DNA 28SRNA 18/16S RNA 5SRNA mrna Ilościowa analiza mrna aktywność genów w zależności od wybranych czynników: o rodzaju tkanki o rodzaju czynnika zewnętrznego o rodzaju upośledzenia szlaku metabolicznego Jakościowa analiza RNA (wirusów i bakterii) 1
Ilościowe oznaczanie RNA Northern Blot Geny reporterowe Mała- średnia informatywność PCR z odwrotną transkryptazą i badanie ekspresji metodą RealTime Mikromacierze RNA Sekwencjonowanie RNA Duża informatywność Geny reporterowe służą badaniu aktywności innych genów złączone z badanym genem (najczęściej promotorem) produkują mrna (i białko), którego ilość jest mierzona (fluorymetrycznie) ilość wyprodukowanego białka będzie miernikiem aktywności badanego promotora o Produkt genów reporterowych powinien być łatwo wykrywalny o Ilość produkowanego białka powinna być mierzalna (odpowiedni dobór metody) o Produkt genów reporterowych nie może być toksyczny ani inwazyjny dla żywych komórek o Powinien dać się oznaczyć in situ badany promotor gen reporterowy białko emitujące światło 2
Gen białka zielonej florescencji GFP (Green Fluorescent Protein) naturalnie występuje w genomie Aequorea victoria wprowadzenie i utrwalenie mutacji w tym genie pozwoliło na zmianę fluoroforu (pierwotnie kodowanego przez trzy aminokwasy: serynę, tyrozynę i glicynę) nowe mutanty genu pozwalają na produkcję białka emitującego niebieską (B), żółtą (Y), czerwoną (R) lub cyjanową (C) barwę światła Gen lucyferazy naturalnie występuje w genomie Photinus pyralis świecenie jest następstwem utleniania lucyferyny w obecności ATP Gen acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT) naturalnie występuje w genomie Escherichia coli Acetylacja chloramfenikolu w środowisku komórki powoduje świecenie Tygodnie Badanie aktywności promotorów nowotworowych raka mózgu http://www.metamouse.com/gfp%20models.html 3
- NORTHERN BLOT Elektroforetyczny rozdział fragmentów DNA (agaroza) Przeniesienie rozdzielonych fragmentów na membranę (nitrocelulozową) Hybrydyzacja z sondami ssdna - znana sekwencja - znakowanie: radioaktywne- aktywny węgiel, siarka Fluorescencyjne- biotyna Enzymatyczne- alkaliczna fosfataza Oznaczenie ilości konkretnej frakcji Northern Blot - NORTHERN BLOT Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) - NORTHERN BLOT Poly(A)+ RNA: from rat tissues Probe: G3PDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) From Dr. Yu 4
Reakcja amplifikacji DNA na matrycy RNA- odwrotna transkrypcja (Reverse Transcription) enzym używany w reakcji RT-PCR to odwrotna transkryptaza powstały DNA jest komplementarny do RNA i nazywany jest cdna (complementary DNA) w badaniu ekspresji genów cdna powinien powstawać na matrycy mrna cząsteczki mrna (w przeciwieństwie do rrna) są w naturalny sposób zakończone ogonkami poliadeninowymi AAAAAAAA dołączanymi w czasie transkrypcji za kodonem STOP Obecność ogonków poliadeninowych (poli-a) jest wykorzystana jako naturalne miejsce wiązania ze starterami oligo dt (dttp) <TTTTTTTT> w reakcji RT- PCR na jednej kopii RNA powstaje jedna kopia cdna! Startery typu Oligo dt to: o oligonukleotydy składające się zazwyczaj z 24 nukleozydów zawierających tyminę. Przyłączają się one do ogonków poli-a w mrna LUB o oligonukleotydy składające się z 23 reszt tyminowych i dodatkowego nukleotydu kotwiczącego A, C lub G, w ten sposób ich przyłączenie następuje przy fragmencie łączącym ogonek poli-a z 3 UTR 5
Startery typu random hexamer to: o mieszanina oligonukleotydów reprezentująca wszystkie możliwe kombinacje sześcionukleotydowe Oligo dt Stosowane jedynie dla organizmów eukariotycznych i retrowirusów zawierających ogonki Poli-A Tylko dla mrna Przydatne przy krótkich fragmentach, zwłaszcza zlokalizowanych przy 3 końcu mrna Random Hexamer Stosowane dla wszystkich organizmów Dla wszystkich rodzajów RNA Przydatne przy długich fragmentach RNA (>2000pz) oraz przy RNA o słabej jakości - TMA Amplifikacja RNA za pośrednictwem transkrypcji (Transcription- Mediated Amplification) Wykrywanie obecności wirusów: HIV-1; HBV; HCV oraz bakterii: Chlamydia trachomatis; Neisseria gonorrhoeae; Mycobacterium tuberculosis; Mycobacterium avium; starter uniwersalny dla wirusowego RNA (np. promotor T7) starter charakterystyczny dla danego wirusa odwrotna transkryptaza polimeraza RNA RNAza H (specyficzna dla kompleksów RNA-DNA) - TMA wiązanie startera (uniwersalnego; np. promotora T7)z matrycą RNA i wydłużanie przy pomocy odwrotnej transkryptazy- powstaje dwuniciowy kompleks hybrydowy (RNA-DNA) /punkt 1-3/ trawienie nici RNA (RNAzą H)- pozostaje pojedyncza nić cdna /punkt 4/ wiązanie startera (charakterystycznego dla wybranej sekwencji) z matrycą cdna i wydłużanie drugiej nici DNA aż do miejsca wiązania promotora T7/punkt 5-6/ wiązanie startera promotora T7 i transkrypcja- powstaje wiele kopii RNA /punkt 7-8/ do powstałych amplikonów RNA wiąże się starter T7 /punkt 9/ i reakcja zamyka cykl 6
- TMA http://jcm.asm.org 7