CENTRALNE LABORATORIUM OCHRONY RADIOLOGICZNEJ ZAKŁAD KONTROLI DAWEK I WZORCOWANIA

Transkrypt

1 Badanie zróżnicowania osobniczej podatności na indukcję radiacyjnych złamań chromatydowych w chromosomach limfocytów krwi obwodowej osób zawodowo narażonych na promieniowanie jonizujące dr Maria Kowalska 1, mgr Monika Szymańska 2, mgr Kamil Szewczak 3 1) kowalska@clor.waw.pl 2) szymanska@clor.waw.pl 3) szewczak@clor.waw.pl 1 1

2 WSTĘP Przez wrażliwość na promieniowanie jonizujące rozumiemy zespół cech organizmu człowieka, które powodują, że po standardowej dawce 1-2 Gy u niektórych osób, a zwłaszcza u chorych na choroby nowotworowe, występuje ponadprzeciętne nasilenie wczesnych odczynów popromiennych zdrowych tkanek (oparzenie skóry, zmniejszenie liczby komórek krwi i układu odpornościowego) Przyczyną wrażliwości na promieniowanie, a ogólniej na wewnętrzne i zewnętrzne czynniki uszkadzające DNA, są zaburzenia komórkowych mechanizmów obronnych, których podstawowym zadaniem jest zapewnienie wiernego przekazu komórkowej informacji genetycznej komórkom potomnym Komórkowe mechanizmy obronne to: naprawa uszkodzeń DNA oraz rozbudowana sieć szlaków sygnalizacji komórkowej, zapewniająca skoordynowane z naprawą DNA przejściowe zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G 1, S lub G 2 ( tzw. blok G 1, S lub G 2 ), a w przypadku nieskutecznej naprawy uszkodzeń wyeliminowanie ich wraz z całą komórką na drodze genetycznie zaprogramowanej śmierci, nazywanej apoptozą 2

3 Odpowiedź komórek ludzkich na uszkodzenia DNA zależy od cech osobniczych (predyspozycje genetyczne, wiek, płeć), czynników środowiskowych (ekspozycje na promieniowanie czy toksyczne związki chemiczne w środowisku pracy i zamieszkania) oraz stylu życia (np. palenie papierosów), co powoduje, że ludzie różnią się podatnością na różne czynniki uszkadzające DNA Dziedziczne defekty genów, których produkty białkowe uczestniczą bezpośrednio w procesie naprawy podwójnoniciowych pęknięć DNA (z ang. Double Strand Breaks - DSB DNA), regulacji cyklu komórkowego lub apoptozy są przyczyną grupy chorób, których stałym elementem jest zwiększona częstość występowania chorób nowotworowych, wrażliwość komórek organizmu na promieniowanie oraz radiomimetyczne związki chemiczne, możliwość powstania ciężkich powikłań po zastosowaniu standardowo zaplanowanej radio- lub chemioterapii oraz zwiększone ryzyko indukcji nowotworów wtórnych Wskaźnikami wrodzonej lub nabytej zdolności organizmu do odpowiedzi wywołanej ekspozycją na promieniowanie są biologiczne markery promieniowrażliwości 3

4 Przykładem biomarkerów promieniowrażliwości może być osobnicze zróżnicowanie częstości złamań chromatydowych indukowanych in vitro przez standardową dawką promieniowania X lub gamma w limfocytach krwi obwodowej (LKO) podczas ich przechodzenia z fazy G 2 do fazy M cyklu komórkowego [1] Powstawanie złamań jednej lub obu chromatyd chromosomu w napromienionych LKO jest wynikiem wejścia komórki w mitozę (faza M) przed ukończeniem naprawy DSB DNA, a kondensacja chromatyny w czasie profazy podziału mitotycznego komórki powoduje utrwalenie uszkodzenia przez wytworzenie struktury widocznej na poziomie molekularnym jako aberracja chromatydowa Zróżnicowanie częstości złamań chromatydowych wskazuje na różnice w osobniczej podatności LKO na promieniowanie, a przyczyna tych różnic leży w związanej z polimorfizmem genowym odmiennej szybkości i wierności naprawy DSB DNA, a także zróżnicowanej aktywności kinazy cdk1 występującej w kompleksie z cykliną B1, którą uważa się za najważniejszą część mechanizmu zatrzymującego uszkodzoną komórkę w fazie G 2 i czynnik inicjujący wchodzenie komórek w mitozę 4

5 Zróżnicowanie podatności komórkowej na promieniowanie jest jednym z głównych czynników różnicujących ludzi pod względem możliwości wystąpienia niepożądanych następstw zdrowotnych po ekspozycji zawodowej, środowiskowej i medycznej, co ma zasadnicze znaczenie zarówno w ochronie radiologicznej pracowników i ludności, jak i w radioterapii pacjentów onkologicznych Stwierdzenie przed rozpoczęciem radioterapii, że niektórzy pacjenci są wrażliwi na promieniowanie wiąże się z koniecznością indywidualnego dostosowania planu radioterapii lub jej zaniechania na korzyść innej formy terapii Przy ekspozycji zawodowej i środowiskowej otrzymywane dawki promieniowania są o kilka rzędów niższe od dawek otrzymywanych podczas radioterapii (20-30 frakcji po 1-2 Gy na każdą frakcję), nie wywołują więc poważnych odczynów popromiennych, a jedynie zwiększają ryzyko indukcji nowotworu w wyniku działania promieniowania Dla osób wrażliwych na promieniowanie praca w warunkach narażenia radiacyjnego może być źródłem ponadprzeciętnego ryzyka dla zdrowia, którego można uniknąć, identyfikując takie osoby przed ich zatrudnieniem 5

6 Cel pracy Celem niniejszej pracy było zbadanie za pomocą analizy złamań chromatydowych w LKO napromienionych in vitro podczas przechodzenia z fazy G 2 do M cyklu komórkowego (test G2) zróżnicowania osobniczej podatności na promieniowanie jonizujące w grupie 26 zdrowych pracowników Centralnego Laboratorium Ochrony Radiologicznej w Warszawie, Instytutu Energii Atomowej w Świerku oraz Instytutu Chemii i Techniki Jądrowej na Żeraniu 6 6

7 Materiał i metody W badaniu uczestniczyło 18 kobiet i 8 mężczyzn w wieku od 25 do 70 lat Próbki krwi obwodowej tych osób pobierano jałowo i hodowano 72 godziny w pożywce PB-MAX TM Karyotyping Medium, w temperaturze 37 o C, w atmosferze składającej się w 95% z powietrza atmosferycznego i w 5 % CO 2. Podziały komórkowe limfocytów stymulowano za pomocą 1% fitohemaglutyniny i po 70 godzinach hodowli połowę stymulowanych LKO napromieniano w temperaturze pokojowej przy użyciu generatora rtg. typu HF320C firmy Pantac Częstość złamań chromatydowych indukowanych in vitro przez dawkę 1 Gy promieniowania X w LKO każdego pracownika oceniano na podstawie analizy mikroskopowej 250 kontrolnych (nienapromienionych) i 250 napromienionych komórek metafazowych. Za wartość kwalifikującą zdrowego pracownika jako oporny lub wrażliwy na promieniowanie przyjęto wartość 97 percentyla częstości indukowanych złamań chromatydowych w LKO wszystkich badanych pracowników 7 7

8 Schemat testu G2 Fazy cyklu komórkowego LKO Pobieranie 5 ml krwi obwodowej z żyły w zgięciu łokciowym G o Stymulacja limfocytów do dzielenia się w hodowli 70 godzin G 2 Napromienienie połowy stymulowanych LKO dawką 1 Gy promieniowania X Pozostałe LKO służą jako nienapromieniona kontrola 30 minut M M Blokowanie za pomocą kolcemidu podziałów komórkowych kontrolnych i napromienionych LKO 90 minut Utrwalenie LKO i wykonanie preparatów mikroskopowych 8 8

9 Wyniki Zdjęcie 1. Napromieniony limfocyt z dwoma złamaniami chromatydowymi 9 9

10 Tabela 1. Wyniki oznaczeń częstości złamań chromatydowych w kontrolnych i napromienionych LKO 26 zdrowych pracowników, uszeregowane od najmniejszej do największej wartości. Lp. Nr pracownika Płeć Wiek Kontrola±SE (Yo) Ilość złamań/komórkę(y1) ±SE Y1-Y K ,164 0,026 0, M ,168 0,027 0, M ,176 0,026 0, K ,184 0,026 0, K ,184 0,027 0, K ,188 0,027 0, M ,188 0,027 0, M ,192 0,028 0, K ,196 0,028 0, M ,204 0,028 0, K ,204 0,029 0, K ,204 0,03 0, M ,208 0,029 0, K ,209 0,043 0, M ,22 0,03 0, K ,22 0,03 0, K ,24 0,031 0, K ,248 0,026 0, K ,268 0,033 0, M 25 0,008±0,003 0,288 0,034 0, K ,284 0,034 0, K ,32 0,04 0, K ,344 0,037 0, K ,36 0,038 0, K 65 0,016±0,008 0,416 0,041 0, K ,428 0,041 0,428 10

11 Rysunek 1. Rozproszenie wokół mediany populacji wyników oznaczeń częstości indukowanych złamań chromatydowych w LKO dwudziestu sześciu zdrowych pracowników 11 11

12 Rysunek 2. Aproksymacja normalnym rozkładem prawdopodobieństwa wyników oznaczeń częstości indukowanych złamań chromatydowych w LKO dwudziestu sześciu zdrowych pracowników 12 12

13 Rysunek 3. Symulacja wpływu liczebności grupy (100 osób) na wartość graniczną kwalifikującą badane osoby jako wrażliwe na promieniowanie 13

14 Tabela 2. Statystyczne parametry rozkładu osobniczej podatności na promieniowanie w grupie dwudziestu sześciu zdrowych pracowników Parametr statystyczny Wartość parametru* [złamania chromatydowe / komórkę] Średnia arytmetyczna 0,242 Średnia geometryczna 0,242 Odchylenie standardowe (SD) 0, percentyl 0, percentyl 0, percentyl 0, percentyl 0,380 *Podane wielkości zostały wyznaczone na podstawie gęstości funkcji prawdopodobieństwa o rozkładzie normalnym, określonej na podstawie wyników oceny częstości indukowanych złamań chromatydowych w LKO wszystkich pracowników 14 14

15 Dyskusja wyników LKO pracowników miały bardzo niską spontaniczną częstość złamań chromatydowych (zakres: 0-0,016 złamań/komórkę, średnia SD: 0,001 0,003 złamań/komórkę ) Po napromienieniu dawką 1Gy promieniowania X średnia częstość indukowanych złamań chromatydowych w LKO dwudziestu sześciu pracowników wynosiła 0,242 0,073 złamań/ komórkę Najmniejsza i największa częstość indukowanych złamań chromatydowych wynosiła odpowiednio 0,164 i 0,428 złamań/komórkę Stosunek największej i najmniejszej częstości indukowanych złamań chromatydowych (Max/Min = 2,6) przyjęto za miarę osobniczego zróżnicowania podatności LKO na promieniowanie jonizujące Ze względu na przekroczenie wartości 97 percentyla równej 0,380 złamań/komórkę dwie pracownice (2/26=7,7%) zostały wytypowane jako wrażliwe na promieniowanie Pozostali pracownicy (24/26=92,3%) zostali sklasyfikowani jako oporni na promieniowanie 15 15

16 Ponieważ wartość odcięcia została wyznaczana arbitralnie na podstawie rachunku prawdopodobieństwa i dopuszcza pewien margines błędu, uzyskane wyniki zostaną zweryfikowany za pomocą testu G 2 w LKO poddanych (lub nie) po napromienieniu dawką 1 Gy promieniowania X działaniu kofeiny, znoszącej blok w fazie G 2 [2] Zniesienie bloku G 2 w napromienionych LKO spowoduje wejście ich w przedwczesną mitozę, skutkiem czego częstość indukowanych złamań chromatydowych będzie wyższa od częstości złamań chromatydowych w chromosomach LKO zatrzymanych po napromienieniu w fazie G 2 Różnica między tymi dwiema częstościami stanowi parametr osobniczej podatności (POP) na promieniowanie [2]; im jest on mniejszy tym bardziej podatny na promieniowanie jest badany człowiek; wartości bliskie zeru obserwuje się np. u nosicieli zmutowanego genu AT, którego produkt białkowy uruchamia komórkowe mechanizmy obronne, czyli naprawę DNA oraz zatrzymanie przechodzenia komórki przez fazę G 2 Ze względu na wartość POP badane osoby będą kwalifikowane jako: bardzo wrażliwe (POP<średnia-2SD), wrażliwe (średnia-2sd<pop<średnia-sd), normalne (POP=średnia SD), oporne (średnia+sd<pop<średnia+2sd) i bardzo oporne (POP>średnia +2SD) 16

17 Zakończeniem pracy będzie ocena wpływu polimorfizmu genów kodujących białka uczestniczące bezpośrednio w naprawie DNA (np. XRCC1, XRCC4, OGG1, PT53, BRCA, XPD) [3] na osobnicze zróżnicowanie podatności na promieniowanie w badanej grupie pracowników 17

18 Wnioski Obie cytogenetyczne metody badania osobniczej podatności są czułe, swoiste dla promieniowania jonizującego, łatwe do wykonania, stosunkowo tanie, mało inwazyjne i ogólnie akceptowane Takie metody są szczególnie przydatne przy: planowaniu radioterapii dla pacjentów onkologicznych; doborze pracowników do pracy w warunkach podwyższonego narażenia radiacyjnego (personel medyczny uczestniczący w zabiegach prowadzonych pod kontrolą promieniowania X, operatorzy reaktorów energetycznych, służby awaryjne w obiektach jądrowych); badaniach przesiewowych osobniczej podatności na promieniowanie w ogólnej populacji, a zwłaszcza w grupach ludności zamieszkujących tereny brane pod uwagę jako miejsce lokalizacji planowanej elektrowni jądrowej 18 18

19 Zadaniem badań przesiewowych ludności jest uzupełnienie braków wiedzy na temat wielkości populacji wrażliwej na środowiskowe czynniki uszkadzające DNA, w tym na promieniowanie jonizujące, w celu dostarczenia rządowi potwierdzonych naukowo informacji, potrzebnych do zapewnienia ochrony zdrowia pracowników i ludności na wszystkich etapach wdrażania energetyki jądrowej w Polsce, a także do informowania społeczeństwa na ten temat 19

20 Piśmiennictwo 1.Terzoudi, G.I. Pantelias, G.E. Cytogenetic methods for biodosimetry and risk individualisation after exposure to ionizing radiation. Radiation Portection Dosimetry, 2006; 122, , Terzoudi, G.I. Hatzi, V.I. Barszczewska, K. Manola, K. N. Stavropoulou, Ch. Angelakis, P. Pantelias, G.E. G2- checkpoint abrogation in irradiated lymphocytes: A new cytogenetic approach to assess individual radiosensotivity and predisposition to cancer. International Journal of Oncology, 35, , Ghilotti M., Pierotti, M.A., Gariboldi,M. Molecular markers for prediction of risk of radiation-related injury to normal tissue Journal of Nucleic Acids Investigation 2010; 1:e11 doi: /jnai.2010.e11 20

21 Prezentacja plakatu: Prezentacja wyników badań Tytuł: The frequency of the chromatid breaks in G2 peripheral blood lymphocytes as an in vitro indicator of human individual sensitivity to ionizing radiation Szymańska, Monika; Kowalska, Maria 21 21

22 Prezentacja wyników badań XV Ogólnopolski Zjazd Polskiego Towarzystwa Badań Radiacyjnych im. Marii Skłodowskiej - Curie Siedlce, Prezentacja plakatu: Zastosowanie analizy aberracji chromatydowych indukowanych w fazie G2 cyklu komórkowego w limfocytach ludzkiej krwi obwodowej do oceny osobniczej podatności na promieniowanie jonizujące Monika Szymańska i Maria Kowalska 22 22