1 KSZTAŁTOWANIE PROCESU BIOTECHNOLOGICZNEGO

Transkrypt

1 Procesy biotechnologiczne mają bardzo zróżnicowany charakter, mogą być prowadzone wieloma sposobami i wymagają różnych warunków technicznych. Większość bioprocesów wymaga użycia czystych kultur drobnoustrojów, określonych linii komórkowych lub konkretnych enzymów. Procesy okresowe. W tradycyjnych procesach fermentacyjnych podłoże szczepione jest drobnoustrojami, które namnażają się i w czasie swojego wzrostu lub po jego zakończeniu tworzą określony produkt. Zalety procesu okresowego: - prostota prowadzenia operacji, - łatwość utrzymania warunków jałowych, - odnawialność inokulum zapobiegająca degeneracji szczepu. Wady procesu okresowego: - niska produkcyjność procesu, - brak możliwości regulacji stężenia substratu. Procesy ciągłe. Ciągłe procesy syntez mikrobiologicznych polegają na tym, że po wstępnym okresie namnażania drobnoustrojów rozpoczyna się stałe zasilanie hodowli świeżym podłożem, połączone z jej ciągłym odbiorem przy zachowaniu stałej objętości. Zalety procesu ciągłego: - możliwość prowadzenia hodowli dowolnie długo w najbardziej korzystnych warunkach, - możliwość regulacji warunków hodowli (szybkość zasilania, skład podłoża), - duża jednorodność fizyczna i chemiczna hodowli, - możliwość automatyzacji procesu, - większa szybkość i wydajność wielu procesów, Wady procesu ciągłego: - degradacja szczepów lub pojawienie się niekorzystnych mutacji, spadek wydajności procesu, - trudność w utrzymywaniu warunków aseptycznych (jeżeli są konieczne),

2 - niekorzystny dla hodowli ciągłej sposób rozwoju niektórych drobnoustrojów (tworzą układy wielokomórkowe, skupiska kłaczków i kuleczek), - niekorzystna relacja pomiędzy wzrostem drobnoustrojów a tworzeniem niektórych produktów metabolizmu syntetyzowanych przez komórki nie rosnące. Wadami procesów wykorzystujących swobodną zawiesinę komórek są: - straty materiału biologicznego, - konieczność oddzielania biomasy mikroorganizmów od płynu pohodowlanego, - ograniczone możliwości zastosowania procesów ciągłych. Wielu wad można uniknąć, stosując w miejsce zawiesiny mikroorganizmów, ich unieruchamianie na lub w stałym nośniku. Immobilizacja komórek na powierzchni lub wewnątrz stałego nośnika jest stosowana wtedy, gdy celem procesu nie jest otrzymanie biomasy mikroorganizmów, lecz przeprowadzenie odpowiedniej przemiany za pomocą enzymów zawartych w komórkach. Techniki unieruchamiania komórek i enzymów: 1. Wiązanie na powierzchni nośnika. - Adsorpcja i adhezja dzięki np.: siłom jonowym, wiązaniom wodorowym. Nośniki: drewno, celuloza, polimery syntetyczne, antracyt, tlenki metali, krzemionka, węgiel aktywny. Metoda łatwa i tania, ale wykorzystuje nietrwałe układy, w których zachodzi wymywanie katalizatora ze złoża. - Wiązania kowalencyjne, takie jak peptydowe, estrowe, węgiel-węgiel, węgiel-azot. Nośniki: karboksymetoloceluloza + karbodiimid, diaminy, kwasy dikarboksylowe, bezwodniki kwasowe. Metoda łatwa do wykonania, dająca stabilny układ ale droga. 2. Wiązanie w matrycy nośnika - Pułapkowanie w żelach naturalnych lub syntetycznych. Nośniki: agar, alginian, kolagen, poliakryloamid, poliuretan, polistyren. - Pułapkowanie we włóknach. Nośnik: octan celulozy. Metody tanie ale nie można jej stosować do enzymów hydrolitycznych, działających na substraty wielkocząsteczkowe, oraz mogących degradować żel. 3. Zamykanie wewnątrz membran półprzepuszczalnych. - Zamykanie w komórkach naturalnych np.: erytrocytach. - Kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie: liposomy, kapsułki nylonowe, z pochodnych celulozy. - Zamykanie pomiędzy membranami lub w wężach półprzepuszczalnych: nylonowych, silikonowych. Metody szczególnie cenne w lecznictwie, trudne do przeprowadzenia i konroli, zastosowanie wyłącznie do substratów małocząsteczkowych. 4. Unieruchamianie bez makroskopowego nośnika mechanicznego. - Sieciowanie przestrzenne. Kopolimeryzacja enzymów z nośnikami rozpuszczalnymi przy użyciu odczynników dwufunkcyjnych. Metoda łatwa i tania, zapewnia dużą aktywność i stabilność chemiczną, zalecana do procesów z użyciem substratów małocząsteczkowych. - Flokulacja komórek przy udziale polielektrolitów. - Samoagregacja, czyli naturalna flokulacja oraz wzrost drobnoustrojów w postaci kuleczek lub kłaczków biomasy.

3 Kwas cytrynowy Kwas cytrynowy (2-hydroksy-1,2,3-propanotrikarboksylowy) o M cz = 192 i temperaturze topnienia 153ºC po raz pierwszy został wyizolowany z soku cytryn. W formie krystalicznej kwas ten występuje w postaci bezwodnej lub jednowodnej. Jednowodna forma jest otrzymywana przez krystalizację w temperaturze poniżej 36,6ºC, powyżej tej temperatury powstaje forma bezwodna. Kwas cytrynowy występuje w przyrodzie w owocach cytrusowych i ananasach. Owoce te do niedawna były głównym źródłem tego kwasu. Światowa produkcja kwasu cytrynowego przekracza ton rocznie, co jest podyktowane bardzo dużym zapotrzebowaniem na ten kwas ze strony przemysłu spożywczego, farmaceutycznego, chemicznego oraz metalurgicznego. Jego wykorzystanie wynika m.in. z działania konserwującego na skutek obniżania wartości ph środowiska. Jednocześnie jest związkiem nietoksycznym, o dobrych walorach smakowych i zapachowych. Zastosowanie kwasu cytrynowego i jego pochodnych w produkcji i przetwórstwie żywności jest stosowany (za zgodą FAO/WHO) jako inhibitor enzymów, głównie oksydaz powodujących utlenianie polifenoli, co objawia się ciemnieniem owoców i warzyw, wykorzystywany jest do produkcji napojów, słodyczy, owoców kandyzowanych i win, jako środek zakwaszający i stabilizujący, tworzenie połączeń kompleksowych z jonami metali (Fe, Cu, Zn) zadecydowało o zastosowaniu jako stabilizatora olejów; wiążąc metale katalizujące proces jełczenia tłuszczów, kwas cytrynowy przerywa reakcję tworzenia nadtlenków i innych produktów powstałych w wyniku utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych w procesie autooksydacji olejów, zdolność do wiązania metali ciężkich umożliwiła wykorzystanie kwasu cytrynowego do oczyszczania powierzchni metali przed spawaniem lub pokrywaniem powłokami ochronnymi, w mleczarstwie, wodne roztwory kwasu cytrynowego są stosowane do usuwania z aparatury kamienia mlecznego (osad z białka, tłuszczu i soli mineralnych mleka), w przemyśle farmaceutycznym stosowany jest jako środek dodawany do tabletek powodujący efekt musujący, w stacjach krwiodawstwa pochodne kwasu cytrynowego są stosowane jako środki zapobiegające krzepnięciu krwi, w chemii gospodarczej sole kwasu cytrynowego wypierają trudno biodegradowane fosforany ze składu detergentów, estry kwasy cytrynowego znalazły zastosowanie jako nietoksyczne plastyfikatory w cienkich powłokach ochraniających żywność. W 1893 roku Wehmer po raz pierwszy wykrył kwas cytrynowy w kulturach pędzlaków i nazwał je Citromyces pfefferianus, a Curie w 1917 roku stworzył przemysłowe podstawy produkcji tego kwasu dzięki odkryciu, że Aspergillus niger rośnie dobrze i wydziela duże ilości kwasu cytrynowego w pożywkach płynnych o ph 2,5-3,5. Wzrost ph powoduje przestawienie produkcji na kwas glukonowy, a dalej na szczawiowy. Niska wartość ph chroni pożywkę przed zakażeniami, głównie bakteryjnymi. Producentami kwasu cytrynowego są wyselekcjonowane szczepy Aspergillus niger, A. wentii, A. clavatus oraz liczne drożdże z rodzaju Candida (C. lipolytica, C. tropicalis, C. intermedia, C. guilliermondi), które syntezują kwas cytrynowy w środowisku zawierającym n-alkany. Wśród szczepów z gatunku C. lipolytica został wyselekcjonowany szczep, u którego stwierdzono cykl płciowy (został nazwany na cześć odkrywcy Yarrowia lipolytica) i który może wytwarzać kwas cytrynowy z n-parafin, dzięki czemu znalazł szybko zastosowanie w przemyśle. Jednym z podstawowych aspektów przemawiających za stosowaniem drożdży jest ich zdolność do wykorzystywania w charakterze źródła węgla szerokiej gamy surowców, zwłaszcza niekonwencjonalnych. Jak wiadomo, używanie w procesach biotechnologicznych tanich odnawialnych surowców pozwala na znaczne obniżenie kosztów produkcji. W ostatnich latach, wraz z rozwojem produkcji biopaliw (biodiesla), atrakcyjnym i tanim surowcem stosowanym w procesach biotechnologicznych jest gliceryna. Szacuje się, że pod koniec 2010 r. na rynku europejskim będzie dostępnych około 1 mln ton gliceryny, którą zagospodaruje się różnymi metodami, w tym także metodami biotechnologicznymi. Jednak przetwarzanie glicerolu w użyteczne produkty w procesach biotechnologicznych znajduje się dopiero w fazie badań laboratoryjnych. Odpadowa gliceryna została wykorzystana szczególnie w procesach beztlenowych, m.in. do produkcji: 1,3 propanodiolu, dihydroksyacetonu, kwasu bursztynowego i wodoru. Wstępne badania, wskazują, że odpadowy glicerol zapewnia otrzymanie, w hodowlach z udziałem mutantów octanowych Y. lipolytica, wysokich ilości kwasu cytrynowego, dochodzących do 200 g/l. Ponadto wydajność kwasu cytrynowego z tego surowca była wyższa w porównaniu do hodowli prowadzonych w podłożach glukozowych. Interesujący jest również fakt, iż obok kwasu cytrynowego, w podłożach zawierających glicerol, szczep drożdży Y. lipolytica produkuje także duże ilości alkoholi cukrowych, takich jak erytrytol i mannitol. Kwas cytrynowy wytwarzają także Penicillium citrinum, Mucor piriformis. Jednak w praktyce przemysłowej największe znaczenie mają szczepy Aspergillus niger.

4 Wykonanie ćwiczenia 1. Przygotowanie podłoża 1.1. Podłoże inokulacyjne W kolbie o pojemności cm 3 przygotować 50 cm 3 podłoża inokulacyjnego zawierającego: - glicerol 2,5 g - glukoza 2,5 g - ekstrakt drożdżowy 0,15 g - ekstrakt słodowy 0,15 g - bactopepton - 0,25 g - woda 50 cm 3 Składniki przeliczyć tak aby otrzymać wymaganą ilość podłoża inokulacyjnego. Doprowadzić ph do wartości 5,5. Podłoże przygotować do sterylizacji w autoklawie Podłoże produkcyjne W kolbie 2000 cm 3 przygotować 1500 cm 3 podłoża produkcyjnego o składzie: glicerol 100,0 g - NH 4 Cl 3,0 g - MgSO 4 7H 2 O 1,0 g - KH 2 PO 4 0,2 g - ekstrakt drożdżowy 1,0 g - woda 1000 cm 3 Składniki przeliczyć tak aby otrzymać wymaganą ilość podłoża produkcyjnego. Doprowadzić ph do wartości 5,5. Podłoże przygotować do sterylizacji w autoklawie. 2. Posiew Candida lipolytica 2.1. Wyjałowione podłoże inokulacyjne zaszczepić hodowlą drożdży C. lipolytica. Hodowle prowadzić na wytrząsarce rotacyjnej, w warunkach tlenowych w temperaturze 30 0 C Hodowla produkcyjną prowadzimy w bioreaktorze zawierającym 1500 cm 3 jałowego podłoża produkcyjnego, w temperaturze 30 0 C, przy szybkości przepływu powietrza 0,2 vvm (dm 3 powietrza/ dm 3 podłoża min), szybkości obrotowej mieszadła 200 rpm. W czasie hodowli ph 5,5 utrzymujemy automatycznie za pomocą NaOH i HCl. 3. Oznaczanie biomasy drożdży 3.1. Biomasę drożdży oznaczyć wagowo. W tym celu pobieramy próbnikiem 20 cm 3 podłoża produkcyjnego. Oznaczenie polega na wysuszeniu zawiesiny drożdży do stałej masy za pomocą wagosuszarki: - 15 minut przed rozpoczęciem pomiaru włączyć wagosuszarkę urządzenie musi się nagrzać - po 15 minutach otworzyć wieko wagosuszarki, umieścić na wadze szalkę Petriego i nacisnąć dwukrotnie przycisk TARE tarowanie wagi - wprowadzić na szalkę Petriego 20 cm 3 podłoża produkcyjnego zanotować masę próbki - zamknąć wieko wagosuszarki - nacisnąć przycisk F1 (programowanie temperatury) i klawiszem F2 ustawić temperaturę C - nacisnąć klawisz F1 (czas próbkowania) i klawiszem F2 ustawić czas próbkowania 10 - nacisnąć klawisz F1 pojawi się komunikat na wyświetlaczu READY potwierdzić ponownie naciskając F1, rozpoczyna się pomiar - wynik podawany jest w % wilgotności próbki - pomiar prowadzić do momentu uzyskania stałej wartości wilgotności - zapisać wynik i wyliczyć suchą masę analizowanej próbki - zakończyć pomiar naciskając klawisz TARE otworzyć wieko wagosuszarki, wyciągnąć folię z drożdżami, zamknąć wieko, wyłączyć urządzenie 4. Kolorymetryczna metoda oznaczania kwasu cytrynowego (metoda Furtha-Herrmanna) Metoda kolorymetrycznego oznaczania kwasu cytrynowego polega na specyficznej i bardzo czułej reakcji zachodzącej pomiędzy stosowanymi odczynnikami: bezwodnikiem kwasu octowego, pirydyną i kwasem cytrynowym. W wyniku reakcji w badanym roztworze powstaje barwny kompleks, którego zabarwienie, zmieniające się od żółtego do brązowego zależy od stężenia kwasu cytrynowego. Dokładność metody wynosi ok. 3,5% i zależy od szybkości dodawania ściśle określonych objętości odczynników oraz temperatury, która podczas oznaczania powinna być utrzymywana na stałym poziomie 32ºC przez 30 minut. Stężenie kwasu cytrynowego w 1 cm 3 powinno zawierać się w granicach 0,1 0,5 mg.

5 4.1. Sporządzanie roztworów wzorcowych do wykreślenia krzywej wzorcowej - Roztwór barwny (A) do cylindra miarowego o objętości 100 cm 3 wprowadzić 10ml podłoża produkcyjnego (wyjałowionego, nie zawierającego komórek drożdży) i uzupełnić wodą destylowaną do 100 cm 3 (1 cm 3 roztworu zawiera 0,1 cm 3 wyjściowego roztworu pożywki syntetycznej). - Roztwór (B) W kolbie miarowej o objętości 500 cm 3 rozpuścić 2,5 g kwasu cytrynowego w 500ml wody destylowanej (1 cm 3 roztworu zawiera 5 mg kwasu cytrynowego). Do zestawu kolbek miarowych (6x100 cm 3 ) dodać 4ml roztworu barwnego (A) oraz odpowiednią ilość roztworu B (tabela 1). Dopełnić do kreski wodą destylowaną. TABELA 1. Roztwory wzorcowe kwasu cytrynowego Lp. 100 cm 3 roztworu wzorcowego zawiera Uwagi Roztwór A [cm 3 ] Roztwór B [cm 3 ] Woda dest. [cm 3 ] 1 4,0 0,0 96,0 Próba ślepa = 0 mg kwasu cytr. 2 4,0 2,0 94,0 1 cm 3 = 0,10 mg kw. cytr. 3 4,0 4,0 92,0 1 cm 3 = 0,20 mg kw. cytr. 4 4,0 6,0 90,0 1 cm 3 = 0,30 mg kw. cytr. 5 4,0 8,0 88,0 1 cm 3 = 0,40 mg kw. cytr. 6 4,0 10,0 86,0 1 cm 3 = 0,50 mg kw. cytr Wykonanie oznaczeń do krzywej wzorcowej Do 6 probówek szklanych przenieść po 1ml kolejnych roztworów wzorcowych, dodać najpierw 1,3ml pirydyny, a następnie 5,7ml bezwodnika kwasu octowego, delikatnie zamieszać i wstawić na ok. 20 min. do wody o temp C. Pomiar absorbancji wykonać w ciągu 30 minut od wyjęcia próbek z łaźni, przy długości fali 420 nm. Średnie wyniki z trzech powtórzeń pomiarów absorbancji dla każdego ze stężeń kwasu cytrynowego użyć do wykreślenia krzywej wzorcowej Oznaczenie kwasu cytrynowego w podłożu produkcyjnym Pobrać próbnikiem ok. 5 cm 3 podłoża produkcyjnego, całość przefiltrować w zestawie do filtracji próżniowej. W razie konieczności podłoże rozcieńczyć x5 lub x10 wodą destylowaną. Przenieść 1 ml roztworu do szklanej probówki i dalej postępować jak w punkcie powyżej (pkt. 5 dodając pirydyny i bezwodnika kwasu octowego). Stężenie kwasu cytrynowego w hodowli odczytać z wykresu krzywej wzorcowej Pomiar absorbancji kwasu cytrynowego - przed rozpoczęciem pomiaru należy otworzyć pokrywę spektrofotometru urządzenie nagrzewa się 15 minut!!! - po 15 minutach za pomocą pipety automatycznej wypełniamy szklaną kuwetę w 2/3 objętości roztworem wzorcowym próba ślepa (0g kw. cytrynowego) - trzymając kuwetę staramy się nie dotykać przeźroczystych ścianek naczynia!!! - w celu dokonania pomiaru naciskamy przycisk A, wpisujemy długość fali (420 nm), potwierdzamy naciskając A i umieszczamy kuwetę w urządzeniu, po chwili odczytujemy wynik absorbancji dla próby kontrolnej - pomiar powtarzamy 3 razy, za każdym razem wyciągając i ponownie wkładając kuwetę (urządzenie reaguje na nacisk wywołany ciężarem kuwety) nie naciskamy żadnych przycisków!!! - wynik końcowy podajemy jako średnią trzech pomiarów - analogiczne pomiary wykonujemy dla kolejnych stężeń kw. cytrynowego, po każdym pomiarze dokładnie płuczemy kuwetę wodą destylowana i delikatnie suszymy w bibule - podobnie wykonujemy oznaczenie kw. cytrynowego w płynie pohodowlanym - po pomiarach kuwety dokładnie płuczemy wodą destylowaną i pozostawiamy do wysuszenia na bibule - urządzenie wyłączamy zamykając pokrywę spektrofotometru 5. Obserwacje, wyniki i wnioski przedstawić w formie sprawozdania 6. Literatura - Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna I i II tom; Wyd. Politechniki Łódzkiej; Bednarski W., Reps A.; Biotechnologia żywności; WNT; Warszawa; 2003.