1 KSZTAŁTOWANIE PROCESU BIOTECHNOLOGICZNEGO

Transkrypt

1 Procesy biotechnologiczne mają bardzo zróżnicowany charakter, mogą byd prowadzone wieloma sposobami i wymagają różnych warunków technicznych. Większośd bioprocesów wymaga użycia czystych kultur drobnoustrojów, określonych linii komórkowych lub konkretnych enzymów. Procesy okresowe. W tradycyjnych procesach fermentacyjnych podłoże szczepione jest drobnoustrojami, które namnażają się i w czasie swojego wzrostu lub po jego zakooczeniu tworzą określony produkt. Zalety procesu okresowego: - prostota prowadzenia operacji, - łatwośd utrzymania warunków jałowych, - odnawialnośd inokulum zapobiegająca degeneracji szczepu. Wady procesu okresowego: - niska produkcyjnośd procesu, - brak możliwości regulacji stężenia substratu. Procesy ciągłe. Ciągłe procesy syntez mikrobiologicznych polegają na tym, że po wstępnym okresie namnażania drobnoustrojów rozpoczyna się stałe zasilanie hodowli świeżym podłożem, połączone z jej ciągłym odbiorem przy zachowaniu stałej objętości. Zalety procesu ciągłego: - możliwośd prowadzenia hodowli dowolnie długo w najbardziej korzystnych warunkach, - możliwośd regulacji warunków hodowli (szybkośd zasilania, skład podłoża), - duża jednorodnośd fizyczna i chemiczna hodowli, - możliwośd automatyzacji procesu, - większa szybkośd i wydajnośd wielu procesów, Wady procesu ciągłego: - degradacja szczepów lub pojawienie się niekorzystnych mutacji, spadek wydajności procesu, - trudnośd w utrzymywaniu warunków aseptycznych (jeżeli są konieczne),

2 - niekorzystny dla hodowli ciągłej sposób rozwoju niektórych drobnoustrojów (tworzą układy wielokomórkowe, skupiska kłaczków i kuleczek), - niekorzystna relacja pomiędzy wzrostem drobnoustrojów a tworzeniem niektórych produktów metabolizmu syntetyzowanych przez komórki nie rosnące. Wadami procesów wykorzystujących swobodną zawiesinę komórek są: - straty materiału biologicznego, - koniecznośd oddzielania biomasy mikroorganizmów od płynu pohodowlanego, - ograniczone możliwości zastosowania procesów ciągłych. Wielu wad można uniknąd, stosując w miejsce zawiesiny mikroorganizmów, ich unieruchamianie na lub w stałym nośniku. Immobilizacja komórek na powierzchni lub wewnątrz stałego nośnika jest stosowana wtedy, gdy celem procesu nie jest otrzymanie biomasy mikroorganizmów, lecz przeprowadzenie odpowiedniej przemiany za pomocą enzymów zawartych w komórkach. Techniki unieruchamiania komórek i enzymów: 1. Wiązanie na powierzchni nośnika. - Adsorpcja i adhezja dzięki np.: siłom jonowym, wiązaniom wodorowym. Nośniki: drewno, celuloza, polimery syntetyczne, antracyt, tlenki metali, krzemionka, węgiel aktywny. Metoda łatwa i tania, ale wykorzystuje nietrwałe układy, w których zachodzi wymywanie katalizatora ze złoża. - Wiązania kowalencyjne, takie jak peptydowe, estrowe, węgiel-węgiel, węgiel-azot. Nośniki: karboksymetoloceluloza + karbodiimid, diaminy, kwasy dikarboksylowe, bezwodniki kwasowe. Metoda łatwa do wykonania, dająca stabilny układ ale droga. 2. Wiązanie w matrycy nośnika - Pułapkowanie w żelach naturalnych lub syntetycznych. Nośniki: agar, alginian, kolagen, poliakryloamid, poliuretan, polistyren. - Pułapkowanie we włóknach. Nośnik: octan celulozy. Metody tanie ale nie można jej stosowad do enzymów hydrolitycznych, działających na substraty wielkocząsteczkowe, oraz mogących degradowad żel. 3. Zamykanie wewnątrz membran półprzepuszczalnych. - Zamykanie w komórkach naturalnych np.: erytrocytach. - Kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie: liposomy, kapsułki nylonowe, z pochodnych celulozy. - Zamykanie pomiędzy membranami lub w wężach półprzepuszczalnych: nylonowych, silikonowych. Metody szczególnie cenne w lecznictwie, trudne do przeprowadzenia i konroli, zastosowanie wyłącznie do substratów małocząsteczkowych. 4. Unieruchamianie bez makroskopowego nośnika mechanicznego. - Sieciowanie przestrzenne. Kopolimeryzacja enzymów z nośnikami rozpuszczalnymi przy użyciu odczynników dwufunkcyjnych. Metoda łatwa i tania, zapewnia dużą aktywnośd i stabilnośd chemiczną, zalecana do procesów z użyciem substratów małocząsteczkowych. - Flokulacja komórek przy udziale polielektrolitów. - Samoagregacja, czyli naturalna flokulacja oraz wzrost drobnoustrojów w postaci kuleczek lub kłaczków biomasy.

3 Polarymetr - zasada działania Do pomiaru kata skręcenia płaszczyzny polaryzacji służy polarymetr. Ideę działania polarymetru przedstawiono na Rys. 12. Światło niespolaryzowane przechodzi przez polaryzator P1 ulegając polaryzacji. Spolaryzowana wiązka przechodzi przez rurkę R, w której umieszcza się badane roztwory. Jeżeli rurka zawiera wodę lub inną substancję nieczynną optycznie (Rys. 12a)), światło wychodzi z niej spolaryzowane w tej samej płaszczyźnie, w jakiej było spolaryzowane przed wejściem do rurki. Następnie trafia na drugi polaryzator P2 (analizator). Jeżeli oś transmisji polaryzatora P2 jest zgodna z osi transmisji polaryzatora P1 (a więc i kierunkiem polaryzacji światła), otrzymujemy jasno oświetlone pole widzenia. Jeżeli w rurce umieścimy substancję czynną optycznie (Rys.12b)), wówczas światło po wyjściu z rurki jest spolaryzowane liniowo w innej płaszczyźnie niż przed wejściem do rurki. Płaszczyzna polaryzacji światła zostaje obrócona o kąt Ø. Jeżeli oś transmisji analizatora P2 pozostawimy zgodną z osią polaryzatora P1, wtedy pole widzenia ulegnie przyciemnieniu, bowiem analizator przepuści jedynie składową pola elektrycznego fali padającej równą E 0 cos Ø. Aby odzyskad pierwotną maksymalną jasnośd pola widzenia, należy analizator obrócid o kąt skręcenia płaszczyzny polaryzacji Ø. Wtedy bowiem ponownie całe pole elektryczne zostaje przepuszczone przez analizator. Ze skali dołączonej do analizatora można odczytad kąt Ø. Polarymetr półcieniowy W opisanej powyżej metodzie pomiar kata skręcenia polaryzacji światła wymaga ustawienia analizatora w takiej pozycji, by uzyskiwad maksymalne oświetlenie pola widzenia. Ponieważ dośd trudno ocenia się maksimum jasności, w praktyce używa się polarymetrów z dodatkowym elementem, tzw. płytką półcieniową PP (Rys. 13). Jest to płytka kwarcowa, która przesłania połowę pola widzenia. Załóżmy, że w rurce R jest woda lub inna substancja nieczynna optycznie. Z powodu tego, że w półcieniowej płytce kwarcowej zachodzi skręcenie płaszczyzny polaryzacji o pewien mały kąt β, przy zgodnych osiach transmisji polaryzatora P1 i analizatora P2, połowa pola widzenia będzie przyciemniona (Rys. 13a).W tej sytuacji należy ustawid analizator w takiej pozycji, by obie połówki pola widzenia były jednakowo zaciemnione. Łatwo dostrzec, że aby to osiągnąd oś transmisji analizatora powinna pokrywad się z dwusiecznej kata β. Wtedy bowiem w obu połówkach pola widzenia przepuszczona zostanie przez analizator składowa pola elektrycznego o tej samej wartości E 0 cos(β/2). Na skali kątowej polarymetru powinniśmy mied wtedy wartośd 0 (Rys. 13b). Jeżeli w rurce R umieścimy ciecz optycznie czynną, to płaszczyzna polaryzacji światła po wyjściu z rurki ulegnie skręceniu o taki sam kąt Ø w całym polu widzenia, co spowoduje różnice oświetlenia poszczególnych jego połówek (Rys. 13c). Przywrócenie równego oświetlenia dokonuje się przez obrót analizatora P2 dokładnie o kąt Ø równy skręceniu płaszczyzny polaryzacji przez badaną ciecz (Rys. 13d). Analizator zaopatrzony jest w podziałkę kątową z noniuszem, co pozwala na odczyt kata Ø z dokładnością do dziesiątych części stopnia - Rys. 14. Polarymetr kołowy budowa Po przejściu światła przez soczewkę kolektora (2), filtr (3) i polaryzator (4), wiązka światła staje się liniową wiązka spolaryzowaną, która po przejściu przez płytkę półfalową (5) ulega rozkładowi na wiązkę światła normalnego i anormalnego, dając w polu widzenia potrójny efekt. Jeżeli w celi pomiarowej (6) umieszczonej w urządzeniu znajduje się substancja optycznie czynna, prosta wiązka spolaryzowana jest skręcana o okreslony kąt, możliwy do odczytu dzięki analizatorowi (7). Patrząc przez okular (9), widoczny jest potrójny efekt niejednakowej intensywności (natężenia) światła: możemy zaobserwowad ciemy lub jasny środek,

4 ciemną lub jasną prawą/lewą stronę pola widzenia (Rys. 3a i b). Za pomocą pokręteł noniusza (12) obracamy tarczą (11) i analizatorem (7) do momentu, w którym natężenie oświatlenia w polu widzenia (we wszystkich częściach) będzie jednakowe (Rys. 3c). Wartośc kąta skręcenia może byd wtedy odczytana ze skali noniusza (11) przez szkło powiększające (10) (Rys. 4). Wykonanie dwiczenia 1. Przygotowanie gęstwy drożdżowej Pobrad łyżeczką 15 g suszonych drożdży winnych: Saccharomyces cerevisiae lub Saccharomyces bayanus i przenieśd ilościowo do kolby 50 cm 3 zalewając 25ml jałowej wody destylowanej. Całośd dokładnie wymieszad. 2. Oznaczanie zawartości sacharozy w melasie Przygotowanie roztworu podstawowego melasy 1: 2 Do suchej zlewki odważyd 10g wymieszanej melasy. Dolewad powoli ok. 20ml ciepłej wody destylowanej (w razie potrzeby roztwór delikatnie podgrzad, aż do całkowitego rozpuszczenia kryształków cukru, a następnie schłodzid w zimnej wodzie do temperatury ok C). Uzupełnid naczynie wodą destylowaną do łącznej masy roztworu 30g i starannie wymieszad Oznaczanie zawartości sacharozy. Odważyd 25g roztworu podstawowego melasy 1:2 w kolbce miarowej o pojemności 50cm 3, dodad kolejno po 5ml płynów: Herlesa I (340 g Pb(NO 3 ) 2 /1000 ml wody) i Herlesa II (32 g NAOH/1000 ml wody), mieszając próbę po każdej dawce, zawartośd kolby dopełnid do kreski wodą destylowaną. Wymieszad starannie otrzymany roztwór i sączyd przez suchy sączek z bibuły filtracyjnej. W przesączu oznaczyd stężenie sacharozy. - metodą areometryczną Roztwór sacharozy (ok. 30/40ml) wlad do cylindra szklanego i powoli włożyd cukromierz (areometr Ballinga). Po 1-2 minutach odczytad wskazania cukromierza. (roztworu nie wylewad zachowad do kolejnych oznaczeo) - pomiar w refraktometrze Pomiar wykonujemy refraktometrem lunetowym MASTER-TA z automatyczną kompensacją temperatury. W tym celu podnosimy osłonę pryzmatu, pipetą nanosimy ok. 1 ml roztworu sacharozy tak, aby zamykając osłonę ciecz równomiernie, bez pęcherzyków powietrza pokryła cały pryzmat. Następnie patrząc przez lunetkę odczytujemy wynik. (skala po lewej stronie w 0 Brix, skala po prawej stronie 0 T.A.) Po wykonaniu pomiaru refraktometr dokładnie płuczemy pod bieżącą wodą i wycieramy delikatnie do sucha papierowym ręcznikiem. - pomiar w polarymetrze (sacharymetrze) o Włączyd urządzenie na 10 minut przed wykonywaniem pomiarów celem nagrzania lampy sodowej rozgrzana lampa emituje światło koloru żółtego o Obracając analizator ustawid go w takiej pozycji, aby całe pole widzenia było jednakowo oświetlone. Odczytad wynik ustawienia na skali noniuszem. Powtórzyd pomiar 10 razy i zapisad wyniki jako Ø 0 Za pomocą pokrętła (9) można wyregulowad w okularze ostrośd pola widzenia, tak aby był wyraźnie widoczny potrójny efekt o Napełnid celę pomiarową o długości 200mm wodą destylowaną i wstawid ją do polarymetru, tak aby rozszerzona jej częśd znajdowała się u góry (pozwala to na gromadzenie się pęcherzyków powietrza). Sprawdzid czy zmienia się wartośd Ø 0. (Jeżeli tak to dokładnie wymyd rurkę i powtórzyd powyższe czynności. UWAGA nakrętki na obu koocach celi pomiarowej powinny byd ostrożnie dokręcone!!!

5 o Napełnid celę pomiarową badanym roztworem. Włożyd celę do polarymetru i zmierzyd kąt skręcenia (10 razy) kręcąc pokrętłami tarczy ustawiamy w okularze obraz o jednakowym natężeniu oświetlenia Przez szkło powiększające odczytad wartośd kąta skręcenia ze skali i noniusza Ø A o o Wyliczyd wartości średnie Ø 0 oraz Ø A Obliczyd stężenie sacharozy w badanym roztworze korzystając ze wzoru: gdzie: c A stężenie sacharozy badanego roztworu [%] [α] 20 = skręcalnośd właściwa sacharozy, tj. kąt o jaki następuje skręcenie płaszczyzny polaryzacji światła przez roztwór sacharozy o stężeniu 100g w 100 cm 3 roztworu, w rurce o długości 1 dm, przy użyciu światła żółtego, w temperaturze 20 0 C. L długośd celi pomiarowej w *dm+ = 2 Ø A uśredniona wartośd kąta skręcenia sacharozy w badanym roztworze Ø 0 uśredniona wartośd kąta skręcenia w próbie kontrolnej 3. Przygotowanie pożywek 3.1. Rozcieoczyd melasę jałową wodą do zawartości 10% sacharozy (150 cm 3 ). Tak przygotowany roztwór sklarowad poprzez zagotowanie, ostudzenie i przesączenie. Na każde 100 cm 3 otrzymanej brzeczki melasowej dodad 0,85 g (NH 4 ) 2 SO 4 i 0,12 g (NH 4 ) 2 HPO 4. Przygotowane podłoże rozlad po 50 cm 3 do 3 kolb stożkowych o pojemności 250 cm 3 i doprowadzid do ph odpowiednio: 3.0; 5.2; 8.0 za pomocą za pomocą 5N NaOH lub 10N H 2 SO 4. Podłoże zaszczepid 2 cm 3 gęstwy drożdżowej drożdżami. Kolby zważyd, oznaczyd poziom cieczy i prowadzid hodowlę na wytrząsarce w temperaturze 30 0 C przez 48h Rozcieoczyd melasę jałową wodą do zawartości 10% sacharozy (150 cm 3 ). Tak przygotowany roztwór sklarowad poprzez zagotowanie, ostudzenie i przesączenie. Na każde 100 cm 3 otrzymanej brzeczki melasowej dodad 0,85 g (NH 4 ) 2 SO 4 i 0,12 g (NH 4 ) 2 HPO 4. Przygotowane podłoże rozlad po 50 cm 3 do 3 kolb stożkowych o pojemności 250 cm 3 i doprowadzid do ph 5.2 za pomocą 5N NaOH lub 10N H 2 SO 4. Podłoże zaszczepid 2 cm 3 gęstwy drożdżowej drożdżami. Kolby zważyd, oznaczyd poziom cieczy i prowadzid hodowlę w temperaturach odpowiednio: 15, 30 i 40 0 C przez 48h Rozcieoczyd melasę jałową wodą do zawartości 5, 10, 15% sacharozy (po 50 cm 3 ). Tak przygotowany roztwór sklarowad poprzez zagotowanie, ostudzenie i przesączenie. Na każde 100 cm 3 otrzymanej brzeczki melasowej dodad 0,85 g (NH 4 ) 2 SO 4 i 0,12 g (NH 4 ) 2 HPO 4. Przygotowane podłoże rozlad po 50 cm 3 do 3 kolb stożkowych o pojemności 250 cm 3 i doprowadzid do ph 5.2 za pomocą 5N NaOH lub 10N H 2 SO 4. Podłoże zaszczepid 2 cm 3 gęstwy drożdżowej drożdżami. Kolby zważyd, oznaczyd poziom cieczy i prowadzid hodowlę w temperaturze 30 0 C przez 48h Rozcieoczyd melasę jałową wodą do zawartości 10% sacharozy (150 cm 3 ). Tak przygotowany roztwór sklarowad poprzez zagotowanie, ostudzenie i przesączenie. Na każde 100 cm 3 otrzymanej brzeczki melasowej dodad 0,85 g (NH 4 ) 2 SO 4 i 0,12 g (NH 4 ) 2 HPO 4. Przygotowane podłoże przelad kolby stożkowej o pojemności 500 cm 3 i doprowadzid do ph 5.2 za pomocą 5N NaOH lub 10N H 2 SO 4. Podłoże zaszczepid 2 cm 3 gęstwy drożdżowej drożdżami. Kolbę zamknąd szczelnie korkiem zaopatrzonym w rurkę fermentacyjną wypełnione wodą destylowaną, zważyd, oznaczyd poziom cieczy i prowadzid hodowlę w temperaturze 30 0 C przez 7 dni. 4. Analiza hodowli drożdży Oznaczyd masę kolbek i poziom cieczy Zawartośd kolbek odwirowad (4000 obr/min, 5 minut). Supernatant zlewarowad (pozostawid do analizy zawartości sacharozy), a uzyskana biomasę drożdży użyd do oznaczeo Oznaczanie zawartości suchej masy. Oznaczenie polega na wysuszeniu próbki drożdży do stałej masy za pomocą wago suszarki: - 15 minut przed rozpoczęciem pomiaru włączyd wagosuszarkę urządzenie musi się nagrzad - po 15 minutach otworzyd wieko wagosuszarki, umieścid na szalce folię aluminiową (kwadrat ok. 5x5cm) i nacisnąd dwukrotnie przycisk TARE tarowanie wagi - zdjąd folię z szalki, rozprowadzid na niej ok. 2g drożdży (cienka warstwa) i ponownie położyd na szalkę zanotowad masę drożdży!

6 - zamknąd wieko wagosuszarki - nacisnąd przycisk F1 (programowanie temperatury) i klawiszem F2 ustawid temperaturę C - nacisnąd klawisz F1 (czas próbkowania) i klawiszem F2 ustawid czas próbkowania 20 - nacisnąd klawisz F1 pojawi się komunikat na wyświetlaczu READY potwierdzid ponownie naciskając F1, rozpoczyna się pomiar - wynik podawany jest w % wilgotności próbki - pomiar prowadzid do momentu uzyskania stałej wartości wilgotności - zapisad wynik i wyliczyd suchą masę analizowanej próbki - zakooczyd pomiar naciskając klawisz TARE otworzyd wieko wagosuszarki, wyciągnąd folię z drożdżami, zamknąd wieko, wyłączyd urządzenie 4.4. Oznaczenie zawartości sacharozy patrz pkt Oznaczenie zawartości etanolu - metodą piknometryczną Do kolby destylacyjnej odmierzyd cylindrem miarowym 150ml hodowli. Zmontowad zestaw do destylacji prostej i po uruchomieniu przepływu wody przez chłodnicę, ostrożnie prowadzid destylację zbierając destylat do zlewki. Destylację zakooczyd z chwilą uzyskania ok. 50ml destylatu. Destylat przelad do cylindra miarowego o pojemności 100 cm 3 i uzupełnid wodą destylowaną do poziomu co najmniej 50 cm 3 (zanotowad dokładną ilośd destylatu i dodanej wody). Czysty i suchy piknometr zważyd na wadze analitycznej, następnie napełnid go wodą destylowaną o temp. ok. 20 C i ponownie zważyd. Tak samo postąpid z otrzymanym destylatem napełnid piknometr i zważyd. Gęstośd destylatu (d) obliczyd ze wzoru: d = P 1 P 0 + m P 2 P 0 + m P 0 masa piknometru pustego [g] P 1 masa piknometru z destylatem o temperaturze 200C [g] P 2 masa piknometru z wodą o temperaturze 200C [g] m poprawka na ważenie w powietrzu, która wynosi 0,0012 Na podstawie gęstości destylatu odczytad zawartośd alkoholu etylowego z tablic. 5. Obserwacje, wyniki i wnioski przedstawid w formie sprawozdania 6. Literatura - Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna I i II tom; Wyd. Politechniki Łódzkiej; Bednarski W., Reps A.; Biotechnologia żywności; WNT; Warszawa; 2003.

7 Zależnośd pomiędzy g d, kg/m 3 Udział obj., % d, kg/m 3 Udział obj., % d, kg/m 3 Udział obj., % d, kg/m 3 Udział obj., % - 789,3 100, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,24 998,2 0, , , ,62