1. Barwienie przeglądowe ogólna struktura mózgu i płatów wzrokowych Drosophila

Transkrypt

1 1. Barwienie przeglądowe ogólna struktura mózgu i płatów wzrokowych Drosophila

2 Drosophila melanogaster - barwienie Richardsona (1% błękit metylenowy w 1% boraksie)

3

4 Techniki używane w histologii: mikroskopia świetlna i elektronowa technika histologiczna: utrwalanie materiału, przygotowanie skrawków, przygotowanie komórek in toto, barwienie, interpretacja skrawków tkankowych. immunohistochemia, hybrydyzacja in situ. nowoczesna histologia: badanie sekwencji białek, genetyka molekularna i klonowanie komórek w hodowlach.

5 Laser Capture Microdissection (LCM) -izolacja określonego typu komórek lub fragmentów tkanki z preparatów histologicznych lub cytologicznych. Izolacja DNA, RNA Mikromacierze (microarray analysis) RT-PCR, Spektrofotometria masowa (MALDI, itp.) 2D SDS-PAGE (2D elektroforeza)

6 Immunohistochemia immunocytochemia Zbiór metod pozwalających na wykrywanie w tkankach i komórkach (zazwyczaj w preparacie mikroskopowym) białek za pomocą swoistych dla nich immunoglobulin, czyli przeciwciał. Zlokalizowanie miejsca przyłączenia do tkanki przeciwciała wymaga dołączenia do cząsteczki tego przeciwciała związku chemicznego widocznego w obrazie mikroskopowym (fluorochromu: fluoresceina, rodamina; metalu: złoto koloidalne, ferrytyna zawierająca żelazo; enzymu: peroksydaza, fosfataza zasadowa)

7 Przeciwciała

8

9 Przeciwciała poliklonalne i monoklonalne

10 Zlokalizowanie miejsca przyłączenia do tkanki przeciwciała wymaga dołączenia do cząsteczki tego przeciwciała związku chemicznego widocznego w obrazie mikroskopowym: fluorochromu: fluoresceina, rodamina; metalu: złoto koloidalne, ferrytyna zawierająca żelazo; enzymu: peroksydaza, fosfataza zasadowa

11 Metoda bezpośrednia => znakowane 1º ab Metoda pośrednia => znakowane 2º ab Metoda z kompleksem enzymatycznym

12 Immunofluorescencja Metoda badania reakcji antygen-przeciwciało, z wykorzystaniem fluorochromu. Wynik reakcji odczytuje się w mikroskopie fluorescencyjnym (lub używając cytometru przepływowego). Jest jedną z najczulszych metod serologicznych.

13 Ekspresja białek synaptycznych w kartuszu lamina -pojedyncze barwienie

14 Podwójne barwienie

15 GFP (ang. Green Fluorescent Protein) - białko zielonej fluorescencji

16 238 aminokwasy, 29 kda 21D-Gal4 x UAS-S65T-GFP GFP zostało odkryte w 1962 przez Osamu Shimomure. Aequorea victoria 11 nici o strukturze β, tworzy cylinder = beczułkę, w którym schowany jest fluorochrom.

17 GFP revolution Douglas Prasher was the first person to realize the potential of GFP as a tracer molecule. In 1987 he got the idea that sparked the GFP revolution. He thought that GFP from a jellyfish could be used to report when a protein was being made in a cell. Proteins are extremely small and cannot be seen, even under an electron microscope. However if one could somehow link GFP to a specific protein, for example hemoglobin, one would be able to see the green fluorescence of the GFP that is attached to the hemoglobin. It would be a bit like attaching a light bulb to the hemoglobin molecule.

18 GFP jest bardzo użytecznym białkiem w biologii molekularnej komórki. Zastosowanie GFP jako białka reporterowego, np..: a) do badania np. aktywności promotorów lub wydajności transfekcji komórek. a) do tworzenia fuzji z interesującymi nas białkami (metodami inżynierii genetycznej) co pozwala na ich łatwą lokalizację w komórce lub śledzenie zmian tej lokalizacji pod wpływem określonych czynników.

19 Transfekcja komórek Ko-transfekcja sirna i GFP Using Cellaxess CX3 for delivery of sirna to Schwann cells in a mixed culture with DRG neurons. The cells were co-transfected with sirna blocking N-cadherin protein expression and a GFP plasmid. The picture shows GFP transfected cells (green), Ncadherin protein expression between cells (red) and neurofilament on DRG axons (blue). Note the high correlation between decreased N-cadherin expression and GFP transfection in Schwann cells. Data courtesy of Department of Neuroscience, Developmental genetics, Uppsala University, Sweden.

20 Tkankowo specyficzna ekspresja GFP (ang. Green Fluorescent Protein), czyli białka zielonej fluorescencji 21D-Gal4 x UAS-S65T-GFP muszki transgeniczne

21 Organizmy modelowe:

22 System GAL4/UAS GMR/RH1 21D Apterous Eaat1 REPO R1-R6 S65T-GFP mcd8-gfp ACT.GFP L2 T1 GLiA

23 Szczepy UAS UAS-S65T-GFP (GFP w cytoplazmie) UAS-mCD8-GFP (GFP w błonie komórkowej) UAS-Act5C.T: GFP (GFP znakuje cytoszkielet aktynowy)

24 Zadanie GMR/RH1-Gal4 (fotoreceptory) 21D Gal4 (L2 iterneuron) Apterous-Gal4 (L3 interneuron) Eaat1-Gal4 (T1 neuron) REPO Gal4 (Glej) UAS -S65T-GFP (cytoplazma) UAS- mcd8-gfp (błona kom.) UAS- ACT.GFP (aktyna)

25 Dlg 4F3, Cy3 REPO-Gal4 x UAS-S65T-GFP

26 GFP w innych organizmach modelowych

27 GFP i jego pochodne jako markery fluorescencyjne

28 Hybrydocytochemia Zbiór metod umożliwiających wykrycie i uwidocznienie w komórkach (przeważnie w preparacie mikroskopowym) ściśle określonych sekwencji nukleotydów w kwasach nukleinowych, przy użyciu syntetycznych odcinków tych kwasów (tzw. sond DNA i RNA) o sekwencji komplementarnej (dopasowanej do wykrywanego fragmentu), które ulegają hybrydyzacji z wykrywanym odcinkiem kwasu nukleinowego.

29 Uwidocznienie miejsca związania sondy w komórce wymaga jej znakowania: fluorochromem => obraz widoczny w mikroskopie fluorescencyjnym b) izotopem promieniotwórczym => uwidocznienie wymaga autoradiografii a)

30 Zastosowanie: Wykrywanie poszczególnych genów lub ich fragmentów i ustalania ich lokalizacji w chromosomac lub jądrze interfazowym. a) b) c) BADANIA: Ocena ekspresji danego genu (identyfikacja mrna) Wykrywanie obcego materiału genetycznego w komórce (diagnostyka zakażeń wirusowych) Diagnostyka genetyczna oraz leczenie i jego modyfikacja w przypadku chorób nowotworowych (ocena ilości kopii danego genu w komórkach nowotworowych cytogenetyka onkologiczna)