RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1660095 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 23.07.2004 04743516.9 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 13.01.2010 Europejski Biuletyn Patentowy 2010/02 EP 1660095 B1 (13) T3 (51) Int. Cl. A61K31/5517 A61P35/00 C07D487/06 (2006.01) (2006.01) (2006.01) (54) Tytuł wynalazku: Tricykliczne inhibitory PARP (30) Pierwszeństwo: GB20040008524 GB20030017466 16.04.2004 25.07.2003 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 31.05.2006 Europejski Biuletyn Patentowy 2006/22 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 30.07.2010 Wiadomości Urzędu Patentowego 07/2010 (73) Uprawniony z patentu: Cancer Research Technology Limited, London, GB Pfizer, Inc., New York, US PL/EP 1660095 T3 (72) Twórca (y) wynalazku: HELLEDAY Thomas, Stockholm, SE Curtin Nicola, Rowlands Gill, GB (74) Pełnomocnik: Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o. rzecz. pat. Tagowska Magdalena 02-770 Warszawa 130 skr. poczt. 37 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
Opis [0001] Wynalazek dotyczy serii związków, które są pochodnymi tricyklicznych laktamoindoli i tricyklicznych laktamobenzimidazoli i które hamują polimerazę poli(adp-rybozy) (PARP) oraz ich zastosowania do leczenia raka, a zwłaszcza raka sutka. [0002] Wykazano, że homologiczna rekombinacja (HR) odgrywa ważną rolę w naprawie uszkodzeń powstałych przy widełkach replikacyjnych DNA w komórkach ssaczych (2). A zatem, komórki z niewystarczającą HR wykazują opóźniony wzrost oraz wyższe poziomy niestabilności genetycznej. Uważa się, że niestabilność genetyczna w nowotworach ludzkich związana z utratą naprawy HR w znacznym stopniu przyczynia się do rozwoju raka w tych komórkach (1). [0003] Ważną rolę w naprawie DNA, regulacji apoptozy i utrzymaniu stabilności genomowej odgrywa potranskrypcyjna modyfikacja białek jądrowych przez poli(adp-rybozyl)ację w odpowiedzi na przerwanie nici DNA. [0004] Polimeraza poli(adp-rybozy) (PARP-1) jest głównym członkiem rodziny enzymów PARP i jest białkiem jądrowym obficie występującym w komórkach ssaczych. PARP-1 katalizuje tworzenie się polimerów poli(adprybozy) (PAR), z zastosowaniem NAD + jako substratu. Po uszkodzeniu DNA, PARP-1 szybko wiąże się z pęknięciami jednoniciowymi DNA (SBB) i katalizuje addycję ujemnie naładowanych łańcuchów PAR (automodyfikacja) oraz innych białek [omówienie, patrz (3,4)]. Uważa się, że wiązanie się PARP-1 z SBB powstrzymuje uszkodzenia DNA przed dalszym przetwarzaniem, aż do dysocjacji PARP-1 od pęknięcia przez zakumulowane ładunki ujemne z polimerów PAR (5,6). [0005] Aczkolwiek PARP-1 uczestniczy w kilku procesach jądrowych, takich jak modulacja struktury chromatyny, replikacja DNA, naprawa i transkrypcja DNA, myszy pozbawione PARP-1 rozwijają się prawidłowo (7). Komórki wyizolowane od tych myszy wykazują fenotyp hiperrekombinacji i niestabilność genetyczną w postaci zwiększonych poziomów wymiany chromatyd siostrzanych (SCE), mikrojąder i tetraploidów. U myszy pozbawionych PARP-1 niestabilność genetyczna może również objawiać się poprzez skrócenie telomerów, zwiększenie częstości fuzji chromosomów i aneuploidy (11), aczkolwiek wyniki takie nie mogły być powtarzane w innej grupie myszy z brakiem PARP-1 (12). W pierwszej grupie myszy knockout, brak mutacji PARP-1 u myszy SCID (13) wspomagał upośledzoną rekombinację V(D)J. [0006] Wyniki te potwierdzają stanowisko sugerowane przez Lindahl i współpracowników, że PARP-1 pełni rolę ochronną przeciwko rekombinacji (5). Wnioskowano, że wiązanie się PARP-1 z pęknięciami ssdna chroni mechanizm rekombinacji przed rozpoznawaniem i przetwarzaniem uszkodzeń DNA albo, alternatywnie, że ładunki ujemne zakumulowane w następstwie poli(adp-rybozyl)acji odpychają sąsiednie rekombinogenne sekwencje DNA. Jedynie ten ostatni model jest zgodny z hamowaniem samego PARP-1 i wyrażaniem dominującego negatywnego mutanta, obejmującego SCE, amplifikację genu i rekombinację homologiczną (14-18). [0007] Badania polegające na traktowaniu komórek inhibitorami PARP-1 lub prowadzone na komórkach pochodzących od myszy pozbawionych PARP-1 wykazują, że zahamowanie aktywności PARP-1 zwiększa podatność komórek na czynniki uszkadzające DNA i hamuje ponowne połączenia pęknięć nici (3, 4, 8-11, 19, 20). 1
[0008] W WO 01/16136 A i WO 00/42040 A ujawniono wiele różnych związków tricyklicznych, które hamują aktywność PARP. Canon Koch i in. (Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 45, 2002, str. 4961-4974) opisują przeciwrakową aktywność inhibitorów PARP-1 wzmagającą działanie chemioterapii. [0009] Inhibitory aktywności PARP-1 stosowano w kombinacji z tradycyjnymi sposobami leczenia raka, takimi jak radioterapia i chemioterapia (21). Gdy inhibitory stosowano w kombinacji z czynnikami metylującymi, inhibitorami topoizomerazy typu poison i promieniowaniem jonizującym, stwierdzono, że zwiększają one skuteczność tych form leczenia. Jednakże, terapie takie są nieselektywne i jako takie powodują uszkodzenia i śmierć nierakowych lub zdrowych komórek. Ponadto, jak wiadomo, terapie takie powodują nieprzyjemne skutki uboczne. [0010] A zatem, jest wysoce pożądane dostarczenie terapii antyrakowej, która jest zarówno skuteczna, jak i selektywna w zwalczaniu komórek rakowych, ale której nie trzeba podawać w kombinacji z radioterapią lub chemioterapią. [0011] Nieoczekiwanie stwierdzono, że komórki z niedoborem rekombinacji homologicznej (HR), w porównaniu z komórkami typu dzikiego, są nadwrażliwe na inhibitory PARP. [0012] A zatem, zgodnie z pierwszym aspektem obecnego wynalazku, dostarczono związku o wzorze I, II lub III, albo jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, do stosowania jako lek cytotoksyczny do leczenia raka, który jest spowodowany przez genetyczny defekt genu, który pośredniczy w homologicznej rekombinacji. 2
[0013] Opisane tu związki można wytworzyć sposobami syntezy, takimi jak ujawnione w WO 00/42040 i WO 01/16136. [0014] Należy rozumieć, że w niniejszym opisie wszelkie odniesienia do związków o wzorach I do III obejmują również ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. [0015] Powoływane tu farmaceutycznie dopuszczalne sole obejmują sole metali, fosforany i czwartorzędowe aminy. Sole metali można wytwarzać z metalami alkalicznymi, takimi jak lit, sód lub potas. [0016] Korzystnie, związek o powyższym wzorze I, podaje się w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej soli fosforanowej o następującym wzorze: Wzór I fosforan [0017] Wynalazek obecny dotyczy również terapeutycznego zastosowania opisanych tu związków. [0018] Zgodnie z dalszym aspektem obecnego wynalazku, dostarczono zastosowania terapeutycznej ilości związku o wzorze I, II lub III, lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, do wytwarzania leku cytotoksycznego do leczenia raka spowodowanego przez genetyczny defekt genu, który pośredniczy w homologicznej rekombinacji. [0019] Rak spowodowany przez genetyczny defekt genu, który pośredniczy w homologicznej rekombinacji, obejmuje zwłaszcza raka sutka. [0020] Stosowane tu określenie rak lub nowotwór obejmuje, ale bez ograniczeń, raka płuc, okrężnicy, trzustki, żołądka, jajnika, szyjki macicy, sutka, prostaty, kości, mózgu lub skóry. [0021] Inhibitory PARP stosuje się do leczenia raka spowodowanego genetycznym defektem genu, który pośredniczy w rekombinacjach homologicznych. Komórki raka tego typu wykazują tendencję do niedoborów HR. 3
[0022] Specyficzna wrażliwość guzów z niedoborem HR na hamowanie PARP oznacza, że prawidłowo dzielące się zdrowe komórki u pacjentów, wykazujące dostateczne ilości HR nie będą w znacznym stopniu podatne na takie leczenie. [0023] Inną zaletę leczenia z zastosowaniem inhibitorów PARP stanowi fakt, że inhibitorów tych nie trzeba podawać w terapii skojarzonej z konwencjonalnym leczeniem radioterapią lub chemioterapią, dzięki czemu unika się skutków ubocznych towarzyszących tym konwencjonalnym formom leczenia. [0024] Defekt w genie, który pośredniczy w homologicznej rekombinacji, może być związany z mutacją, nieobecnością lub upośledzoną ekspresją genu kodującego białko zaangażowane w HR. [0025] Komórki rakowe, nadające się do leczenia opisanymi tu związkami, mogą być częściowo lub całkowicie pozbawione HR. Korzystnie, komórki wykazują całkowity brak HR. [0026] Opisane tu związki można stosować do leczenia dziedzicznych form raka, w których leczony pacjent ma rodzinne predyspozycje do raka. Jednakże, związki te są szczególnie odpowiednie do leczenia związanego z genem dziedzicznego raka, a najkorzystniej związanego z genem dziedzicznego raka sutka. [0027] W korzystnym aspekcie, inhibitor PARP jest użyteczny do leczenia komórek rakowych z niedoborem ekspresji genu zaangażowanego w HR. Geny, dla których sugeruje się rolę w HR, obejmują XRCC1, ADPRT (PARP-1), ADPRTL2, (PARP02), CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51b, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCCR, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NB51, WRN, BLM KU70, KU80, ATM, ATR CHK1, CHK2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RAD1, RAD9 [omówienie, patrz (2, 3, 5, 22-28)]. [0028] Genem zaangażowanym w HR może być gen supresorowy nowotworu. Tak więc, wynalazek dostarcza leczenia komórek rakowych z niedoborem ekspresji supresorowego genu nowotworu. Korzystnie, genem supresorowym nowotworu jest BRCA1 lub BRCA2. [0029] Wśród kobiet na zachodzie najczęstszym typem raka jest rak sutka. W niektórych rodzinach występują silne predyspozycje do raka sutka, których przyczyną jest często odziedziczona mutacja w jednym z alleli, BRCA1 lub BRCA2. Jednakże, jeden z funkcjonalnych alleli jest zachowany. A zatem, osoby z taką mutacją rozwijają się prawidłowo i nie wykazują związanych z tą mutacją konsekwencji fenotypowych. Jednakże, w jednej z komórek funkcjonalny allel może być utracony, co powoduje, że komórka taka rakowacieje i jednocześnie wykazuje niedobór HR. Etap ten jest istotny dla początku nowotworu (1). [0030] Komórki rakowe, które mają być leczone, mogą wykazywać częściowo lub całkowicie upośledzoną ekspresję BRCA1 lub BRCA2. Upośledzenia takie można zidentyfikować technikami multipleksowej PCR (29, 30) lub innymi metodami skriningowymi, znanymi specjalistom. Szczególnie przydatne techniki obejmują ilościową PCR w czasie rzeczywistym, Northern blot, immunohistochemię oraz Western Blot (31, 32). [0031] Związki o wzorach I, II i III są przydatne do leczenia wielu wybranych guzów rakowych i są użyteczne do leczenia pacjenta cierpiącego na raka spowodowanego genetycznym defektem genu, który pośredniczy w HR. [0032] Opisane tu związki można podawać w terapeutycznie skutecznej, nietoksycznej ilości, dowolną drogą odpowiednią do skutecznego dostarczania do komórek rakowych. Odpowiednie drogi podawania obejmują, ale bez ograniczeń, następujące drogi podawania: doustnie, dożylnie, domięśniowo, śródskórnie lub miejscowo. 4
[0033] Terapeutycznie skuteczną ilością opisanych tu związków jest na ogół ilość, która jest wystarczająca do osiągnięcia żądanego skutku i ilość taka może się zmieniać w zależności od charakteru i zaawansowania stanu chorobowego oraz siły działania związku. Oczywiste jest, że w profilaktyce można stosować inne stężenia niż w leczeniu aktywnej choroby. [0034] Oczekuje się, że przy podawaniu ssakom, a zwłaszcza ludziom, dawka dzienna środka aktywnego będzie mieścić się w zakresie od 0,01 do 50 mg/kg dla myszy i od 0,01 mg/m 2 do 50 mg/m 2 powierzchni ciała u ludzi. Jednakże, ilość podawanego składnika aktywnego oraz częstość jego podawania będzie ostatecznie zależna od oceny lekarza prowadzącego. [0035] Korzystnie, do uzyskania skutku terapeutycznego wymagane są jedynie bardzo niskie dawki związków hamujących PARP, co skutkuje zmniejszoną układową akumulacją leku i tym samym zminimalizowaniem towarzyszących mu skutków toksycznych. [0036] Aczkolwiek opisane tu związki można podawać same, jako związek surowy, korzystnie związki te podaje się w kompozycji farmaceutycznej. [0037] Wszystkie sposoby formułowania i wytwarzania takich kompozycji farmaceutycznych obejmują na ogół etap łączenia jednego z opisanych tu związków z nośnikiem, który stanowi jeden lub więcej składników pomocniczych. Na ogół, formulacje wytwarza się przez równomierne i jednorodne połączenie związku o wzorze I z ciekłym nośnikiem lub subtelnie rozdrobnionym stałym nośnikiem, albo z obydwoma takimi nośnikami, a następnie, w razie potrzeby, przez uformowanie produktu do postaci żądanych preparatów. [0038] Formulacje odpowiednie do podawania doustnego mogą być w postaci odrębnych jednostek, takich jak kapsułki, opłatki, tabletki lub pastylki, z których każda zawiera określoną ilość jednego z opisanych tu związków; w postaci proszku lub granulek; albo w postaci zawiesiny w wodnej lub niewodnej cieczy, takiej jak syrop, eliksir, emulsja lub dawka ciekła leku (ang. draught). Każdy z opisanych tu związków może być również w postaci preparatu typu bolus, powidełka lub pasty. [0039] Tabletkę można wytworzyć przez sprasowanie lub formowanie, ewentualnie z jednym lub więcej składnikami pomocniczymi. Sprasowane tabletki można wytworzyć przez sprasowanie, w odpowiednim urządzeniu, dowolnego z opisanych tu związków w postaci sypkiej, takiej jak proszek lub granulki, ewentualnie po zmieszaniu z substancją wiążącą, substancją poślizgową, obojętnym rozcieńczalnikiem, środkiem powierzchniowo czynnym lub substancją dyspergującą. Tabletki formowane można wytworzyć przez formowanie w odpowiednim urządzeniu mieszaniny dowolnego z opisanych tu związków w postaci sproszkowanej z odpowiednim nośnikiem. [0040] Syrop można wytworzyć przez dodanie jednego z opisanych tu związków do stężonego, wodnego roztworu cukru, na przykład, sacharozy, do której można dodać odpowiedni żądany składnik pomocniczy. Takie składniki pomocnicze obejmują substancje smakowo-zapachowe, środek opóźniający krystalizację cukru lub środek zwiększający rozpuszczalność innego składnika, taki jak alkohol poliwodorotlenowe, na przykład glicerol lub sorbitol. [0041] Formulacje do podawania doodbytniczego mogą być w postaci czopków z typowym nośnikiem, takim jak masło kakaowe. [0042] Formulacje do podawania pozajelitowego korzystnie obejmują sterylny wodny preparat jednego z opisanych tu związków, który korzystnie jest izotoniczny z krwią biorcy. [0043] Oprócz wymienionych wyżej składników, formulacje, na przykład maści, kremy itp., mogą zawierać jedną lub więcej substancji pomocniczych, na przykład, rozcieńczalnik, bufor, substancję smakowo- 5
zapachową, substancję wiążącą, środek powierzchniowo czynny, zagęszczacz, substancję smarującą i/lub konserwant (obejmujący przeciwutleniacz) lub inne farmaceutycznie obojętne substancje pomocnicze. [0044] Związki można również formułować do podawania w formulacjach liposomowych, które można wytworzyć dobrze znanymi w technice sposobami. [0045] Kompozycje farmaceutyczne można wytworzyć, stosując jako składnik aktywny związek o wzorze I, II lub III, albo jego farmaceutycznie dopuszczalną sól. [0046] Kompozycja farmaceutyczna może ponadto obejmować co najmniej jeden inny składnik stanowiący kompatybilny farmaceutycznie dopuszczalny dodatek, nośnik, rozcieńczalnik lub substancję pomocniczą i może być w postaci dawki jednostkowej. [0047] Nośnik(i) musi być farmaceutycznie dopuszczalny, co oznacza, że musi on być kompatybilny z innymi składnikami formulacji i nieszkodliwy dla biorcy. [0048] Możliwe formulacje obejmują formulacje do podawania doustnego, doodbytniczego, miejscowego i pozajelitowego (obejmującego podawanie podskórne, domięśniowe i dożylne) lub do podawania do płuc lub przez inne miejsca absorpcji, takie jak kanały nosowe. [0049] Opisane tu związki można podawać w kombinacji z innymi związkami przeciwrakowymi. [0050] Opisane tu związki oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole można podawać w sposobach leczenia raka u ssaków. [0051] Wynalazek zilustrowano, jedynie przykładowo, w odniesieniu do załączonych figur, na których: Figura 1 przedstawia wykres, na którym zilustrowano przeżycie komórek w obecności inhibitora PARP o wzorze III dla linii komórkowych AA8, IsrISR i CxR3; Figura 2 przedstawia wykres, na którym zilustrowano przeżycie komórek w obecności inhibitora PARP o wzorze III dla linii komórkowych V79, VC8 i VC8B2; Figura 3 przedstawia wykres, na którym zilustrowano przeżycie komórek w obecności inhibitora PARP o wzorze I dla linii komórkowych V79, VC8 i VC8B2; Figura 4 przedstawia wykres słupkowy ilustrujący aktywność PARP dla linii komórkowych VC8, V79, VC#13 i VC8, VC8#13 i VC8+B2 w obecności inhibitora PARP o wzorze III; Figura 5 przedstawia parę wykresów ilustrujących hamowanie komórkowej aktywności PARP w obecności inhibitora PARP o wzorze I i III w permeabilizowanych (górny wykres) i nienaruszonych (dolny wykres) komórkach L1210; Figura 6 przedstawia parę wykresów słupkowych ilustrujących farmakokinetykę oraz farmakodynamikę krwi i nowotworu dla fosforanu związku o wzorze I w dawce 1 mg/kg (górna) i 10 mg/kg (dolna) u myszy z ksenoprzeszczepami SW620; Figura 7 przedstawia wykres słupkowy ilustrujący farmakokinetykę i farmakodynamikę dla związku o wzorze III u myszy z ksenoprzeszczepami SW620; 6
Figura 8 przedstawia wykres ilustrujący wzrost guza (mediana w stosunku do objętości guza) u myszy z ksenoprzeszczepami SW620 po leczeniu związkiem o wzorze III w kombinacji z temozolomidem (TMZ) lub samym TMZ; Figura 9 przedstawia wykres ilustrujący wzrost guza (mediana w stosunku do objętości guza) u myszy z ksenoprzeszczepami SW620 po leczeniu fosforanem związku o wzorze I w kombinacji z temozolomidem (TMZ) oraz samym fosforanem związku o wzorze I i samym TMZ. [0052] Na Fig. 1 przedstawiono procent przeżycia dla linii komórkowych AA8, IrS ISF i CxR3 traktowanych różnymi stężeniami związku o wzorze III. Stwierdzono, że związek o wzorze III jest najbardziej aktywny wobec linii IrS ISF z niedoborem XRCC3 i wykazuje wartość LC 50 (stężenie składnika aktywnego, które zabija 50% komórek) przy 100 nm. [0053] Na Fig. 2 przedstawiono procent przeżycia dla linii komórkowych V79-Z, VC8 i VC8B2 traktowanych różnymi stężeniami związku o wzorze III. Stwierdzono, że związek o wzorze III jest najbardziej skuteczny wobec linii komórkowej VC8 z niedoborem BRCA2 i wykazuje wartość LC 50 przy 43 nm i wartość LC 90 (stężenie składnika aktywnego, które zabija 90% komórek) przy 1200 nm. [0054] Na Fig. 3 przedstawiono procent przeżycia dla linii komórkowych V79-Z, VC8 i VC8B2 traktowanych różnymi stężeniami związku o wzorze I. Stwierdzono, że związek o wzorze I jest najbardziej skuteczny wobec linii komórkowej VC8 z niedoborem BRCA2 i wykazuje wartość LC 50 przy 12 nm i wartość LC 90 przy 27 nm. [0055] Na Fig. 4 przedstawiono aktywność PARP w różnych liniach komórkowych traktowanych różnymi stężeniami związku o wzorze III. Wykres z Fig. 3 podzielono na cztery zestawy wyników, odpowiednio dla każdej linii komórkowej. Pierwszy słupek w każdym z zestawów przedstawia aktywność tła PARP (bez fragmentów oligo, a zatem aktywność PARP jest zależna od pęknięć endogennego DNA), drugi słupek przedstawia całkowicie stymulowaną (przez fragmenty oligo) aktywność PARP, a słupki trzeci i czwarty ilustrują aktywność PARP w obecności związku o wzorze III. [0056] Na Fig. 5 przedstawiono wpływ związków o wzorze I i III na aktywność PARP. [0057] Komórki stosowane w badaniach, których wyniki przedstawiono na Fig. 5, permeabilizowano digitoniną, a następnie oceniano pod kątem całkowicie stymulowanej (przez fragment oligo) aktywności PARP w obecności lub nieobecności inhibitora PARP o wzorze I lub III, albo na 20 minut przed permeabilizacją komórki eksponowano na jeden z powyższych inhibitorów PARP i oceniano pod kątem stymulowanej aktywności PARP. [0058] Gdy komórki permeabilizowano przed dodaniem związku-inhibitora, nie obserwowano różnicy w aktywności hamującej PARP dla związków o wzorze I i III, ale związek o wzorze I miał silniejsze działanie w komórkach nienaruszonych, prawdopodobnie z uwagi na wyższy stopień akumulacji wewnątrz komórek. [0059] Na Fig. 6 przedstawiono stężenie związku o wzorze I w osoczu i w nowotworze oraz jego farmakokinetyczne działanie na limfocyty krwi obwodowej myszy (pbl parp) i ksenoprzeszczepy SW620 (nowotwór PARP) w różnym czasie po śródotrzewnowym podaniu soli fosforanowej związku o wzorze I. Związek o wzorze I ma większą rozpuszczalność w postaci soli fosforanowej. Jednakże, po poddaniu 7
zwierzęciu (łącznie z człowiekiem) fosfatazy w osoczu rozkładają fosforan związku o wzorze I (wzór I- fosforan) do związku macierzystego, tj. do związku o wzorze I. [0060] Jak wyraźnie widać na Fig. 6, trzydzieści minut po podaniu fosforanu związku o wzorze I w dawce 10 mg/kg, zarówno w osoczu, jak i w nowotworze, wykryto wysokie poziomy związku macierzystego. Stężenie związku o wzorze I wraz z upływem czasu zmniejsza się szybciej w osoczu niż w nowotworze i po 24 godzinach od podania w nowotworze wykrywalne są znaczne poziomy związku, natomiast nie wykrywa się ich w osoczu. Stwierdzono całkowite i długotrwałe hamowanie aktywności PARP w pbl i w nowotworze: <50% w stosunku do kontroli w czasie do 24 godzin. [0061] Po podaniu fosforanu związku o wzorze I w dawce 1 mg/kg w osoczu i w nowotworze stwierdzono niższe poziomy związku o wzorze i w konsekwencji mniej wyraźny wpływ na aktywność PARP. [0062] Na Fig. 7 przedstawiono stężenia związku o wzorze III w osoczu i nowotworze oraz jego farmakokinetyczne działanie na ksenoprzeszczepy SW620 (działanie na nowotwór PARP) w różnym czasie po śródotrzewnowym podaniu w dawce 10 mg/kg. Związek ten również ma dobre rozmieszczenie wewnątrz nowotworu, korzystnie utrzymuje się przez dłuższy czas i podobnie hamuje aktywność PARP w nowotworze. [0063] Na Fig. 8 przedstawiono progresywne zmniejszenie wielkości ksenoprzeszczepu nowotworu po 20 dniach od podania temolozomidu (68 mg/kg, 5 x dziennie). Jednakże, krótko po tym czasie nowotwór zaczął wzrastać. Gdy związek o wzorze III (5 mg/kg, 5 x dziennie) podawano w połączeniu z temolozomidem, w ciągu około 15 dni nowotwór skurczył się znacznie, do wielkości niewykrywalnej, i ta niewykrywalna wielkość utrzymywała się jeszcze przez 50 dni, po czym nowotwór zaczął wzrastać. Przy podawaniu większej dawki związku o wzorze III (15 mg/kg, 5 x dziennie), wielkość nowotworu była niewykrywalna jeszcze przez 80 dni, aż do końca badania, gdy w autopsji nie wykryto żadnego guza, tj. nastąpiła całkowita regresja nowotworu. [0064] Na Fig. 9 przedstawiono wzorzec podobny do obserwowanego na Fig. 8, po podaniu fosforanu związku o wzorze I (w dawce 0,1 mg/kg i 1,0 mg/kg), w kombinacji z temolozomidem. Tabela 1. Genotyp i pochodzenie linii komórkowych stosowanych w badaniu Linia Genotyp Defekt Pochodzenie Referencje Komentarz komórkowa AA8 wt wt CHO [41] Linia komórkowa jajnika chomika chińskiego Irs1SF XRCC3 - XRCC3 - upośledzenie HR AA8 [41] Wrażliwa na promieniowanie linia komórkowa pochodząca od AA8 z brakiem XRCC3, składnika szlaku HR CXR3 XRCC3- +hxrcc3 wt Irs1SR [41] Irs1SF transfekowana genem hxrcc3 V79-Z wt wt V79 [42] V79 są fibroblastami płuc chomika VC8 BRCA2- BRCA2- upośledzenie HR V79-Z [42] VC8 są wrażliwymi na promieniowanie pochodnymi V79, z niedoborem BRCA2 VC8#13 BRCA2- wt Vc8 [42] VC8 z chromosomem 13 VC8+B2 +hbrca2 BRCA2- +hbrca2 zawierającym hbrca2 wt VC8 [42 VC8 transfekowane hbrca2 8
Materiały i metody Cytotoksyczność inhibitorów PARP w stosunku do komórek z upośledzeniem HR (XRCC3 lub BRCA2) Hodowla komórkowa [0065] Linie komórkowe AA8, irs1sf i CXR3 otrzymano z firmy Larry Thompson [41]. [0066] VC-8, VC-8+B2, VC-8#13 były podarunkiem od Małgorzaty Zdienickiej [42]. W badaniu tym wszystkie linie komórkowe hodowano w pożywce Eagle a w modyfikacji Dulbecco (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą, penicyliną (100 U/ml) i siarczanem streptomycyny (100 µg/ml) w temperaturze 37 C i w atmosferze z zawartością 5% CO 2. Badanie toksyczności test na przeżywalność klonogeniczną [0067] Komórki wzrastające ekspotencjalnie na 6-studzienkowych płytkach eksponowano przez 24 godziny na związek o wzorze III w stężeniach wskazanych na Fig. 2 w 1% DMSO lub na sam 1% DMSO w pożywce. [0068] W celu wytworzenia kolonii, komórki zebrano przez trypsynizację, zliczono i w różnych gęstościach wysiano do świeżej pożywki na 10 cm płytkach, w nieobecności leku. [0069] Po 7-10 dniach płytki utrwalono mieszaniną metanol:kwas octowy, 3:1, i wybarwiono 0,4% fioletem krystalicznym. [0070] Kolonie zliczono i obliczono przeżywalność w stosunku do komórek kontrolnych traktowanych 1% DMSO. Badanie aktywności PARP [0071] Wzrastające ekspotencjalnie komórki eksponowano na 1% DMSO w pożywce hodowlanej (kontrola), albo komórki permeabilizowane digitoniną lub komórki nienaruszone przez 20 minut przed przemyciem i permeabilizacją digitoniną eksponowano na związek o wzorze I albo III w 1% DMSO w stężeniach wskazanych na Fig. 4. Aktywność PARP mierzono przez wprowadzenie do polimerów ulegających wytrąceniu TCA [32P]-znakowanego substratu NAD+, po stymulacji przez dodanie tępo zakończonego oligonukleotydu i porównano z komórkami niestymulowanymi oligonukleotydem. W ten sam sposób mierzono aktywność PARP w homogenatach nowotworowych (1 do 40, w buforze izotonicznym) u myszy traktowanych związkiem o wzorze III. Aktywność PARP w pbl i w homogenatach nowotworowych u myszy traktowanych fosforanem związku o wzorze I mierzono przez immunologiczne wykrywanie polimeru, z zastosowaniem przeciwciała 10H. Pokrótce, homogenaty nowotworowe rozcieńczone do wartości 1:1000 w izotonicznym buforze inkubowano z 350 µm NAD przez 6 minut i nakroplono na membranę nitrocelulozową. Tworzenie się polimeru poli(adp-ryboza) (PAR) oceniano ilościowo przez wykrywanie chemiluminescencyjne z zastosowaniem iluminatora Fuji LAS3000 UV przez odniesienie do seryjnych rozcieńczeń PAR jako standardu, po inkubacji z przeciwciałem 10H wobec PAR oraz drugorzędowego przeciwciała przeciwmysiego. Wyniki standaryzowano przez odniesienie do pomiaru zawartości białka w homogenacie. 9
Literatura: [0072] [1] C. Lundin, K. Erixon, C. Arnaudeau, N. Schultz, D. Jenssen, M. Meuth i T. Helleday Different roles for nonhomologous end joining and homologous recombination following replication arrest in mammalian cells, Mol Cell Biol 22 (2002) 5869-5878. [2] A.R. Venkitaraman Cancer susceptibility and the functions of BRCA1 and BRCA2, Cell 108 (2002) 171-182. [3] D. D Amours, S. Desnoyers, I. D Silva i G.G. Poirier Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions, Biochem J 342 (1999) 249-268. [4] Z. Herceg i Z.Q. Wang Functions of poly(adp-ribose) polymerase (PARP) in DNA repair, genomic integrity and cell death, Mutat Res 477 (2001) 97-110. [5] T. Lindahl, M.S. Satoh, G.G. Poirier i A. Klungland Post-translational modification of poly(adp-ribose) polymerase induced by DNA strand breaks, Trends Biochem Sci 20 (1995) 405-411. [6] M.S. Satoh i T. Lindahl Role of poly(adp-ribose) formation in DNA repair, Nature 356 (1992) 356-358. [7] S. Shall i G. de Murcia Poly(ADP-ribose) polymerase-1: what have we learned from the deficient mouse model?, Mutat Res 460 (2000) 1-15. [8] Z.Q. Wang, L. Stingl, C. Morrison, M. Jantsch, M. Los, K. Schulze-Osthoff i E.F. Wagner PARP is important for genomic stability but dispensable in apoptosis, Genes Dev 11 (1997) 2347-2358. [9] C.M. Simbulan-Rosenthal, B.R. Haddad, D.S. Rosenthal, Z. Weaver, A. Coleman, R. Luo, H.M. Young, Z.Q. Wang, T. Ried i M.E. Smulson Chromosomal aberrations in PARP(-/-) mice: genome stabilization in immortalized cells by reintroduction of poly(adp-ribose) polymerase cdna, Proc Natl Acad Sci U S A 96 (1999) 13191-13196. [10] J.M. de Murcia, C. Niedergang, C. Trucco, M. Ricoul, B. Dutrillaux, M. Mark, F.J. Oliver, M. Masson, A. Dierich, M. LeMeur, C. Walztinger, P. Chambon i G. de Murcia Requirement of poly(adp-ribose) polymerase in recovery from DNA damage in mice and in cells, Proc Natl Acad Sci U S A 94 (1997) 7303-7307. [11] F. d Adda di Fagagna, M.P. Hande, W.M. Tong, P.M. Lansdorp, Z.Q. Wang i S.P. Jackson Functions of poly (ADP-ribose) polymerase in controlling telomere length and chromosomal stability, Nat Genet 23 (1999) 76-80. [12] E. Samper, F.A. Goytisolo, J. Menissier-de Murcia, E. Gonzalez-Suarez, J.C. Cigudosa, G. de Murcia i M.A. Blasco Normal telomere length and chromosomal end capping in poly(adp-ribose) polymerasedeficient mice and primary cells despite increased chromosomal instability, J Cell Biol 154 (2001) 49-60. [13] C. Morrison, G.C. Smith, L. Stingl, S.P. Jackson, E.F. Wagner i Z.Q. Wang Genetic interaction between PARP and DNA-PK in V(D)J recombination and tumorigenesis, Nat Genet 17 (1997) 479-482. [14] V. Schreiber, D. Hunting, C. Trucco, B. Gowans, D. Grunwald, G. De Murcia i J.M. De Murcia A dominantnegative mutant of human poly(adp-ribose) polymerase affects cell recovery, apoptosis, and sister chromatid exchange following DNA damage, Proc Natl Acad Sci U S A 92 (1995) 4753-4757. [15] J.H. Kupper, M. Muller i A. Burkle Trans-dominant inhibition of poly(adp-ribosyl)ation potentiates carcinogen induced gene amplification in SV40-transformed Chinese hamster cells, Cancer Res 56 (1996) 2715-2717. [16] J. Magnusson i C. Ramel Inhibitor of poly(adp-ribose)transferase potentiates the recombinogenic but not the mutagenic action of alkylating agents in somatic cells in vivo in Drosophila melanogaster, Mutagenesis 5 (1990) 511-514. [17] A.S. Waldman i B.C. Waldman Stimulation of intrachromosomal homologous recombination in mammalian cells by an inhibitor of poly(adp-ribosylation), Nucleic Acids Res 19 (1991) 5943-5947. [18] A. Semionov, D. Cournoyer i T.Y. Chow Inhibition of poly(adp-ribose)polymerase stimulates extrachromosomal homologous recombination in mouse Ltk-fibroblasts, Nucleic Acids Res 27 (1999) 4526-4531. [19] F. Dantzer, V. Schreiber, C. Niedergang, C. Trucco, E. Flatter, G. De La Rubia, J. Oliver, V. Rolli, J. Menissierde Murcia i G. de Murcia Involvement of poly(adp-ribose) polymerase in base excision repair, Biochimie 81 (1999) 69-75. [20] F. Dantzer, G. de La Rubia, J. Menissier-De Murcia, Z. Hostomsky, G. de Murcia i V. Schreiber Base excision repair is impaired in mammalian cells lacking Poly(ADP-ribose) polymerase-1, Biochemistry 39 (2000) 7559-7569. [21] L. Tentori, I. Portarena i G. Graziani Potential clinical applications of poly(adp-ribose) polymerase (PARP) inhibitors, Pharmacol Res 45 (2002) 73-85. [22] T. Lindahl i R.D. Wood Quality control by DNA repair, Science 286 (1999) 1897-1905. [23] K.W. Caldecott DNA single-strand break repair and spinocerebellar ataxia, Cell 112 (2003) 7-10. [24] D. D Amours i S.P. Jackson The Mre11 complex: at the crossroads of dna repair and checkpoint signalling, Nat Rev Mol Cell Biol 3 (2002) 317-327. [25] A.D. D Andrea i M. Grompe The Fanconi anaemia/brca pathway, Nat Rev Cancer 3 (2003) 23-34. 10
[26] S.P. Jackson Sensing and repairing DNA double-strand breaks, Carcinogenesis 23 (2002) 687-696. [27] R. Kanaar, J.H. Hoeijmakers i D.C. van Gent Molecular mechanisms of DNA double strand break repair, Trends Cell Biol 8 (1998) 483-489. [28] D.C. van Gent, J.H. Hoeijmakers i R. Kanaar Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection, Nat Rev Genet 2 (2001) 196-206. [29] S.L. Neuhausen i E.A. Ostrander Mutation testing of early-onset breast cancer genes BRCA1 and BRCA2, Genet Test 1 (1997) 75-83. [30] G. Kuperstein, W.D. Foulkes, P. Ghadirian, J. Hakimi i S.A. Narod A rapid fluorescent multiplexed-pcr analysis (FMPA) for founder mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes, Clin Genet 57 (2000) 213-220. [31] Vissac-Sabatier C, Coxam V, Dechelotte P, Picherit C, Horcajada M-N, Davicco M-J, Lebecque P, Bignon Y-J, i Bernard-Gallon D. Phytoestrogenrich diets modulate expression of BRCA1 and BRCA2 tumour suppressor genes in mammary glands of female Wistar rats. Cancer Research vol 63 pp 6607-6612 (2003). [32] Wu K, Jiang S-W i Couch FJ. p53 mediates repression of the BRCA2 promoter and down regulation of BRCA2 mrna and protein levels in response to DNA damage. J. Biol. Chem. Vol 278 pp 15652-15660 (2003). [33] A. Chiarugi Poly(ADP-ribose) polymerase: killer or conspirator? The suicide hypothesis revisited, Trends Pharmacol Sci 23 (2002) 122-129. [34] C.R. Calabrese, M.A. Batey; H.D. Thomas, B.W. Durkacz, L.Z. Wang, S. Kyle, D. Skalitzky, J. Li, C. Zhang, T. Boritzki, K. Maegley, A.H. Calvert, Z. Hostomsky, D.R. Newell i N.J. Curtin Identification of Potent Nontoxic Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1 Inhibitors: Chemopotentiation and Pharmacological Studies, Clin Cancer Res 9 (2003) 2711-2718. [35] D. Ferraris, Y.S. Ko, T. Pahutski, R.P. Ficco, L. Serdyuk, C. Alemu, C. Bradford, T. Chiou, R. Hoover, S. Huang, S. Lautar, S. Liang, Q. Lin, M.X. Lu, M. Mooney, L. Morgan, Y. Qian, S. Tran, L.R. Williams, Q.Y. Wu, J. Zhang, Y. Zou i V. Kalish Design and synthesis of poly ADP-ribose polymerise-1 inhibitors. 2. Biological evaluation of aza-5[h]-phenanthridin-6-ones as potent, aqueous-soluble compounds for the treatment of ischemic injuries, J Med Chem 46 (2003) 3138-3151. [36] K.J. Dillon, G.C. Smith i N.M. Martin A FlashPlate assay for the identification of PARP-1 inhibitors, J Biomol Screen 8 (2003) 347-352. [37] A.J. Pierce, R.D. Johnson, L.H. Thompson i M. Jasin XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells, Genes Dev 13 (1999) 2633-2638. [38] R.D. Johnson, N. Liu i M. Jasin Mammalian XRCC2 promotes the repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, Nature 401 (1999) 397-399. [39] G.M. Shah, D. Poirier, S. Desnoyers, S. Saint-Martin, J.C. Hoflack, P. Rong, M. ApSimon, J.B. Kirkland i G.G. Poirier Complete inhibition of poly(adp-ribose) polymerase activity prevents the recovery of C3H10T1/2 cells from oxidative stress, Biochim Biophys Acta 1312 (1996) 1-7. [40] R.J. Griffin, S. Srinivasan, K. Bowman, A.H. Calvert, N.J. Curtin, D.R. Newell, L.C. Pemberton i B.T. Golding Resistance-modifying agents. 5. Synthesis and biological properties of quinazolinone inhibitors of the DNA repair enzyme poly(adp-ribose) polymerase (PARP), J Med Chem 41 (1998) 5247-5256. [41] S. Boulton, L.C. Pemberton, J.K. Porteous, N.J. Curtin, R.J. Griffin, B.T. Golding i B.W. Durkacz Potentiation of temozolomide-induced cytotoxicity: a comparative study of the biological effects of poly(adpribose) polymerase inhibitors, Br J Cancer 72 (1995) 849-856. [42] C.S. Griffin, P.J. Simpson, C.R. Wilson i J. Thacker Mammalian recombination-repair genes XRCC2 and XRCC3 promote correct chromosome segregation, Nat Cell Biol 2 (2000) 757-761. [43] R.S. Tebbs, Y. Zhao, J.D. Tucker, J.B. Scheerer, M.J. Siciliano, M. Hwang, N. Liu, R.J. Legerski i L.H. Thompson Correction of chromosomal instability and sensitivity to diverse mutagens by a cloned cdna of the XRCC3 DNA repair gene, Proc Natl Acad Sci U S A 92 (1995) 6354-6358. [44] M. Kraakman-van der Zwet, W.J. Overkamp, R.E. van Lange, J. Essers, A. van Duijn-Goedhart, I. Wiggers, S. Swaminathan, P.P. van Buul, A. Errami, R.T. Tan, N.G. Jaspers, S.K. Sharan, R. Kanaar i M.Z. Zdzienicka Brca2 (XRCC11) deficiency results in radioresistant DNA synthesis and a higher frequency of spontaneous deletions, Mol Cell Biol 22 (2002) 669-679. Zastrzeżenia patentowe 1. Związek o wzorze I, II lub III, lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, do stosowania jako lek cytotoksyczny do leczenia raka, który jest spowodowany genetycznym defektem genu, który pośredniczy w homologicznej rekombinacji. 11
2. Związek według zastrz. 1, przy czym związek stanowi związek o wzorze 1. 3. Związek według zastrz. 2, przy czym związek o wzorze 1 jest w postaci soli fosforanowej. 4. Związek według dowolnego z zastrz. 1 do 3, przy czym rakiem jest rak sutka. 5. Związek według dowolnego z zastrz. 1 do 4, przy czym defektem genetycznym jest brak genu kodującego białko zaangażowane w homologiczną rekombinację. 6. Związek według dowolnego z zastrz. 1 do 4, przy czym defekt genetyczny ma miejsce w ekspresji genu kodującego białko zaangażowane w homologiczną rekombinację. 7. Związek według zastrz. 6, przy czym gen, który pośredniczy w homologicznej rekombinacji jest wybrany z grupy składającej się z XRCC1, CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51β, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCCR, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NB51, WRN, BLM KU70, KU80, ATM, ATR CHK1, CHK2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RAD1 i RAD9. 8. Związek według jednego z zastrz. 6 albo 7, przy czym genem, który pośredniczy w homologicznej rekombinacji jest gen supresorowy nowotworu. 9. Związek według zastrz. 8, przy czym genem supresorowym nowotworu jest BRCA1 i/lub BRCA2. 10. Zastosowanie terapeutycznej ilości związku o wzorze I, II lub III, lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, do wytwarzania cytotoksycznego leku do leczenia raka, przy czym rak jest spowodowany przez genetyczny defekt genu, który pośredniczy w homologicznej rekombinacji. 12
11. Zastosowanie według zastrz. 10, przy czym związek stanowi związek o wzorze I. 12. Zastosowanie według zastrz. 11, przy czym związek o wzorze I jest w postaci soli fosforanowej. 13. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 10 do 12, przy czym rakiem jest rak sutka. 14. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 10 do 13, przy czym defektem genetycznym jest brak genu kodującego białko zaangażowane w homologiczną rekombinację. 15. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 10 do 14, przy czym defekt genetyczny ma miejsce w ekspresji genu kodującego białko zaangażowane w homologiczną rekombinację. 16. Zastosowanie według zastrz. 15, przy czym gen, który pośredniczy w homologicznej rekombinacji jest wybrany z grupy składającej się z XRCC1, CTPS, RPA, RPA1, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51β, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCCR, XRCC3, BRCA1, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NB51, WRN, BLM KU70, KU80, ATM, ATR CHK1, CHK2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RAD1 i RAD9. 17. Zastosowanie według jednego z zastrz. 15 lub 16, przy czym genem pośredniczącym w homologicznej rekombinacji jest gen supresorowy nowotworu. 18. Zastosowanie według zastrz. 17, w którym m genem supresorowym nowotworu jest BRCA1 i/lub BRCA2. 13
% Przeżycia AA8 (macierzysty),,,,, [Wzór III] mm Fig. 1 14
% Przeżycia % Przeżycia V79 (macierzysty) [Wzór III] mm V79Z (macierzysty),,,,, [Wzór III] mm Fig. 2 15
% Przeżycia,, [Wzór I] mm Fig. 3 16
Aktywność PARP: (pmol NAD/10 6 komórek) Wzór III 1 mm Wzór III 10 mm Fig. 4 17
Komórki Komórki permeabilizowane permeabilizowane Aktywność PARP: % KONTROLI Wzór I Wzór III,, Komórki nienaruszone Aktywność PARP: % KONTROLI Wzór I Wzór III Fig. 5 18
Wzór I-fosforan 1 mg/kg Aktywność PARP jako % kontroli pbl parp osocze nowotwór parp 30 min. nowotwór pbl parp osocze nowotwór parp nowotwór 6 godzin pbl parp osocze nowotwór parp nowotwór 24 godziny Związek I w osoczu (ng/ml) lub w nowotworze (ng/g białka) Aktywność PARP jako % kontroli pbl parp osocze[i] nowotwór parp 30 min. nowotwór Wzór I-fosforan 10 mg/kg pbl parp osocze nowotwór parp nowotwór 6 godzin pbl parp osocze nowotwór parp nowotwór 24 godziny Związek I w osoczu (ng/ml) lub w nowotworze (ng/g białka) Fig. 6 19
[Wzór III] g/ml lub g/g tkanki,,,,, [osocze] [nowotwór] nowotwór PARP aktywność,,, Aktywność PARP: % Kontroli Czas (minuty) Fig. 7 20
Kontrola Wielkość nowotworu: Mediana RTV TMZ(68)+Wzór III (5) TMZ(68)+Wzór III (15) Dzień Fig. 8 Wielkość nowotworu: Mediana RTV Kontrola Wzór I-fosforan (10) TMZ(68) +Wzór I-fosforan (0,1) TMZ(68) +Wzór I-fosforan (1,0) Dzień Fig. 9 21