnik R F (współczynnik zatrzymania): b droga subst. R F = = a droga rozp. - współczynnik R ST (względny współczynnik zatrzymania): b droga subst. R ST = = a droga std.
Sposób wyznaczania wartości R F i R ST Czoło rozpuszczalnika Standard Substancja Substancja Start Start Wartość R F Wartość R ST Wysokosprawna chromatografia cieczowa jest techniką o wiele bardziej kosztowną niż TLC, ale ze względu na możliwości analityczne jest dziś nieodzownym elementem syntezy organicznej. Pozwala ona na standaryzowanie wyników, określenie współczynników zatrzymania (parametrów retencji), ilościowe określanie czystości związków a także, do pewnego stopnia, na śledzenie mechanizmów reakcji. W połączeniu z detekcją luminescencyjną czy metodami takimi jak spektrometria mas (LC-MS) stanowi ona dziś jedno z najwartościowszych narzędzi badawczych. Procesy fizyczne, jakie mają miejsce w kolumnie do chromatografii HPLC są podobne do tych jakie zachodzą w chromatografii prostej (TLC). Zasadnicza różnica polega na tym, że w chromatografii HPLC stosuje się zwykle tzw. fazy odwrócone, to znaczy że faza stacjonarna jest niepolarna albo mało polarna, zaś faza ruchoma to układ rozpuszczalników o wysokiej polarności. Zwykle jako fazę stacjonarną stosuje się modyfikowaną krzemionkę, to jest taką, w której do wolnych grup hydroksylowych przyłączono długie łańcuchy alkilowe (C8 C18), zaś typowe fazy ruchome stosowane w tej technice to wszelkiego rodzaju roztwory buforowe z domieszką rozpuszczalników organicznych takich jak metanol acetonitryl czy kwas trifluorooctowy. W rezultacie w czasie rozdziału obowiązują odwrotne relacje jak to ma miejsce w chromatografii prostej substancja bardziej polarna pojawia się pierwsza u szczytu kolumny, zaś mniej polarna później. Podobnie relacje dotyczą modyfikacji fazy ruchomej: zwiększenie stężenia składnika mniej polarnego (modyfikatora organicznego) powoduje że rozdzielana substancja szybciej pojawia się u wylotu kolumny w porównaniu z układem pierwotnym. Najważniejsze parametry wykorzystywane w chromatografii HPLC. Efektywność kolumny Ilość płytek teoretycznych (N) i wysokość półki teoretycznej chromatograficznej (H): Gdzie X oznacza dystans przebyty przez substancję w kolumnie, a W jest szerokością pasma chromatograficznego. Typowe wartości dla standardowych kolumn chromatograficznych N = 10,000-15,000; H = 6-10 µm.
Efektywność a selektywność rozdziału chromatograficznego. Górny rysunek: niska selektywność, wysoka efektywność. Dolny rysunek: wysoka selektywność, niska efektywność. Rozdzielczość chromatograficzna (R S ) Sposób wyznaczania: Czas retencji (t R ), czas martwy (t O ) t R (czas retencji) to czas po którym badana substancja przechodzi przez kolumnę i pojawia się w detektorze. t O (czas martwy) to czas po którym substancja nie oddziałująca ze fazą stałą (niesorbująca, np. D 2 O) przechodzi przez kolumnę i pojawia się w detektorze. Współczynnik retencji (pojemnościowy) (k ) Współczynnik retencji (k ) jest to iloraz zredukowanego czasu retencji (t R t O ) i czasu retencji substancji niesorbującej (t O ); wyznacza się go z chromatogramu. t R to k' = t O
Metoda HPLC może wspomagać badanie złożonych korelacji typu budowa aktywność dla wielu związków organicznych. Po wyznaczeniu wartości k dla danej substancji, a następnie obliczeniu wartości log k można sporządzić zależność ostatniego parametru od zawartości modyfikatora organicznego w fazie ciekłej, która dla wielu układów ma w przybliżeniu charakter liniowy. Prostą tego typu można wyrazić równaniem: log k = s ρ% + log k w, gdzie s to współczynnik kierunkowy prostej, ρ% - zawartość modyfikatora organicznego w fazie ciekłej (zmienna x), zaś log k w to wyraz wolny, który jest względną miarą hydrofobowości badanego związku. (hydrofobowość to, ogólnie rzecz biorąc, tendencja do preferowania środowisk niewodnych niepolarnych, będąca wypadkową wielu cech substancji i zależna również od środowiska). Wartości log k w dla wielu pochodnych korelują z wartościami współczynników podziału badanych substancji w układzie oktanol-woda (log P), które można określić eksperymentalnie lub teoretycznie. Obydwa parametry mają duże znaczenie w tzw. testach korelacyjnych typu QSAR wykorzystywanych w projektowaniu leków. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie z elementami nowoczesnej syntezy organicznej. Obejmuje ono: 1. Przeprowadzenie ostatniego etapu syntezy związku luminezującego (estru akrydyniowego lub pochodnej 9-akrydonu), a następnie jego izolację. 2. Wykonanie chromatogramu TLC w celu określenia stopnia przemiany; ewentualne oczyszczenie produktu na płycie PTLC. 3. Wykonanie badań produktu metodą HPLC i określenie: - czystości i czasu retencji (R T ) połączenia w danym układzie; - wpływu obecności podstawników na czas retencji dla zadanej grupy luminoforów; - wpływu ilości modyfikatora organicznego na czas retencji luminofora. 4. Wywołanie reakcji chemiluminescencji i wstępne określenie tożsamości produktów reakcji metodą chromatografii HPLC - analiza mieszaniny poreakcyjnej; - zarejestrowanie chromatogramów dla zadanych wzorców. Wykonanie ćwiczenia Synteza estru akrydyniowego Estry arylowe kwasu akrydynylo-9-karboksylowego rozpuścić w 1-2 cm 3 suchego dichlorometanu. Do roztworów dodać ok. 5-10 mg 2,6-di-t-butylopirydyny osadzonej na nośniku polimerycznym. Następnie, mieszając, wprowadzić ok. 5-krotny nadmiar molowy estru metylowego kwasu trifluorometanosulfonowego (CF 3 OSO 2 CH 3 ) (uwaga, substancja toksyczna!) i kontynuować reakcję przez 1 godz.. Roztwór przefiltrować przez filtr strzykawkowy (PTFE) i do przesączu dodać nadmiar (ok. 10-krotny) eteru etylowego. Żółty produkt, trifluorometanosulfonian estru arylowego kwasu 9-karboksy-10- metyloakrydyniowego odsączyć, osuszyć i zważyć. Zachować do dalszych badań. Chromatografia TLC Sporządzić chromatogram TLC otrzymanej soli akrydynowej przez rozpuszczenie próbki związku w niewielkiej ilości alkoholu etylowego i naniesienie za pomocą kapilary kropli roztworu na start płytki TLC pokrytej żelem krzemionkowym (SiO2). Obok nanieśc w analogiczny sposób próbkę substratu (odpowiedniej zasady). Po wysuszeniu, rozwijać płytkę w małej, kondycjonowanej komorze chromatograficznej zawierającej układ chloroform/kwas
trifluorooctowy (CHCl 3 /TFA) = 40/1 obj./obj. Po zakończeniu procesu płytkę wysuszyć i obejrzeć pod lampą UV (rtęciową). Zaznaczyć ołówkiem sygnały i zachować płytkę do dalszych badań. Chromatografia HPLC Zarejestrować, stosując metodę HPLC w odwróconych fazach, czasy retencji oraz czystość (% powierzchni sygnału) dla otrzymanej soli (3 nastrzyki), stosując jako fazę ruchomą układ acetonitryl / woda (60 / 40 % obj.) z dodatkiem 2 mm fosforanów (NaH 2 PO 4 + Na 2 HPO 4 ) o ph końcowym = 3.5. Jako fazę stacjonarną zastosować modyfikowaną hydrofobowo krzemionkę (kolumna typu C-18 lub C-OPh (fenoksylowa)). Powtórzyć analizy jak wyżej, stosując układy ciekłe o zmniejszającej się zawartości modyfikatora organicznego (acetonitryl / woda): 50/50; 30/70; 10/90. Szczegóły dot. przygotowania do pracy i obsługi zestawu chromatograficznego HPLC firmy Waters zostaną podane przez prowadzącego. Wywołanie chemiluminescencji i analiza produktów reakcji Wywołać reakcję CL we fiolce o pojemności 1-3 ml, stosując następujące ilości odczynników: roztwór soli akrydynowej w acetonitrylu ( stock solution ; c = 5 10-3 M) (20 µl) roztwór 0.06 % H 2 O 2 w 0.01 M HNO 3 (100 µl) roztwór 0.2 M NaOH w wodzie (100 µl) 1 kropla stężonego kwasu ortofosforowego (H 3 PO 4 ). ph końcowe powinno wynosić = 3.5. Zaobserwować zjawisko chemiluminescencji. Po całkowitym zakończeniu reakcji (2 min.) pobrać próbkę mieszaniny poreakcyjnej i wykonać 2-3 próby w tym samym układzie chromatograficznym, w którym wykonywano analizy soli akrydyniowej. Na końcu zarejestrować chromatogramy substancji wzorcowych: 10-metylo-9-akrydonu, kwasu 9-karboksy-10-metyloakrydyniowego oraz odpowiedniego fenolu. Opracowanie wyników 1. Napisać schemat przemian (wzory strukturalne) prowadzących do otrzymania trifluorometanosulfonianu estru fenylowego kwasu 9-karboksy- 10-metyloakrydyniowego wychodząc z kwasu akrydynylo-9-karboksylowego. Obliczyć wydajność reakcji tworzenia soli akrydyniowej. 2. Wyznaczyć współczynniki R F substratu (zasady) i produktu (soli) na płytce TLC. 3. Na podstawie chromatografów HPLC podać uśrednione wartości czasu retencji (R T ) oraz czystości (% powierzchni sygnału) dla produktu oraz substratu. Wyznaczyć wartości parametru retencji (k ) dla soli akrydynowej przy różnych zawartościach modyfikatora organicznego (ρ%), a następnie obliczyć wartości log k. Sporządzić wykres typu: log k = f(ρ%) i dodać liniową funkcję trendu, podać jej parametry i współczynnik korelacji. 4. Dokonać analizy chromatogramu HPLC mieszaniny poreakcyjnej oraz wzorców; podać skład mieszaniny poreakcyjnej oraz oszacować zawartość procentową każdego z produktów. 5. Przeprowadzić dyskusję otrzymanych wyników: - czy synteza soli akrydyniowej może być uznana za wydajną i dlaczego wymaga stosowania drastycznego czynnika metylującego,
- wytłumaczyć wartości współczynników R F dla substratu i produktu otrzymane metodą TLC. - wytłumaczyć wartości czasów retencji (R T ) dla badanych związków otrzymane metodą HPLC. Ocenić, czy otrzymany produkt można uznać za czysty chemicznie (> 98%). - skomentować zależność log k = f (ρ%). Podać wartość parametru hydrofobowości log k w. - przedyskutować pochodzenie składników w mieszaninie poreakcyjnej. Na podstawie literatury wyjaśnić ew. pojawienie się sygnału od kwasu 9-karboksy-10- metyloakrydyniowego. Literatura: 1. J. Młochowski, Chemia związków heterocyklicznych, PWN, Warszawa 1994. 2. J.A. Joule, G.F. Smith, Chemia związków heterocyklicznych PWN, Warszawa 1984. 3. A. Albert, The Acridines, Edward Arnold Publ. LTD, London 1966. 4. Praca zbiorowa (red. J.J. Kirkland), Współczesna chromatografia cieczowa, PWN Warszawa 1976.