Ćwiczenie 15. Procesy biosyntezy w biotechnologii: produkcja dekstranu przez bakterie Leuconostoc mesenteroides

Transkrypt

1 Ćwiczenie 15. Procesy biosyntezy w biotechnologii: produkcja dekstranu przez bakterie Leuconostoc mesenteroides Cel ćwiczenia: Analiza mikrobiologiczna oraz badanie zdolności kultur przemysłowych bakterii Leuconostoc mesenteroides do produkcji dekstranu. Biosynteza zewnątrzkomórkowych polisacharydów przez drobnoustroje została wykorzystana praktycznie do otrzymywania około 20 produktów. Są nimi zarówno homo- jak i heteropolimery oparte na jednostkach glukozowych. Najważniejszymi wielocukrami otrzymywanymi metodami biotechnologicznymi na skalę przemysłową są: dekstran, ksantan, alginian, kurdlan, pululan, skleroglukan. Wykorzystanie polisacharydów obejmuje przemysł spożywczy, farmaceutyczny, chemiczny i kosmetyczny. Najważniejszym polisacharydem produkowanym na skalę przemysłową jest dekstran. Do produkcji dekstranu wykorzystywane są najczęściej szczepy bakterii mlekowych Leuconostoc mesenteroides. Są ziarniaki rosnące w postaci dwoinek lub krótkich łańcuszków. Należą do bakterii heterofermentatywnych. Nie wykazują zdolności do ruchu, są względnymi beztlenowcami. Szczepy produkcyjne wytwarzają dekstran liniowy zawierający ok. 95% wiązań 1,6-α i nieliczne rozgałęzienia boczne w pozycjach 1,3 i 1,4. Masa cząsteczkowa dekstranów wynosi od kilku tysięcy do kilku milionów Da i zależy od warunków hodowli. Enzym umożliwiający biosyntezę dekstranu to dekstranosacharaza (2-glukozylotransferaza 1,6-α-glukan:D-fruktoza). Enzym ten, w procesie transglikozylacji, przenosi resztę glukozy (z udziałem UDP) z sacharozy na odpowiedni akceptor (niskocząsteczkowy dekstran, maltozę lub inną cząsteczkę sacharozy): sacharoza + UDP = UDP-glukoza + fruktoza UDP-glukoza + akceptor = akceptor-glukoza + UDP Podłoże produkcyjne zawiera sacharozę oraz sole mineralne i źródło azotu organicznego (ekstrakt drożdżowy). Optymalne ph dla enzymu wynosi 6,5-7,0, a temperatura 23 C. Natomiast optimum dla wzrostu L. mesenteroides wynosi 30 C. Bioproces prowadzony jest bez napowietrzania metodą hodowli okresowej do 48 h. Stosowana jest także hodowla ciągła oraz synteza z wykorzystaniem izolowanego enzymu w postaci immobilizowanej. 1

2 Dekstran surowy stanowi mieszaninę cząsteczek o różnej masie zawierających mln jednostek glukozowych. Efekt biologiczny dekstranu zależy od wielkości jego cząsteczek. Do celów leczniczych wykorzystuje się dekstrany o małej masie i w miarę jednorodnej zakresie. Stosowane są dwa typy dekstranu: średniocząsteczkowy (średnia masa cząsteczkowa tys. Da) i niskocząsteczkowy (śr. masa tys. Da). Dekstran o masie kda stosowany jest jako środek osoczozastępczy w postaci 6% roztworu w soli fizjologicznej lub glukozie. 10% roztwór dekstranu stosowany do wczesnego uzupełniania płynów lub do zwiększania objętości osocza w leczeniu wspomagającym niektórych rodzajów wstrząsu lub zagrażającego wstrząsu, wynikającego z oparzeń, zabiegów operacyjnych, infekcji, krwotoku lub urazu, kiedy istnieje deficyt krwi krążącej, w celu przywrócenia objętości osocza i jego ciśnienia koloidoosmotycznego. Kompleksy dekstranu z jonami żelaza mogą być stosowane w leczeniu niedokrwistości. Niskocząsteczkowy dekstran może także służyć jako antykoagulant o właściwościach zbliżonych do heparyny. W biotechnologii dekstran modyfikowany wykorzystuje się do immobilizacji enzymów lub całych komórek. Ryc. 1 Schemat budowy cząsteczki dekstranu Odczynniki i podłoża: Leuconostoc mesenteroides rośnie dobrze na podłożach dla innych szczepów bakterii mlekowych głównie MRS oraz na zmodyfikowanym podłożu z sokiem pomidorowym. Podłoże produkcyjne do otrzymywania dekstranu zawiera przede wszystkim sacharozę, będącą substratem do biosyntezy dekstranu, oraz składniki mineralne, w tym nieorganiczne źródła azotu. 2

3 Podłoże Leuconostoc do hodowli L. mesenteroides ekstrakt mięsny ekstrakt drożdżowy pepton sacharoza K 2HPO 4 NaCl MgSO 4 agar woda destylowana 10,0 g 3,0 g 2,5 g 150,0 g 2,0 g 1,0 g 0,2 g 20,0 g do 1000 ml Podłoże do produkcji dekstranu sacharoza 100 g ekstrakt drożdżowy 0,4 g KH 2PO 4 1 g NH 4NaHPO 4 4,5 g MgSO 4 x 7 H 2O 0,2 g KCl 0,1 g MnCl 2 x 4 H 2O 0,02 g (NH 4) 6Mo 7O 24 x 4 H 2O 0,005 g woda destylowana do 1000 ml ph 6,7 Odczynnika Luffa-Schoorla (syn. roztwór cytrynianu miedzi II alkaliczny) Skład (proporcje na 1000 ml): roztwór siarczanu miedziowego: rozpuścić 25 g CuSO 4 x 5H 2O w 100 ml wody roztwór węglanu sodu: rozpuścić 143,8 g czystego, bezwodnego Na 2CO 3 w ok. 300 ml ciepłej wody roztwór kwasu cytrynowego: rozpuścić 50 g czystego kwasu cytrynowego w 50 ml wody Starannie mieszając, wlać roztwór kwasu cytrynowego do roztworu węglanu sodowego. Dolać roztworu siarczanu miedziowego i uzupełnić wodą do 1000 ml. Odstawić roztwór na noc do odstania się i przefiltrować. Wartość ph roztworu powinna wynosić w przybliżeniu 9,4. Szczepy: Czyste kultury Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicus (KKP 402) hodowle na podłożach zestalonych oraz podłożu płynnym (hodowla wstrząsana) do produkcji dekstranu (4 doby). Temperatura inkubacji: C. 3

4 Obserwacje czystych kultur Leuconostoc mesenteroides: Opisać wygląd makroskopowy kolonii na agarze hodowlanym (agar Leuconostoc) oraz produkcyjnym (podłoże z sacharozą). Wykonać preparaty mikroskopowe wybarwione fioletem goryczkowym, obserwować pod imersją wykonać rysunki. Opisać wygląd hodowli płynnej zwrócić uwagę na opalescencję hodowli, określić w przybliżeniu lepkość hodowli (określić czas wypływu 10 ml hodowli z pipety w odniesieniu do czystej wody). Wygląd makroskopowy kolonii L. mesenteroides na podłożu hodowlanym i produkcyjnym. Wygląd komórek L. mesenteroides w preparacie mikroskopowym z podłoża PRODUKCJA DEKSTRANU W SKALI LABORATORYJNEJ I. Oznaczenie suchej masy dekstranu: Wytrącić dekstran z hodowli za pomocą etanolu 96%. Otrzymaną kulkę wysuszyć w temp. 50 C i zważyć. Oznaczanie suchej masy dekstranu: [g] z ml hodowli. II. Oznaczenie zawartości fruktozy w hodowli metodą Luffa-Schoorla: Metoda Luffa Schoorla Zasada oznaczenia opiera się na reakcji redukcji jonów Cu 2+ zawartych w płynie Luffa przez sacharydy redukujące obecne w badanym roztworze. Reakcja zachodzi w środowisku zasadowym (ph ok. 9,5) w temperaturze wrzenia. 4

5 W skład płynu Luffa wchodzi: siarczan(vi) miedzi(ii) (CuSO 4 5H 2O), węglan sodu (Na 2CO 3 10H 2O), kwas cytrynowy (C 6H 8O 7 H 2O). W środowisku zasadowym sacharydy redukują siarczan(vi) miedzi(ii) do tlenku miedzi(i). Wprowadzenie do roztworu jodku potasu (KI) i kwasu siarkowego(vi) powoduje wydzielenie jodowodoru (HI). Ulega on reakcji z niezredukowanym przez sacharydy siarczanem (VI) miedzi(ii) i powstaje jodek miedzi(i). Nadmiar jodu (z dodatku KI) odmiareczkowuje się tiosiarczanem(vi) sodu (Na 2S 2O 3): 2 CuSO KI 2 K 2SO 4 + Cu 2I 2 + I 2 I Na 2S 2O 3 2 NaI + Na 2S 4O 6 Wykonuje się ślepą próbę, aby ustalić zużycie roztworu tiosiarczanu(vi) sodu na zmiareczkowanie jodu wydzielonego przez całkowitą ilość miedzi zawartej w płynie Luffa. Objętość tiosiarczanu(vi) sodu odpowiadająca ilości miedzi(ii) podlegającej redukcji przez sacharydy oblicza się jako różnicę objętości uzyskanych z dwóch miareczkowań (próby ślepej i właściwej), a następnie z odpowiedniej krzywej wzorcowej odczytuje się zawartość sacharydów redukujących w analizowanej próbce. Wykonanie: 1. Odmierzyć 20 ml hodowli, przenieść do litrowej kolby miarowej, uzupełnić wodą do kreski. 2. Pobrać 20 ml do kolby z szeroką szyjką, dodać 20 ml odczynnika Luffa-Schoorla i gotować przez 10 min. 3. Po ostudzeniu ostrożnie dodać 20 ml 25% H 2SO 4 wydzielający się dwutlenek węgla może spowodować wycieknięcie mieszaniny z kolby! 4. Dodać 2 g jodku potasu i miareczkować 0,1 M roztworem tiosiarczanu sodu wobec 1% skrobi. Wyniki odnieść do próby ślepej, którą stanowi czysta woda (20 ml). 5. Obliczyć wartość R (różnica w mililitrach pomiędzy ilością titranta zużytą do zmiareczkowania próby ślepej, a ilością zużytą do zmiareczkowania próby badanej). Odczytać z tabeli zawartość fruktozy w badanej hodowli. 6. Określić teoretyczną i praktyczną wydajność biosyntezy dekstranu na podstawie oznaczonej zawartości fruktozy oraz znanej, początkowej ilości sacharozy w podłożu, wykorzystując równanie: n C 12H 22O 11 = [C 6H 12O 5]n + n C 6H 12O 6 sacharoza dekstran fruktoza 100 g 47,36 g 52,64 g 5

6 Oznaczanie zawartości fruktozy metodą Lufa-Schoorla: ilość titranta próba ślepa [ml] ilość titranta próba badana [ml] średnia średnia różnica [ml] zawartość fruktozy w badanej hodowli Teoretyczna i praktyczna wydajność biosyntezy: 6

7 III. Określenie lepkości hodowli: 1) Czas wypływu 20 ml wody z pipety: 2) Czas wypływu 20 ml hodowli z pipety: Wnioski (z całego ćwiczenia): 7