Procesy biotechnologiczne mają bardzo zróżnicowany charakter, mogą być prowadzone wieloma sposobami i wymagają różnych warunków technicznych. Większość bioprocesów wymaga użycia czystych kultur drobnoustrojów, określonych linii komórkowych lub konkretnych enzymów. Procesy okresowe. W tradycyjnych procesach fermentacyjnych podłoże szczepione jest drobnoustrojami, które namnażają się i w czasie swojego wzrostu lub po jego zakończeniu tworzą określony produkt. Zalety procesu okresowego: - prostota prowadzenia operacji, - łatwość utrzymania warunków jałowych, - odnawialność inokulum zapobiegająca degeneracji szczepu. Wady procesu okresowego: - niska produkcyjność procesu, - brak możliwości regulacji stężenia substratu. Procesy ciągłe. Ciągłe procesy syntez mikrobiologicznych polegają na tym, że po wstępnym okresie namnażania drobnoustrojów rozpoczyna się stałe zasilanie hodowli świeżym podłożem, połączone z jej ciągłym odbiorem przy zachowaniu stałej objętości. Zalety procesu ciągłego: - możliwość prowadzenia hodowli dowolnie długo w najbardziej korzystnych warunkach, - możliwość regulacji warunków hodowli (szybkość zasilania, skład podłoża), - duża jednorodność fizyczna i chemiczna hodowli, - możliwość automatyzacji procesu, - większa szybkość i wydajność wielu procesów, Wady procesu ciągłego: - degradacja szczepów lub pojawienie się niekorzystnych mutacji, spadek wydajności procesu, - trudność w utrzymywaniu warunków aseptycznych (jeżeli są konieczne), - niekorzystny dla hodowli ciągłej sposób rozwoju niektórych drobnoustrojów (tworzą układy wielokomórkowe, skupiska kłaczków i kuleczek),
- niekorzystna relacja pomiędzy wzrostem drobnoustrojów a tworzeniem niektórych produktów metabolizmu syntetyzowanych przez komórki nie rosnące. Wadami procesów wykorzystujących swobodną zawiesinę komórek są: - straty materiału biologicznego, - konieczność oddzielania biomasy mikroorganizmów od płynu pohodowlanego, - ograniczone możliwości zastosowania procesów ciągłych. Wielu wad można uniknąć, stosując w miejsce zawiesiny mikroorganizmów, ich unieruchamianie na lub w stałym nośniku. Immobilizacja komórek na powierzchni lub wewnątrz stałego nośnika jest stosowana wtedy, gdy celem procesu nie jest otrzymanie biomasy mikroorganizmów, lecz przeprowadzenie odpowiedniej przemiany za pomocą enzymów zawartych w komórkach. Techniki unieruchamiania komórek i enzymów: 1. Wiązanie na powierzchni nośnika. - Adsorpcja i adhezja dzięki np.: siłom jonowym, wiązaniom wodorowym. Nośniki: drewno, celuloza, polimery syntetyczne, antracyt, tlenki metali, krzemionka, węgiel aktywny. Metoda łatwa i tania, ale wykorzystuje nietrwałe układy, w których zachodzi wymywanie katalizatora ze złoża. - Wiązania kowalencyjne, takie jak peptydowe, estrowe, węgiel-węgiel, węgiel-azot. Nośniki: karboksymetoloceluloza + karbodiimid, diaminy, kwasy dikarboksylowe, bezwodniki kwasowe. Metoda łatwa do wykonania, dająca stabilny układ ale droga. 2. Wiązanie w matrycy nośnika - Pułapkowanie w żelach naturalnych lub syntetycznych. Nośniki: agar, alginian, kolagen, poliakryloamid, poliuretan, polistyren. - Pułapkowanie we włóknach. Nośnik: octan celulozy. Metody tanie ale nie można jej stosować do enzymów hydrolitycznych, działających na substraty wielkocząsteczkowe, oraz mogących degradować żel. 3. Zamykanie wewnątrz membran półprzepuszczalnych. - Zamykanie w komórkach naturalnych np.: erytrocytach. - Kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie: liposomy, kapsułki nylonowe, z pochodnych celulozy. - Zamykanie pomiędzy membranami lub w wężach półprzepuszczalnych: nylonowych, silikonowych. Metody szczególnie cenne w lecznictwie, trudne do przeprowadzenia i konroli, zastosowanie wyłącznie do substratów małocząsteczkowych. 4. Unieruchamianie bez makroskopowego nośnika mechanicznego. - Sieciowanie przestrzenne. Kopolimeryzacja enzymów z nośnikami rozpuszczalnymi przy użyciu odczynników dwufunkcyjnych. Metoda łatwa i tania, zapewnia dużą aktywność i stabilność chemiczną, zalecana do procesów z użyciem substratów małocząsteczkowych. - Flokulacja komórek przy udziale polielektrolitów. - Samoagregacja, czyli naturalna flokulacja oraz wzrost drobnoustrojów w postaci kuleczek lub kłaczków biomasy.
Oznaczanie ilościowe białek porównanie metod. Metoda Bradforda Metoda Melanii M. Bradford jest obecnie stosowana coraz częściej, głównie ze względu na prostotę oraz wysoką czułość. Barwnik Coomasie Brillant Blue (CBB) rozpuszczony w roztworze o ph poniżej 1 ma kolor czerwono-brązowy. Kiedy jednak wiąże się z białkiem uzyskuje kolor niebieski. Ilość białka może być dzięki temu mierzona przy długości fali 595 nm. CBB w znacznej mierze przyłącza się do zasadowych, aromatycznych aminokwasów. Białka zawierają różną ich ilość, stąd wskazane jest utworzenie krzywej standardowej dla każdego badanego białka. Wadą tej metody jest to, że reagenty pozostają na szkle oraz plastikach laboratoryjnych. Można je stamtąd usunąć za pomocą SDS. Metodę stosuje się do detekcji białka w zakresie 20-1200μg białka/ml. Czułość metody wynosi 20 μg białka/ml Metoda biuretowa Metoda ta wykorzystuje obecność wiązań peptydowych w rozmaitych związkach organicznych, głównie w białkach i peptydach. Warunkiem koniecznym jest występowanie co najmniej dwóch wiązań peptydowych bezpośrednio obok siebie lub przedzielonych nie więcej niż jednym atomem węgla. Test biuretowy polega na dodaniu do analizowanej mieszaniny roztworu silnej zasady oraz siarczanu miedzi(ii). Jeżeli w roztworze obecne są związki zawierające bliskie wiązania peptydowe, to roztwór zmienia barwę z niebieskiej na fioletową (λ=540nm). Jest to spowodowane powstawaniem anionowych związków kompleksowych, w których jon Cu 2+ jest kompleksowany przez minimum dwie grupy peptydowe (Rysunek 1). W przypadku występowania dimerów aminokwasów, w których występuje tylko jedno wiązanie peptydowe układ zabarwia się na różowo. Wolne aminokwasy nie zmieniają barwy roztworu. Test może być stosowany zarówno w analizie jakościowej, jak i ilościowej. W tym drugim przypadku wykorzystuje się liniową zależność zmiany barwy od stężenia protein, a w rzeczywistości od liczby podwójnych wiązań peptydowych. Czułość metody 0,1 mg/cm 3, zakres 0,1 15 mg/cm 3 Oznaczeniu przeszkadzają: sole amonowe (dają barwne kompleksy z jonami miedzi) oraz siarczan (VI) magnezu (przechodzi w nierozpuszczalny wodorotlenek magnezu, który maskuje właściwą barwę). Metoda Lowry ego W metodzie tej wykorzystuje się dwie odrębne reakcje: reakcje aminokwasów aromatycznych z odczynnikiem Folina oraz reakcję jonów miedzi(ii) z wiązaniami peptydowymi (reakcja biuretowa). W pierwszym etapie metody Lowry`ego zachodzi reakcja pomiędzy białkiem (dokładnie atomami azotu wiązania peptydowego) a siarczanem miedzi i cytrynianem sodu w środowisku zasadowym, co prowadzi do powstania kompleksu miedzi (Cu2+) i białka. Skutkiem tego jest redukcja jonów miedzi do jonów Cu +. W kolejnym etapie, po dodaniu do mieszaniny reakcyjnej odczynnika Folina-Ciocalteu (kompleksu kwasów fosfomolibdenowego (Mo 6+ ) i fosfowolframowego (W 6+ ). Aminokwasy aromatyczne redukują te jony do tzw. Błękitu molibdenowo-wolframowego, co przejawia się zmianą barwy roztworu na niebieską. Zmiana barwy jest proporcjonalna do ilości kompleksów miedziowo-białkowych. Zalety metody: niskie koszty, łatwość wykonania pomiaru. Metoda ta od wielu lat jest najczęściej spotykaną procedurą określania zawartości protein w nieznanej próbce. Pomiar wykonuje się przy λ=750nm, aby otrzymać wiarygodny wynik należy stworzyć krzywa kalibracyjną. Metoda z kwasem bicinchoninowym Metoda ta jest kolejną modyfikacją reakcji biuretowej. Kwas bicinchoninowy tworzy z jonami miedziowymi stabilny kompleks, który maksimum absorbancji posiada przy 562 nm. Metoda ta jest czulsza od metody biuretowej i metody Lowr ego oraz mniej wrażliwa na warunki zewnętrzne. Podobnie jak pozostałe metody oparte na reakcji biuretowej metoda ta wrażliwa jest na obecność związków redukujących np. kwasu askorbinowego. Zasadniczo polega na reakcji redukcji jonów Cu 2+ do Cu + w alkalicznym środowisku poprzez składniki białek (cysteina, tryptofan i inne). Absorbancja w UV Absorbancja jest chyba najprostszą metodą do mierzenia koncentracji białka w roztworze. Białka absorbują najlepiej przy długości fali - 280 nm. Dzieje się tak z powodu zawartości aromatycznych aminokwasów, takich jak tryptofan czy tyrozyna. Natomiast przy 185 nm znajduje się szczyt absorbancji białek, który wynika z obecności wiązań peptydowych. Ekstynkcja białek przy 280 nm jest różna z powodu różnej zawartości aminokwasów aromatycznych, natomiast poniżej 220 nm w przypadku obecności różnych białek nie pozwala na ich rozróżnienie. Poza tym trudno jest zmierzyć absorbancję białka w obszarze około 185 nm ponieważ różne formy tlenu również absorbują na tym obszarze. Współczynniki ekstynkcji białek są różne, zatem absorbancję w UV należy raczej traktować jako metodę jakościową, oczywiście z wyjątkiem oczyszczonych już białek, dla których współczynniki ekstynkcji są już znane. Jedną z wad tej metody jest to, że wiele innych związków chemicznych obecnych w próbce powoduje zafałszowanie wyników. Dzieje się tak np. w przypadku kwasów nukleinowych. Wprawdzie maksimum absorpcji tych związków znajduje się przy 260 nm, ale po części również zafałszowują wynik przy 280 nm.
Wykonanie ćwiczenia 1. Przygotowanie podłoża 1.1. Podłoże produkcyjne W kolbie 2000 cm 3 przygotować 1500 cm 3 podłoża produkcyjnego o składzie: - sacharoza 50 g - NH 4Cl 3,0 g - MgSO 4 7H 2O 1,0 g - KH 2PO 4 0,2 g - ekstrakt drożdżowy 1,0 g - woda 1000 cm 3 Składniki przeliczyć tak aby otrzymać wymaganą ilość podłoża produkcyjnego. Doprowadzić ph do wartości 5,5. 1.2. Roztwór sacharozy W kolbie 250 cm 3 przygotować 50% roztwór sacharozy w ilości 100 cm 3. 2. Hodowla Candida lipolytica 2.1. Hodowlę i produkcyjną prowadzimy w bioreaktorze zawierającym 1500 cm 3 podłoża produkcyjnego, w temperaturze 30 0 C, przy szybkości przepływu powietrza 0,2 vvm (dm 3 powietrza/ dm 3 podłoża min), szybkości obrotowej mieszadła 200 rpm, przez okres 7 dni. W czasie hodowli ph 5,5 utrzymywane jest automatycznie za pomocą 0,1M NaOH i 0,1M HCl. 2.2. Roztwór sacharozy programujemy dawkowanie pompą perystaltyczną roztworu sacharozy od 48h trwania hodowli. 2.3. Wykonujemy oznaczenie stężenia białka w hodowli produkcyjnej metoda wskazana przez prowadzącego (pkt. 3). 3. Oznaczenie białka w roztworze 3.1. Wykorzystując próbnik pobrać ok. 20 cm 3 hodowli biomasy drożdżowej i przefiltrować w zestawie do filtracji próżniowej. W tym celu należy zmontować zestaw. Filtrować używając sączka z bibuły filtracyjnej (w razie potrzeby sączek przyciąć do odpowiedniego rozmiaru). Zamontować lejek i podłączyć wężem kolbę filtracyjną z pompą próżniową. Przy otwartym przepływie wlać 25cm 3 hodowli i włączyć pompę. Po zakończeniu filtracji cały zestaw należy dokładnie umyć!!! Pobrać ok. 0,2g biomasy drożdży z sączka, rozetrzeć z niewielką ilością odtłuszczonego piasku w moździerzu (w celu rozerwania ścian komórkowych i uwolnienia cytoplazmy). Następnie moździerz dokładnie przepłukać 5ml wody destylowanej. Całość przenieść ilościowo do probówki wirówkowej i odwirować (6000 obr/min, 5 min.). W celu odwirowania próby należy: - otworzyć pokrywę wirówki - umieścić w niej probówkę z zawiesiną roztartych drożdży, jako przeciwwagi użyć drugiej probówki wypełnionej 5 ml wody destylowanej - zamknąć pokrywę wirówki - ustawić czas wirowania 5 minut - ustawić obroty 6000 obr/min - po upływie wyznaczonego czasu wirówka sama się wyłączy 3.2. Po zakończeniu wirowania ostrożnie pobrać do probówki 1ml supernatantu. Do drugiej probówki wprowadzić 1ml wody destylowanej próba kontrolna. 3.3. Oznaczenie białka metodą Lowry ego. Do 1ml supernatantu, oraz 1 ml próby kontrolnej dodać po: - 0,3ml 1M NaOH, - 3ml odczynnika miedziowego, Odczynnik miedziowy przygotować bezpośrednio przed oznaczeniem mieszając ze sobą w probówce: 10ml odczynnika A, 0,1ml odczynnika B 1 i 0,1ml odczynnika B 2 - po wymieszaniu odstawić na 10 min. - 0,3ml odczynnika Folina Energicznie wymieszać probówki (vortex) i po 20 minut dokonać pomiaru absorbancji w spektrofotometrze, przy długości fali 660 nm, wobec próby kontrolnej, a następnie odczytać stężenie białka z krzywej wzorcowej albuminy. 3.4. Oznaczanie białka metodą Bradforda Do 1ml supernatantu, oraz 1 ml próby kontrolnej dodać po 2ml odczynnika Bradforda. Po wymieszaniu i upływie 10 minut dokonać pomiaru absorbancji w spektrofotometrze, przy długości fali 595 nm, wobec próby kontrolnej, a następnie odczytać stężenie białka z krzywej wzorcowej albuminy. 4. Opracowanie wyników Opis doświadczenia oraz uzyskane wyniki należy zamieścić w sprawozdaniu. Wyciągnąć wnioski. Można skorzystać z tabeli:
absorbancja [nm] Zawartość sacharozy [%] Stężenie białka [µg/ml] - Biotechnologia stosowana - biotechnologia środowiska studia II stopnia 1 dzień hodowli 7 dzień hodowli Krzywa wzorcowa albuminy 2,50 2,00 y = 4,4018x R² = 0,8822 1,50 1,00 0,50 0,00 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 stężenie białka [mg/ml] 5. Literatura - Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998 - Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna I i II tom; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000 - Bednarski W., Reps A.; Biotechnologia żywności; WNT; Warszawa; 2003.