Badania nad wpływem Karol Dziubek różnych czynników chemicznych i fizycznych na stężenie glutationu zredukowanego (GSH) W y d a w n ic t w o N a u k o w e i utlenionego (GSSG) A k a d e m ii P e d a g o g ic z n e j w wybranych organach K r a k ó w Rana esculenta L. w okresie zimowania
W
Badania nad wpływem różnych czynników chemicznych i fizycznych na stężenie glutationu zredukowanego (GSH) i utlenionego (GSSG) w wybranych organach Rana esculenia L. w okresie zimowania
Akademia Pedagogiczna im. Komisji Edukacji Narodowej w Krakowie Prace Monograficzne nr 437
Korol Dziubek Wydawnictwo Naukowe Akademii Pedagogicznej Kraków Badania nad wpływem różnych czynników chemicznych i fizycznych na stężenie glutationu zredukowanego (GSH) i utlenionego (GSSG) w wybranych organach Rana esculenla L. w okresie zimowania ISBi
Recenzenci prof, dr hab. Kazimierz Kochman prof, dr hab. Adam Kołątaj Copyright by Karol Dziubek & Wydawnictwo Naukowe AP, Kraków 2006 projekt okładki Maciej Kwiatkowski wydanie III zmienione, poszerzone ISSN 0239-6025 ISBN 83-7271-372-3 Redakcja/Dzial Promocji Wydawnictwo Naukowe AP 30-084 Kraków, ul. Podchorążych 2 tel./fax (012) 662-63-83, tel. 662-67-56 e-mail: wydawnictwo@ap.krakow.pl Zapraszamy na stronę internetową: http://www.wydawnictwoap.pl łamanie druk i oprawa Wydawnictwo Naukowe AP, zam. 13/06
Spis treści Wykaz najczęściej stosowanych skrótów 7 Wstęp 8 1. Cel pracy 20 2. Materiał i metody 21 2.1. Zwierzęta 21 2.2. Narządy 21 2.3. Grupy badawcze 21 2.4. Odczynniki 22 2.5. Oznaczanie GSH metodą Ellmana (19591 23 2.6. Oznaczanie GSH i GSSG metodą Matsumoto i wsp. (1996) 23 2.7. Oznaczanie glukozy 24 2.8. Statystyczna analiza wyników 24 3. Wyniki 25 3.1. Wpływ wieku na stężenie GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH 25 3.2. Wpływ podwyższenia temperatury na stężenie GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH 27 3.3. Wpływ insuliny na stężenie glukozy, GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH 29 3.4. Wpływ estru monoetylowego glutationu na stężenie GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH 34 3.5. Wpływ allopurynolu na stężenie GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH 38 3.6. Oddziaływanie kwasu L-2-oksotiazolidyno-4-karboksylowego (OTC) na stężenie GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH 42 3.7. Wpływ witaminy E na stężenie GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH 46 3.8. Wpływ promieniowania UVA na stężenie GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH 50 3.9. Wpływ etanolu na stężenie GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH 54 4. Dyskusja 58 4.1. Status GSH-GSSG 58 4.2. Stężenie GSH oraz GSSG w mózgu, wątrobie i nerkach żab młodocianych i dojrzałych płciowo 59 4.3. Stężenie GSH oraz GSSG w mózgu, wątrobie i nerkach żab przetrzymywanych w temperaturze 4'C i 14'C 62 5
4.4. Stężenie CSH oraz GSSC w mózgu, wątrobie i nerkach żab po podaniu insuliny 65 4.5. Stężenie GSH oraz GSSG w mózgu, wątrobie, nerkach i sercu żab po podaniu esteru monoetylowego glutationu 67 4.6. Stężenie GSH oraz GSSG w wątrobie, nerkach i sercu żab po podaniu allopurynolu 68 4.7. Stężenie GSH oraz GSSG w mózgu, wątrobie i nerkach żab po podaniu OTC 71 4.8. Stężenie GSH oraz GSSG w wątrobie, sercu i nerkach żab po podaniu witaminy E 72 4.9. Stężęnie GSH i GSSG w mózgu, wątrobie, nerkach oraz skórze żab po naświetlaniu UVA (365 nm) 74 4.10. Stężenie GSH i GSSG w mózgu, wątrobie i nerkach żab po podaniu etanolu 76 Podsumowanie i wnioski 78 Streszczenie 81 Literatura 83
Wykaz najczęściej stosowanych skrótów A - promieniowanie UVA (365 nm) ADP - adenozynodwufosforan Al. - allopurynol ATP - adenozynotrójfosforan BSO - butioninosulfoksymina D - żaby dojrzałe płciowo E - ester monoetylowy glutationu Et. - alkohol etylowy GGT - y-glutamylowa transpeptydaza GSH - glutation zredukowany GSSG - glutation utleniony GSH-Px - peroksydaza glutationowa GSH-Rd - reduktaza glutationowa GSH-Tr - transferazy S-glutationowe In. - insulina M - mózg Mł. - żaby młode NADPH - fosforan dwunukleotydu nikotynamidoadeninowy N - nerki OTC (O) - kwas L-2-oksotiazolidyno-4-karboksylowy 0 2~ - anionorodnik ponadtlenkowy OX - oksydaza ksantynowa *OH - rodnik hydroksylowy RFT - reaktywne formy tlenu S - grupa kontrolna po iniekcji soli fizjologicznej Se - serce Sk - skóra SOD - dysmutaza ponadtlenkowa T - witamina E W - wątroba 7
Wstęp Glutation zredukowany (GSH) jest głównym niskocząsteczkowym związkiem tiolowym, powszechnie występującym we wszystkich komórkach eukariotycznych zwierzęcych i roślinnych. Ta powszechność jego występowania oraz właściwości uniwersalnego" hydrofilowego antyutleniacza zasługują na szczególną uwagę. Stężenie wewnątrzkomórkowego GSH jest swoiste dla danego typu komórek i waha się od 1 do 10 mmol/l i znacznie przekracza stężenia innych niskocząsteczkowych związków tiolowych, takich jak cysteina, homocysteina, koenzym Q, WS-coenzym A. W typowej komórce GSH występuje w cytoplazmie, mitochondriach i jądrze komórkowym (Meister 1984). Zmiany w ilości GSH są procesami dynamicznymi odzwierciedlającymi równowagę między tempem jego syntezy i degradacji. W warunkach fizjologicznych ponad 99% glutationu występuje w formie zredukowanej (GSH), zaś forma utleniona, disulfidowa (GSSG) stanowi jego znikomą frakcję. Pomimo tego stosunek GSSH/GSH jest odpowiednio stały (Bradshaw i wsp. 1997). GSH jest syntetyzowany głównie w cytozolu, a co ciekawe uczestniczy w detoksykacji, ochronie i regulacji fizjologicznych funkcji również w jądrze komórkowym, mitochondriach, siateczce śródplazmatycznej, a nawet w przestrzeniach pozakomórkowych (Grigg i wsp. 1993; Kruman i wsp. 1997). Odpowiednia ilość GSH jest szczególnie istotna w jądrze komórkowym, w którym jest na ogół utrzymywana na odpowiednio stałym poziomie. Ilość ta zależy głównie od importu GSH z cytozolu, natomiast w mniejszym stopniu od syntezy w samym jądrze. Jądro komórkowe posiada wprawdzie enzymy syntetyzujące GSH, ale ich aktywność jest niewystarczająca do zapewnienia syntezy odpowiedniej ilości tego trójpeptydu. Dlatego też w porównaniu z cytozolem w jądrze komórkowym występuje tylko od 1 do 2% GSH (Ho i Guenthner 1994). GSH obecny w jądrze chroni jądrowy DNA przed cytotoksycznością wywoływaną np. przez związki alkilujące czy RFT. Co więcej, jeżeli eksperymentalnie obniży się jądrową pulę GSH, to zmniejsza się aktywność i efektywność naprawy oksydacyjnych uszkodzeń jądrowego DNA (Jevtovic-Todorovic i Guenthner 1991). 8
W mitochondriach występuje około 30% CSH w porównaniu z całkowitą jego zawartością w cytoplazmie i jądrze komórkowym (Schnellmann i wsp. 1988). Pochodzenie mitochondrialnego GSH nie jest do końca jasne. Podobnie jak w wypadku jądra, mitochondrialny GSH może pochodzić albo z importu z cytoplazmy, albo może być częściowo syntetyzowany de novo. Synteza ta jest jednak niewystarczająca do zapewnienia mitochondriom odpowiedniej ochrony antyoksydacyjnej (Wu i wsp. 2004). Dlatego też import GSH z cytozolu jest konieczny. Transport cytozolowego GSH do mitochondriów jest zależny od Na+ i jest hamowany przez koniugaty glutationowe (Lash 2005; Fernandez-Checa i Kaplowitz 2005; McKernan i wsp. 1991; Schnellmann 1991). Niezwykle interesującym jest fakt, że powstający w mitochondriach glutation utleniony (GSSG) nie jest transportowany do cytozolu, lecz jest w całości w nich regenerowany do GSH. Odbywa się to za pomocą NADPH + H+ i katalizowane jest przez enzym dehydrogenazę izocytrynianową (Jo i wsp. 2001). Mitochondria są głównym źródłem reaktywnych form tlenu (RFT) w komórce, dlatego ewolucja wyposażyła je w wydajny system antyoksydacyjny, który reguluje produkcję tych rodników. W skład tego systemu oprócz GSH wchodzi manganowa dysmutaza ponadtlenkowa (MnSOD) i peroksydaza glutationowa (GSH-Px). GSH-Px jest w zasadzie jedynym enzymem usuwającym nadtlenek wodoru tworzony w mitochondriach (Adachii i Ishii 2002). Należy pamiętać, że katalaza rozkładająca H20 2 jest nieobecna w mitochondriach większości komórek zwierzęcych, stąd wynika ważność GSH-Px w usuwaniu tego związku. GSH jako kofaktor potrzebny do działania mitochondrialnej peroksydazy glutationowej jest konieczny do obrony mitochondriów przed H2O r W przeciwnym razie mitochondria byłyby w pierwszej kolejności utleniane przez RFT, co w ostateczności prowadziłoby do śmierci komórek (Heales i wsp. 1995; Inoue i wsp. 2003). Poza komórkami, GSH występuje również w płynach ustrojowych, takich jak osocze krwi i żółć (Jones i wsp. 1995). W płynach tych jego stężenie waha się od 1 do 10 pmol/l, podczas gdy w komórce wynosi ono od 1 do 10 mmol/l (Roum i wsp. 1993; Stenzel i wsp. 1993). Pozakomórkowy GSH występuje również w płynie mózgowo-rdzeniowym (Bernhard i wsp. 1998). Świadczy to o powszechności uwalniania GSH z komórek, a także o tym, że w przestrzeniach tych spełnia on specyficzne funkcje fizjologiczne. Najważniejsza z nich ma polegać na kontrolowaniu i utrzymaniu pozakomórkowego statusu oksydacyjno-redukcyjnego (Hwang i Sinskey 1991). Pozakomórkowy GSH jest także pojemnym magazynem" cysteiny (Miller i wsp. 2002), która może być wykorzystywana przez różne typy 9
komórek do resyntezy CSH. Jest także substratem dla pozakomórkowych enzymów, tj. glutationowych S-transferaz (CSH STr) i peroksydazy glutationowej (GSH-Px) (Maser i wsp. 1994). Pozakomórkowy GSH ma także bezpośrednio chronić receptory, obecne na zewnętrznych powierzchniach błon komórkowych, przed związkami utleniającymi i RFT (Sternberg i wsp. 1993). Podobnie jak w komórce, tak też w całym organizmie ma miejsce wymiana GSH między różnymi narządami. GSH syntetyzowany w wątrobie jest transportowany do przestrzeni pozakomórkowych, a następnie wykorzystywany przez nerki i śledzionę (Lash 2005). Dla przykładu, u dorosłego człowieka do układu krążenia jest uwalniane około 16.6 ±6.2 pmol GSH na dobę (Burgunder i Lauterburg 1987). GSH występuje nie tylko w komórkach zwierzęcych, ale także w roślinnych i mikroorganizmach (Cagnac i wsp. 2005; Mendoza-Cozatl i Moreno- Sanchez 2005; Mendoza-Cozatl i wsp. 2005; Reunenbery i Brunold 1994). Na tej podstawie przyjmuje się, że GSH występuje w komórkach wszystkich żyjących organizmów. GSH jest N-[N-L-Y-glutamylo-L-cysteinylo]glicyną (schemat 1) syntetyzowaną z glutaminianu, cysteiny i glicyny (schemat 2). Synteza ta przebiega w dwóch etapach i jest katalizowana przez dwa cytoplazmatyczne enzymy, mianowicie syntetazę y-glutamylocysteinową (EC 6.3.1.2) oraz syntetazę glutationową (EC 6.3.2.3). Synteza ta została po raz pierwszy opisana przez Snoke'a i Blocha (1952). Schemat 1. Glutation zredukowany W pierwszym etapie syntezy powstaje y-glutamylocysteina. L-Glutaminian + L-cysteina + ATP» y-glutamylocysteina + ADP + P. Schemat 2. Pierwszy etap syntezy GSH 10
Pierwszy etap reakcji jest katalizowany przez syntetazę y-glutamylocysteinową, która w obecności jonów Mg2+ przyłącza kwas glutaminowy i L-cysteinę tworząc y-glutamylocysteinę. Jej aktywność jest regulowana na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego, mianowicie nadmiar CSH i cysteiny hamuje jej aktywność, zaś nadmiar glutaminianu znosi tę inhibicję (Gukasyan i wsp. 2003; Richman i Meister 1975). Aktywność syntetazy y-glutamylocysteinowej jest ponadto regulowana na poziomie transkrypcyjnym (Galloway i wsp. 1999; Grant i wsp. 1997; Fan i wsp. 2004; Kim i wsp. 2004), cytokiny - TNF-a i interleukinę ip (Cho i wsp. 1998; Kuo i wsp. 1996), przeciwutleniacze (Borroz i wsp. 1994) oraz hormony - insulinę i glukokortykoidy (Brennan i wsp. 2003; Cai i wsp. 1995). Sugerowano również, że aktywność tego enzymu zależy od fazy cyklu komórkowego (Komlosh i wsp. 2001). Ostatecznie GSH powstaje w drugim etapie, w wyniku reakcji pomiędzy grupą -N H 2 glicyny i -COOH cysteiny obecnej w powstałym w pierwszym etapie syntezy diaminokwasie. Reakcja ta jest katalizowana przez syntetazę glutationową. Na tym etapie syntezy wymagany jest również ATP i obecność jonów Mg2+(Meister 1975) (schemat 3). y-glutamylocysteina + L - glicyna + ATP -> GSH + ADP + P. Schemat 3. Drugi etap syntezy GSH Syntetaza glutationowa jest enzymem obecnym prawie we wszystkich typach komórek zwierzęcych (Njalsson i wsp. 2005). W przeciwieństwie do syntetazy y-glutamylocysteinowej, jej aktywność nie jest hamowana przez nadmiar GSH, lecz przez ilość ADP, który w tej reakcji odgrywa rolę regulacyjną, mianowicie wzrost ilości ADP hamuje aktywność enzymu (Huang i wsp. 1995). Na wzrost tempa syntezy GSH wpływa także szybkość absorbcji jego prekursorów, głównie jednak cysteiny (Gukasyan i wsp. 2003; Hayes i wsp. 2005; McBean i Flynn 2001). Cysteina może pochodzić z diety białkowej, proteolizy białek lub może być syntetyzowana z metioniny jako źródła siarki. Szybkość syntezy GSH zależy także od rodzaju organu, z całą pewnością najszybciej przebiega w hepatocytach (Atmaca i Fry 1996; O'Connor i wsp. 1995). Jak wspomniano, dzisiaj już wiemy, że większość komórek syntetyzujących GSH może go eksportować do przestrzeni pozakomórkowych. Długo nie znano mechanizmu tego transportu. Obecnie wiadomo, że GSH jest cząsteczką hydrofilną i pomimo wysokiego stężenia w komórce nie może dyfundować przez podwójną warstwę lipidową błony komórkowej. Musi 11
więc być aktywnie transportowany przez błony komórkowe za pomocą tzw. przenośników. Takie przenośniki po raz pierwszy stwierdzono w hepatocytach i oocytach Xenopus laevis (Fernandez-Checa i wsp. 1993b). Ich obecność potwierdzili także Yi i wsp. (1994), którym udało się wyróżnić dwa ich rodzaje, mianowicie RcGshT (kanalikowy przenośnik) i RsGshT (sinusoidalny). Obecnie wiadomo, że RcGshT występuje we wszystkich komórkach ssaków i uczestniczy w lokalnej homeostazie GSH (w danym narządzie), zaś RsGshT występuje tylko w wątrobie i utrzymuje homeostazę GSH między różnymi narządami (Yi i wsp. 1995). Ostatnio Lash (2005) odkrył nowe rodzaje anionowych przenośników (OAT1 i OAT3) transportujących GSH do komórek nerki. Prawdopodobnie podobnych przenośników transportujących GSH do komórek jest więcej (Ballatori i wsp. 2005). Zlokovic i wsp. (1994) opisali także inny przenośnik pośredniczący w transporcie GSH, z krwi do soczewki oka. Przenośnik ten jest wyraźnie różny od przenośnika RcGshT i RsGshT. Za pomocą tego przenośnika GSH krążący we krwi jest transportowany do soczewki oka. Jest to niezwykle ważne, ponieważ soczewka oka dysponuje małą ilością cysteiny z powodu ograniczonych możliwości jej resorbcji, przez co synteza GSH w tym narządzie jest znikoma (Rathbun i Murray 1991). Przypuszcza się, że przenośnik ten jest zależny od Na+(Kannan i wsp. 1999). Do dzisiaj nie wiadomo jaka jest efektywność przenośników GSH i od jakich czynników ma ona zależeć (Ballatori i wsp. 2005). Sugeruje się np., że y-glutamyloaminokwasy cis hamują, a trans stymulują transport GSH (Lu i wsp. 1996). Część pozakomórkowego GSH ulega rozkładowi. Ponieważ w cząsteczce GSH zamiast typowego wiązania peptydowego, tworzy się wiązanie pseudopeptydowe między grupą a-karboksylową (-COOH) kwasu glutaminowego a grupą aminową (-NH2) cysteiny, co czyni GSH opornym na naturalną degradację przez aminopeptydazy. Dlatego jego rozkład rozpoczyna nie aminopeptydaza, lecz transpeptydaza y-glutamylowa (GGT) (EC 2.3.2.1). Jest ona jedynym znanym enzymem zdolnym do inicjowania hydrolizy pozakomórkowego GSH. Dzięki tej hydrolizie komórki uzyskują dodatkowe źródło cysteiny, którą mogą wykorzystać do resyntezy GSH (Enoiu i wsp. 2002; Schoffner i wsp. 1995; Zhang i wsp. 2005). Badania histologiczne sugerują, że poza hydrolizą pozakomórkowego GSH GGT spełnia także specyficzną rolę w biologii nowotworów. Okazuje się, że komórki nowotworowe w porównaniu z komórkami zdrowymi charakteryzują się wysoką aktywnością GGT. Określa się je więc jako GGTpozytywne (Paolicchi i wsp. 1997). Ekspresja GGT ma miejsce w różnych typach nowotworów, głównie jednak w nowotworach wątroby, śledziony, 12
gruczołów mlecznych i jajników (Hanigan i wsp. 1994). Komórki nowotworowe dzięki GGT efektywnie korzystają z pozakomórkowego GSH, przez co stają się oporne na podawane leki (Hochwald i wsp. 1996; Townsend i wsp. 2003). G G T uczestniczy także w transporcie aminokwasów do wnętrza komórek i w metabolizmie cząsteczek y-glutamylowych (Kannan i wsp. 1996). Powstająca w wyniku rozkładu GSH reszta glutamylowa może być przez GGT przenoszona nie tylko na cysteinę, ale także na metioninę, alaninę i walinę. W organizmach zwierzęcych GGT najczęściej przenosi jednak resztę glutamylową na cysteinę. W wyniku tego powstaje cysteinyloglicyna i odpowiedni y-glutamyloaminokwas (schemat 4). GSH + aminokwas -> y-glutamyloaminokwas + cysteinyloglicyna Schemat 4. Degradacja GSH Powstające y-glutamyloaminokwasy i cysteinyloglicyna są transportowane do wnętrza komórek przy udziale przenośników dipeptydów. W komórkach ma miejsce przekształcanie y-glutamyloaminokwasów przez y-glutamylotransferazę (EC 2.3.2.4). Enzym ten przekształca resztę y-glutamylową w 5-oksoprolinę z równoczesnym uwalnianiem aminokwasu, który w pierwszej reakcji był akceptorem tej reszty (schemat 5). y-glutamyloaminokwas -» 5-oksoprolina + aminokwas Schemat 5. Przekształcanie y-glutamyloaminokwasów Od aktywności y-glutamylotransferazy zależy to, czy komórka importuje GSH czy jest jego eksporterem. W wypadku wyraźnie podwyższonej aktywności enzymu komórka importuje GSH. Odwrotnie, przy małej aktywności y-glutamylotransferazy jest jego eksporterem. Tak więc tempo transglutynacji decyduje o kierunku obiegu GSH w organizmie. W wątrobie wzrost aktywności y-glutamylocyklotransferazy obserwuje się po podaniu niektórych ksenobiotyków, np. fenobarbitalu, etanolu lub różnych związków kancerogennych, zaś spadek po podaniu testosteronu i gestagenu (Kretzschmar i wsp. 1991 a, b). Drugi produkt reakcji katalizowanej przez y-glutamylową transpeptydazę, mianowicie cysteinyloglicyna jest hydrolizowana przez dwupetydazę cysteinyloglicynową do cysteiny i glicyny (schemat 6). Cysteinyloglicyna -> cysteina + glicyna Schemat 6. Degradacja cysteinyloglicyny 13
Najważniejszą funkcją GSH jest utrzymywanie grup tiolowych -SH w formie zredukowanej, co jest warunkiem ich aktywności funkcjonalnej. Reakcje redukcji utlenionych grup -SH mogą zachodzić nieenzymatycznie bądź z udziałem enzymów, dla których GSH jest substratem. Wzrost np. stężenia anionorodnika ponadtlenkowego lub H20 2 może prowadzić do utleniania grup -SH w białkach i do peroksydacji lipidów, a w konsekwencji do trwałego uszkodzenia komórki. Dlatego dzięki zdolności do redukcji nadtlenków oraz utrzymywania odpowiedniego poziomu grup -SH w białkach, GSH jest jednym z ważniejszych elementów antyoksydacyjnego systemu obrony komórki (Bukowska 2005). Właściwości antyoksydacyjne glutationu są szczególnie ważne w przypadku erytrocytów. Krwinka czerwona jest komórką narażoną na działanie reaktywnych form tlenu. Wynika to z faktu, że jest on komórką transportującą tlen cząsteczkowy, który stanowi potencjalne źródło aktywnych rodników. Poza tym błony biologiczne budujące erytrocyty zawierają dużo wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, które w środowisku bogatym w tlen i pochodne mu rodniki utleniają się do nadtlenków lipidowych. Proces ten prowadzi do destrukcji błon oraz może spowodować wystąpienie zaburzenia równowagi osmotycznej i utratę aktywności enzymów związanych z błonami. Erytrocyt zawiera też żelazo, które dzięki zmiennej wartościowości ułatwia redukcję tlenu cząsteczkowego do anionorodnika ponadtlenkowego. Rodnik ten na drodze reakcji dysmutacji, w obecności Fe staje się prekursorem bardzo toksycznego rodnika hydroksylowego. Ponieważ erytrocyt jest pozbawiony mitochondriów i siateczki sródplazmatycznej to wolne rodniki są wytwarzane przez hemoglobinę. W warunkach fizjologicznych około 3% hemoglobiny ulega utlenieniu do methemoglobiny. W trakcie tego procesu elektron przeskakuje na tlen generując w ten sposób aninorodnik (Sharma i wsp. 2000). GSH pełni więc funkcję wewnątrzkomórkowego buforu redoks o dużej pojemności, rolę zmiatacza" reaktywnych związków elektrofilowych, w przemianach wielu związków endogennych i w regulacji aktywności wielu enzymów (Erden i wsp. 2002). Dzięki tym cechom GSH stanowi główny element obrony przed stresem oksydacyjnym. Będąc zaś magazynem" reszt cysteinowych, odgrywa znaczącą rolę w detoksykacji ksenobiotyków, pestycydów czy jonów metali ciężkich. W wyniku reakcji z wolnymi rodnikami organicznymi, GSH przekazuje atom wodoru na rodnik, powodując tym samym jego neutralizację. Powstaje w ten sposób rodnik glutationylowy (*GS), który jest mniej szkodliwy. Dzięki tym reakcjom grupy tiolowe białkowe są utrzymywane w stanie zredukowanym (Sies 1991; Wudarczyk i wsp. 1996), co jest warunkiem ich aktywności 14
funkcjonalnej. To decyduje o tym, że GSH zaliczany jest do pierwszej lini obrony komórki przed następstwami stresu oksydacyjnego. Tak jak już wcześniej wspomniano, GSH redukuje także H2O r Reakcje te katalizuje selenozależna GSH-Px, w której selen występuje w postaci selenocysteiny, przez co jest ona łatwo dostępna dla H2O r U roślin nadtlenek wodoru jest substratem katalazy, a w komórkach zwierzęcych głównym szlakiem jego usuwania jest reakcja z GSH-Px (schemat 7). 2GSH + H20 2-> GSSG + 2H20 Schemat 7. Redukcja nadtlenku wodoru przez GSH Reakcja ta, poza usuwaniem H20 2 zapobiega powstawaniu niezwykle groźnych rodników hydroksylowych (*OH), a także tlenu singletowego C 0 2). Ilość GSSG powstającego w reakcjach detoksykacji H20 2 wyraźnie powiększa się w miarę wzrostu w komórkach tego nadtlenku. W takiej sytuacji wzrasta w komórkach wartość stosunku GSSG/GSH, czemu towarzyszy zahamowanie wielu funkcji komórkowych, między innymi biosyntezy białka. Zagrożenie dla organizmu zależy od funkcji jaką konkretne białko pełni, w każdym razie utrata aktywności enzymów, transporterów błonowych czy białek regulatorowych na pewno nie jest dla organizmu obojętna. Jeszcze poważniejsze konsekwencje pociąga za sobą modyfikacja zasad azotowych wchodzących w skład DNA, przez wzrost ilości RFT i GSSG (Nobili i wsp. 2005; Zoeren-Grobben i wsp. 1997). Powstający GSSG jest redukowany do GSH przy udziale NADPH (schemat 8) lub NADH (schemat 9). GSSG + NADPH + H+-> 2GSH + NADP+ Schemat 8. Redukcja GSSG przy udziale NADPH GSSG + NADH + H+-> 2GSH + NAD+ Schemat 9. Redukcja GSSG przy udziale NADH Reakcję redukcji GSSG katalizuje reduktaza glutationowa (EC 1.6.4.2) (GSH-Rd). Jest ona enzymem powszechnie występującym w komórkach zwierzęcych. To dzięki niej w normalnie funkcjonujących komórkach istnieje odpowiednio stały stosunek GSSG/GSH (Sies 1991). W wypadku zahamowania aktywności GSH-Rd, nadmiar powstającego GSSG może być niebezpieczny dla komórek, gdyż GSSG może reagować z grupami tiolowymi 15
białek. Produktami tych reakcji są mieszane disulfidy glutationowo-białkowe. Zmiany konformacyjne jakie dokonują się w białkach pod wpływem GSSC prowadzą do upośledzenia ich funkcji. Dlatego też w sytuacji, gdy regeneracja powstającego GSSG przekracza możliwości komórki, związek ten może być aktywnie transportowany na zewnątrz komórki z udziałem białek transbłonowych MRP1 lub MRP2 (Bukowska 2005; Hirrlinger i wsp. 2001; Lapshina i Bartosz 1995). GSH nie tylko rozkłada H20 2 (Rosenblat i Aviram 1998), ale także uczestniczy w reakcjach koniugacji z egzogennymi i endogennymi reaktywnymi metabolitami, powstającymi w czasie metabolizmu ksenobiotyków, z toksynami, nadtlenkami organicznymi, nadtlenkiem wodoru i wolnymi rodnikami (Habdous i wsp. 2004; Onaran i wsp. 1998; Volk i wsp. 2005). Sprzęganie ksenobiotyków z glutationem dokonuje się przy udziale transferaz S-glutationowych. Tworzenie koniugatów glutationu może zachodzić także spontanicznie, ale na ogół wymagana jest jednak obecność transferaz S-glutationowych, których bardzo wysoką aktywność wykazują komórki wątroby (Lee i wsp. 1988). Transferazy S-glutationowe katalizują reakcje sprzęgania GSH ze znaczną liczbą związków aktywnych i wielu czynników alkilujących, co chroni komórki przed ich potencjalną toksycznością. Powstałe koniugaty GSH są tworzone wewnątrzkomórkowo, ale mogą być eksportowane z komórek przez pompę sodowo-potasową, sprzężoną z ATP-azą (Ishikawa i Sies 1984), po czym są dalej metabolizowane w różnych procesach detoksykacji. Koniugaty GSH są metabolizowane przez te same degradujące enzymy, które uczestniczą w metabolizmie samego GSH, takie jak y-glutamylotranspeptydazę i peptydazy. Koniugaty GSH są metabolizowane przez oderwanie reszt kwasu glutaminowego i glicyny, a następnie utworzone S-koniugaty cysteiny wracają do komórki i są N-acetylowane do kwasu merkapturowego (Hinchman i Ballatori 1994). Glutaminian i glicyna mogą być użyte do biosyntezy GSH, podczas gdy S-koniugaty mogą być acetylowane przez N-acetylotransferazy do kwasu merkapturowego. Kwas ten jest uwalniany do żółci, częściowo z moczem (Hinchman i wsp. 1991). GSH dzięki nukleofilowemu charakterowi łatwo reaguje zarówno z endojak i egzogennymi związkami elektrofilowymi (Zimniak i Awasthi 1993). Duże zainteresowanie towarzyszy endogennym koniugatom GSH. GSH może je tworzyć z prostaglandynami, leukotrienami, dopaminą, koenzymem A, tlenkiem azotu i witaminą K (Buzard i Kasprzyk 2000; Sies 1999). GSH zapobiega również uszkodzeniom komórek: przez szok cieplny (Aucoin i wsp. 1995); promieniowanie ultrafioletowe (Leccia i wsp. 1998), promieniowanie jonizujące (Shimizu i wsp. 1998) i infekcję (Meister 1995). 16
W tej tak ważnej ochronnej roli CSH nie jest odosobniony, gdyż efektywnie wspomagają go inne składniki wchodzące w skład antyoksydacyjnego systemu komórkowego, mianowicie GSH-Px, GSH-Rd, SOD, witaminy C, A i E (Asuncion i wsp. 2004; McArdle i wsp. 2004; Zhan i wsp. 2004). Witaminy te, podobnie jak tiole białkowe, dzięki GSH są utrzymywane w stanie zredukowanym (Meister 1991). Na tej podstawie sugeruje się, że istnieją synergistyczne reakcje między wszystkimi składnikami antyoksydacyjnego systemu komórkowego (Allen i Venkatraj 1992). Interesujący jest fakt, że w reakcjach przeciwdziałających komórkowym uszkodzeniom wywoływanym przez oksydanty zawsze obniża się ilość wewnątrzkomórkowego GSH, która jednak szybko powraca do normy, kiedy ustanie działanie takiego czynnika (Ishikawa i Sies 1989). Dlatego też zmiany w zawartości i w tempie metabolizmu GSH w różnych tkankach decydują o ich wrażliwości na czynniki wywołujące stres oksydacyjny (Lautier i wsp. 1992), np. na działanie H20 2 (Halliwell i wsp. 2004). GSH odgrywa także istotną rolę w ramach funcji immunologicznych, np. w aktywacji limfocytów i ich cytotoksyczności (Staal i wsp. 1990). Potwierdzają to badania nad wpływem GSH na replikację wirusa HIV. W czasie zakażenia tym wirusem obniża się koncentracja GSH we krwi (Staal i wsp. 1993). Ponieważ grupy -SH glutationu odgrywają ważną rolę w funkcjonowaniu limfocytów i regulacji czynników transkrypcyjnych, np. NFkB, to obniżenie się koncentracji tych grup przyczynia się do postępu choroby. I rzeczywiście, infekcja HIV w zakażonych komórkach ulega zahamowaniu w warunkach wzrostu koncentracji sulfhydryli (Mihm i wsp. 1991). Bardzo dobitnie potwierdzają to badania Palamara i wsp. (1996), a także Sprietsma (1999), w których wykazano, że bezpośrednie podanie GSH w pierwszych tygodniach zakażenia wirusem HIV hamuje replikację samego wirusa, co prowadzi do regresji choroby. Obecne badania sugerują także, że podniesienie poziomu GSH u pacjentów z AIDS prowadzi do przedłużenia życia, nawet jeśli liczba komórek CD4 jest mała (Look i wsp. 1997; Sbraua i wsp. 2002). Sugeruje się, że niedobory GSH towarzyszą również wielu innym stanom chorobowym. Zdaniem Winiarskiej (2000) nie zawsze do końca wiadomo, czy są one przyczyną, czy raczej skutkiem określonego zaburzenia metabolicznego. Od niedawna nieśmiało mówi się także o tym, że GSH może pełnić rolę neurotransmitera, przez co może wpływać na neuronalną aktywność mózgu (Shaw i wsp. 1996). Mówi się także o jego udziale w przekazywaniu sygnałów wewnątrz komórki, poprzez regulację funkcjonowania fosfataz (Sundaresan i wsp. 1995), w konformacji białek (Pennelli i wsp. 2003), a także 17
0 jego wpływie na apoptozę komórek (Armstrong i wsp. 2002; Chuang 1wsp. 2003; Pan i Perez-Polo 1993; Valverde i wsp. 2005; Vlachaki i Meyn 1998). Sądzi się tak, gdyż CSH uczestniczy w utrzymywaniu równowagi między proliferacją a apoptyczną śmiercią komórek (Armstrong i wsp. 2002; Cel li i wsp. 1998). Wiadomo również, że koniuganty GSH powstające w reakcjach katalizowanych przez GSH-Tr., a także GSSG są niezwykle czułymi biomarkerami, wskazującymi na obecność czynnika toksycznego w organizmie (Cross i wsp. 1992, Nemeth i Boda 1994; Nobili i wsp. 2005). Co więcej, koniuganty te mogą nawet określać naturę interakcji tego czynnika z docelowymi strukturami komórkowymi (Smith i wsp. 1996). Poza niewątpliwie istotnym i ochronnym wpływem GSH na organizm, nie należy zapominać, że w niektórych sytuacjach, np. guzach nowotworowych, obserwuje się jego wyższy poziom w porównaniu z normalnymi komórkami wokół nowotworu. Tak więc komórki nowotworowe wykorzystują nadmiar GSH, pozostawiając inne komórki bez ochrony. Ten nadmiar glutationu komórki nowotworowe wykorzystują do chronienia siebie przed atakiem, zwłaszcza przed toksynami stosowanymi w chemioterapii. Aby więc terapia była skuteczniejsza, celowo obniża się ilość GSH. Dopiero bowiem po obniżeniu jego ilości przez butioninosulfoksyminę (BSO) (Honda i wsp. 2004) komórki, np. nowotworowe, stają się bardziej wrażliwe na podawane leki przeciwnowotworowe, głównie cisplatynę (Bier i wsp. 1996). Badania nad fizjologiczną rolą GSH prowadzi się głównie na ssakach. W badaniach tych najczęściej podkreśla się udział GSH w kontroli stanu zredukowania grup -SH w białkach, w regulacji procesu apoptozy, detoksykacji ksenobiotyków, utrzymaniu w zredukowanej formie innych przeciwutleniaczy oraz tworzeniu endogennych koniugantów. Ostatnio coraz częściej zwraca się uwagę na zaburzenia homeostazy GSH, która towarzyszy wielu stanom patologicznym: chorobom neurodegeneracyjnym, infekcjom wirusowym, cukrzycy, marskości wątroby oraz niektórym schorzeniom układu krążenia (Adamy i wsp. 2005; Badaloo i wsp. 2005; Becker i wsp. 2005; Winiarska i Drozak 2002). Do dzisiaj wyniki tych badań opublikowano w ponad 50 tysiącach prac, jednak liczba odnośnych publikacji dotycząca np. płazów jest znikoma. W publikacjach dotyczących płazów, głównie bezogonowych, prezentowano wyniki badań nad wpływem dehydratacji, ultradźwięków, głodzenia, wodorotlenku t-butylu, melatoniny, acetaminofenu, naproksenu, szoku cieplnego, zimna i rozwoju (Angelucci i wsp. 2002; Cavas i Tarban 2003; Dziubek 1985, 1987a, b, c, 1988, 1997, 1998a, b, 1999a, b, c, d; Hermes-Lima, Storey 1988; Holden i Storev 1997; Joanisse i Storey 1996; López-Torres i wsp. 1993a, b; Rice i wsp. 1995) na zmiany 18
zawartości GSH, ilości GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH, będącego jednym z istotnych i czułych markerów stresu oksydacyjnego (Hermes-Lima i Storey 1996). Uzyskane dane nie odpowiadają jednak na pytanie, czy można doświadczalnie wpływać ma zmiany ilości GSH u żab w okresie dla nich najbardziej niekorzystnym w ciągu roku, tj. w okresie odrętwienia zimowego. Zimujące żaby przebywają wtedy w wodzie o temperaturze około 4 C i przez kilka miesięcy nie pobierają pokarmu (Boutilier 2001; Donohoe, West, Boutilier 1998; Martin i wsp. 1999). Przebywanie żab w wodzie naraża je na zanieczyszczenia środowiskowe, głównie wywołane przez stosowane powszechnie pestycydy. Ponad 60% pestycydów usuwanych jest z organizmu z udziałem GSH (Anguiano i wsp. 2001; Różański 1992). Dlatego też, aby organizm żab był odpowiednio chroniony, powinien produkować znaczne ilości GSH. Uwzględniając te fakty prowadzono wieloletnie badania nad wpływem różnych czynników chemicznych i fizycznych na zawartość GSH i GSSG u R. esculenta L. w okresie odrętwienia zimowego (Dziubek 1998, 2000). Podobne badania odnośnie zmian ilości GSH były wprawdzie przeprowadzane, ale tylko u zapadających w sen zimowy żółwi, zaskrońców i wiewiórek (Andrews 2004; Drew i wsp. 1999; Hermes-Lima i Storey 1993; Perez-Pinzon i Rice 1995; Willmore i Storey 1997). Okres odrętwienia zimowego jest interesujący również dlatego, że w podobnych warunkach temperaturowych, w jakich zimują żaby, przechowuje się organy przeznaczane do przeszczepów (Kevelaitis i wsp. 1997; Lindell i wsp. 2005). Organy te przed transplantacją przepłukuje się odpowiednimi mediami w celu ich natlenienia oraz usunięcia toksycznych metabolitów. Niezwykle ważne jest, aby organy te miały zapewnioną skuteczną osłonę antyoksydacyjną. Dlatego też do mediów tych coraz częściej dodaje się różne związki o właściwościach antyoksydacyjnych. Cały czas poszukuje się coraz efektywniejszych antyoksydantów, aby uchronić przeszczepiane narządy przed RFT generowanymi w czasie ischemii i reperfuzji. Takim odpowiednim antyoksydantem może być GSH (De Chiara i wsp. 2005; Moreno i wsp. 2005). Ponieważ GSH podany do mediów nie wnika biernie do komórek, to dlatego szuka się czynników fizycznych i chemicznych, które mogłyby zwiększyć jego syntezę in vivo w narządach przetrzymywanych w niskich temperaturach (Khan i wsp. 2005; Lemasters i Thurman 1997; Quintana i wsp. 2002; Quintana i wsp. 2003; Rodriguez i wsp. 1998; Sommer i wsp. 2005). Być może, że znalezienie takich czynników przyczyniłoby się do lepszego poznania skutecznych sposobów dłuższego przechowywania narządów przeznaczonych do transplantacji.
1. CEL PRACY U Rana esculenta L. w okresie odrętwienia zimowego postanowiono określić zawartość GSH, GSSC oraz stosunek GSSC/GSH pod wpływem: - podwyższenia temperatury, - wieku, - iniekcji insuliny, - estru monoetylowego glutationu, - allopurynolu, - kwasu L-2-oksotiazolidyno-4-karboksylowego, - witaminy E, - promieniowania UVA, - etanolu. W tym celu oznaczenia zawartości GSH i GSSG wykonano w mózgu, wątrobie, nerkach, sercu i skórze żab. Z danych literaturowych wynika, że narządy te odgrywają bardzo ważną rolę w metabolizmie glutationu ssaków, należy więc przypuszczać, że także u płazów (Akbas i wsp. 2005; Aptula i wsp. 2005; Broccali i wsp. 2005; Carrero i Husain 2005; Favilli i wsp. 1994; Freeman i wsp. 2005; Gouze i wsp. 2005; Grattagliano i wsp. 2005; jelenkovic i wsp. 2005; Meister 1995; Nicoletti i wsp. 2005; Nygren i wsp. 2005; Quine i Raghu 2005; Rigobello i wsp. 2005; Sagara i wsp. 1996; Sam i wsp. 2005; Shelly i Lu 1998; Siddigui i wsp. 2005). 20
2. MATERIAŁ I METODY 2.1. Zwierzęta Badania przeprowadzono na 410 dojrzałych i 10 młodocianych (niedojrzałych płciowo) samcach Rana esculenta L. Żaby łowiono w okresie odrętwienia zimowego (grudzień, styczeń), w ich naturalnym środowisku, gdy zimowały w wodzie o temperaturze wynoszącej około 4 C. W celu zbadania wpływu danego czynnika na metabolizm glutationu, dobierano płazy o podobnej długości ciała. Długość żab mierzono od początku pyska do otworu kloaki. W pracowni płazy dzielono na dwie grupy. Jedną grupę przetrzymywano w wiwarium przez okres 21 dni (Kaushik i Kaur 2003) w temperaturze 4 C (temperatura zbliżona do temperatury zimowiska), zaś drugą w temperaturze 14"C (Tanaka i inni 2004). Temperatury te utrzymywano w czasie trwania eksperymentu, aż do momentu uśpienia żab. 2.2. Narządy Przed pobraniem narządów płazy były usypiane przez podanie do worków limfatycznych Vetbutalu w dawce 35 mg/kg masy ciała. Żaby były usypiane zawsze między godziną 9 a 10 rano. Następnie w zależności od rodzaju eksperymentu preparowano mózg (M), wątrobę (W), nerki (N), serce (Se), skórę (Sk) oraz pobierano krew w celu uzyskania surowicy. Pobrane narządy dokładnie fragmentowano nożem młynkowym i płukano w oziębionym płynie fizjologicznym (0.6% roztworze NaCI) w celu usunięcia z nich krwi. Bezpośrednio po wypłukaniu krwi z narządów wykonywano oznaczenia. 2.3. Grupy badawcze Wpływ wieku na badane wskaźniki obserwowano w odniesieniu do niedojrzałych młodocianych (4.5-5.4 cm) i dojrzałych płciowo żab (7.5 21
8.5 cm), natomiast wpływ temperatury na osobnikach dojrzałych płciowo (7.5-8.5 cm), po ich 21-dniowym przetrzymywaniu w temperaturze 4'C lub 14'C. Tyle dni, zdaniem Rogers i wsp. (2004), wynosi okres pełnej adaptacji żab do zmienionej temperatury, objawiający się, między innymi, zmianami w aktywności enzymów metabolicznych. Wpływ insuliny (0.2 Ul/kg), estru monoetylowego glutationu (10 mg/ kg), allopurynolu (30 mg/kg), kwasu L-2-oksotiazolidyno-4-karboksylowego (OTC) (10 mg/kg), witaminy E (DL-a-tocopheryl acetate) (50 mg/kg), promieniowania UVA (6.2 mw/cm2 przez 70 i 140 minut) oraz etanolu (0.25 g/kg) badano u dojrzałych płciowo żab, przetrzymywanych w laboratorium przez 21 dni w temperaturze 4 C lub 14'C, po 6, 12 lub 24 godzinach od podania badanego związku lub soli fizjologicznej. Insulinę, ester monoetylowy glutationu, OTC i sól fizjologiczną wstrzykiwano do grzbietowych worków limfatycznych, natomiast allopurynol, witaminę E i etanol podawano bezpośrednio pipetą do żołądka. W celu zbadania wpływu UVA żaby naświetlano promieniowaniem o natężeniu 6.2 mw/cm2przez 70 i 140 minut lampą LF-215.L z filtrem FLF- 21 5L2 emitującą promieniowanie UVA o maksymalnej długości fali 365 nm. Natężenie promieniowania mierzono radiometrem UVX z sensorem UVA (Model UVX-36 UP). 2.4. Odczynniki Zestaw do oznaczania glukozy BIOCF1EMTEST EO, etanol (C2FH5OH), foaforan potasowy II zasadowy (K2FłP 04), kwas solny (HCI), sodowy fosforan I zasadowy (NaH2P 0 4), wersenian dwusodowy (C16H,40 8N2Na2. 2H20, EDTA), kwas trójchlorooctowy (C2HCI30 2), octan sodowy bezwodny (C2H80 2Na) pochodziły z firmy Polskie Odczynniki Chemiczne Gliw ice, natomiast insulina o przedłużonym działaniu Semilente z CEFARMU Warszawa. Batho-phenantroline disulfonic acid (C24H16N2O bs2), GSH (Ct2F121N30 6S), GSSG (C20FH32N6O 12S2), TRIS (C4Hn N 0 3), kwas 5,5-dwutio-dwu (2-nitrobenzoesowy (DTNB, C 14H8N20 8S2), NADPH, ester monoetylowy glutationu (C12H2N30 6S), allopurynol (C5H4N40 ), DL-a-tocopheryl acetate pochodziły z SIGMY, zaś akrylonitryl (FH2C=CHCN) i kwas L-2-oksotiazolidyno-4-karboksylowy (C4FH5N 0 3S, OTC) z Aldrich Chemical Company. 22
2.5. Oznaczanie GSH metodą Ellmana (1959) Odważano 100 mg skrawka badanego narządu i homogenizowano w homogenizatorze szklanym z tłokiem teflonowym, w 6 ml buforu fosforanowego 0.1 M o ph 7.4, zawierającym 10 mm EDTA. Homogenaty wirowano w wirówce MPW 263 w temperaturze 4'C przez 15 minut, przy 15 000 obr./min. Uzyskany supernatant odbiałczano dodając do niego 500 pi TCA oraz 500 pl EDTA. Mieszaninę tę wstawiano do lodówki na 10 minut przy temperaturze 4"C, a następnie wirowano przez 5 minut przy 5 000 obr./min. Oznaczenie przeprowadzano dodając próbki badanych supernatantów do mieszaniny zawierającej 3.2 M bufor TRIS-HCI o ph 8.1 i 10 mm EDTA. Następnie dodawano kwas 5.5-dwutio-dwu (2-nitrobenzoesowy) (DTNB) w 0.05 mm buforze octanowym o ph 5.0. Po upływie 10 minut odczytywano ekstynkcję na spektrofotometrze MARCEL S333 przy długości fali 412 nm w porównaniu do próby kontrolnej, którą stanowił roztwór zawierający 10% TCA, 10 mm EDTA i 0.1 M bufor fosforanowy o ph 7.4 w stosunku 1:1:1. DTNB reagując z grupami -SH dawał żółte zabarwienie pochodzące od powstającego kwasu nitrobenzoesowego (TNBA). Stężenia GSH wyrażano w pmol/g tkanki. 2.6. Oznaczanie GSH i GSSG metodą Matsumoto i wsp. (1996) Bezpośredn io po pobraniu fragmentów badanych organów o masie 100 mg homogenizowano je w temperaturze 4'C przez 1 minutę w 2 ml 0.1 M HCI zawierającego 1 mm BAPS (Batho-phenantroline disulfonic acid). Do homogenatu dodawano 170 pl 9.2 M kwasu nadchlorowego. Tak przygotowany homogenat wirowano przez 15 minut przy 17 000 obr./minutę w temperaturze 4'C. Uzyskany supernatant zobojętniano 2 ml 2 M K2H P 0 4 a następnie całość wirowano przez 15 minut przy 5 000 obr./min. Dla określenia ilości glutationu zredukowanego supernatant rozcieńczano 100-krotnie 125 mm fosforanem sodu o ph 7.5 zawierającym 6.3 mm EDTA. Do 50 pl rozcieńczonego supernatantu dodawano 1 ml mieszaniny zawierającej 0.21 pm NADPH, 0.6 pm DTNB, 125 pmol fosforanu sodu (ph 7.5) i 6.3 pm EDTA i mierzono ekstynkcję przy długości fali 412 nm. Dla określenia ilości GSSG dodawano do 20 pl akrylonitrylu (295 mm) 50 pl nie rozcieńczonego supernatantu i 125 pm fosforanu sodu (ph 8.0) zawierającego 6.3 pm EDTA do objętości 1 ml. Całość inkubowano w temperaturze 25'C przez 10 minut. Po inkubacji mierzono ekstynkcję przy dłu 23
gości fali 412 nm. W procedurze tej akrylonitryl blokował tiolowe grupy -SH. Stężenia GSH oraz GSSG wyrażano w pmol/g tkanki. 2.7. Oznaczanie glukozy Do probówki pipetowano 1 ml roztworu odbiałczającego (kwas nadchlorowy 0.66 M) i 100 pl surowicy. Mieszaninę tę wirowano przez 15 minut przy 3 000 obr/min. Tak uzyskany supernatant używano do oznaczeń stężenia glukozy. W tym celu do 0.05 ml supernatantu dodawano 2.5 ml roztworu roboczego dostarczanego wraz z zestawem do oznaczania glukozy BIOCHEMTEST EO (Polskie Odczynniki Chemiczne). Po wymieszaniu i pozostawieniu mieszaniny na 20 minut w temperaturze 25 C, mierzono absorbancję próby badanej względem próby odczynnikowej zawierającej 2.5 ml roztworu roboczego i 0.05 ml roztworu odbiałczającego, przy długości fali 670-680 nm w kuwecie o grubości d = 1 cm. Pomiary zawsze wykonywano po upływie 30 minut od momentu dodania roztworu roboczego. W metodzie tej wykorzystuje się fakt, że glukoza pod wpływem oksydazy glukozowej (EC 1.1.3.4) utlenia się do kwasu glukonowego z w y tworzeniem nadtlenku wodoru. Reakcja przebiega w obecności peroksydazy (EC 1.11.1.7) i chromogenu (sól sodowa kwasu 2, 2'-azyno-dwu-(3-etylo-benzotiazolino-6-sulfonowego). Natężenie powstałego zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia glukozy w badanej próbce. Koncentrację glukozy w badanej surowicy odczytywano ze sporządzonej krzywej kalibracyjnej. 2.8. Statystyczna analiza wyników Z uzyskanych danych wyliczono w poszczególnych grupach badawczych średnie arytmetyczne oraz odchylenia standardowe. W celu uzyskania odpowiedzi na pytanie czy zastosowane czynniki doświadczalne w istotny sposób wpłynęły na zmiany badanych parametrów w poszczególnych narządach zastosowano test t" Studenta (Winnicki, Wagner 1988). Istotność różnic podano na podstawie danych zawartych w komputerowym programie statystycznym Origin.
3. WYNIKI 3.1. Wpływ wieku na stężenie GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH W mózgu, wątrobie i w nerkach stwierdzono statystycznie istotny spadek stężenia GSH, z równoczesnym wzrostem stężenia GSSG oraz wzrostem wartości stosunku GSSG/GSH u osobników starszych (dojrzałych płciowo), w porównaniu z osobnikami młodocianymi (niedojrzałymi płciowo) (tab. 1). Tabela 1. Wpływ wieku na stężenie GSH, GSSG i wartość stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W) oraz nerkach (N) żab. Wartości istotnie wzrastają (f), maleją ( ) 14'C Narządy Młodociane-zdojrzałe Test t" GSH GSSG GSSG/GSH M 1 7.1412*** W i 9.3499*** N i 5.1721*** M T 5.2740*** W T 6 1738* * * N t 5.2741*** M T 6.3672*** W T 3.1546** N T 14.9431*** Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy Ml. przy p < 0.01 (**), p < 0.001 (***) Niezależnie od wieku największą ilość GSH stwierdzono w wątrobie, a najmniejszą w mózgu. GSSG u osobników młodocianych osiągnął najwyższe stężenie w wątrobie, a najmniejsze w nerkach. Inaczej u osobników dojrzałych płciowo, u których najwięcej GSSG wykazano w mózgu i - podobnie jak u osobników młodocianych - najmniej w nerkach. W wypadku stosunku GSSG/GSH u osobników młodocianych uzyskano podobne wartości w badanych organach. U osobników starszych najwyższe wartości tego stosunku stwierdzono w nerkach, a najmniejsze w wątrobie (rye. 1). 25
14 C 14 C 14 C Ryc. 7. Stężenie: a) GSH, b) GSSG, c) wartość stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) R. esculenta L w zależności od wieku. Ml. - osobniki młodociane (n = 10) o długości ciała 4.5-5.4 cm; D - osobniki dojrzałe (n = 10) o długości ciała 7.5-8.5 cm. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy Mł. przy p 0.01 (**), p < 0.001 (***) 26
3.2. Wpływ podwyższenia temperatury na stężenie GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH W mózgu, wątrobie i nerkach żab pochodzących z temperatury 14'C wykazano statystycznie istotny wzrost ilości GSH oraz statystycznie istotny spadek koncentracji GSSG, a także spadek wartości stosunku GSSG/GSH w porównaniu z płazami pochodzącymi z temperatury 4'C (tab. 2). Niezależnie od temperatury największe stężenie GSH stwierdzono w wątrobie, a najmniejsze w mózgu. W temperaturze 4'C największą koncentrację GSSG wykazano w wątrobie, a mniejszą w mózgu i nerkach. Natomiast w podwyższonej temperaturze największe stężenie GSSG zostało zanotowane w nerkach, a najmniejsze w wątrobie. Największa wartość stosunku GSSG/GSH została stwierdzona w nerkach (temp. 4'C), a najmniejsza w wątrobie (temp. 14'C) (ryc. 2). Tabela 2. Wpływ temperatury na stężenie GSH, GSSG i wartość stosunku GSSG/ GSH w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) żab. Wartości istotnie wzrastają ( ), maleją (J.) GSH GSSG GSSG/GSH Narządy 4'C -» 14'C Test t" M T 5.3573*** W t 7.8640*** N t 6.7096*** M i 2.3504* W i 5.1549*** N i 3.1038** M i 6.3927*** W i 5.3707*** N i 5.5605*** Różnica statystycznie istotna w stosunku do osobników z temperatury 4'C przy p < 0.05 (*), p 5 0.01 (**), p < 0.001 ( **), n = 10 27
4 C b GSSG/GSH GSSG pm/g c Ryc. 2. Stężenie: a) GSH, b) GSSG, c) wartość stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) R. escutenta L. w temperaturze 4 C lub 14 C. Różnica statystycznie istotna w stosunku do osobników z 4 C przy p < 0.05 (*), p < 0.001 (***), n = 10 28
3.3. Wpływ insuliny na stężenie glukozy, GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH Iniekcja insuliny nie wywołała istotnych zmian w ilości glukozy w surowicy krwi u osobników utrzymywanych w temperaturze 4 C (4.6805 mmol/l, ±0.1396) podobnie jak też w stężeniu GSH, GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH w mózgu, wątrobie i nerkach (tab. 3). Ryc. 3. Zawartość glukozy w surowicy krwi R. esculenta L. w temperaturze 4'C lub 14'C po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub insuliny (In) (0.2 Ul/kg) 6 h lub 12 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p < 0.05 (*), p 0.001 (***), n = 10 Statystycznie istotny spadek ilości glukozy stwierdzono po 6 (2.1012 mmol/l, ± 0.0734, t = 2.7518*) i 12 (2.8304 mmol/l, ±0.0800, t = 2.5632*) godzinach od iniekcji insuliny u żab utrzymywanych w temperaturze 14C (ryc. 3). W tej temperaturze po 6 i 12 godzinach od iniekcji insuliny spadkowi ilości glukozy towarzyszył statystycznie istotny wzrost stężenia GSH (ryc. 4) i równoczesny spadek ilości GSSG (ryc. 5) oraz wartości stosunku GSSG/GSH (ryc. 6) w badanych organach żab (tab. 3). 29
Tabela 3. Zmiany stężenia GSH, GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) żab po 6 i 12 godzinach od jednorazowej iniekcji insuliny (0.2 Ul/kg). Wartości istotnie wzrastają (t), maleją (4), pozostają bez zmian (-) Po iniekcji insuliny Organ 4'C 14 C Test t" GSH GSSG GSSG/GSH 6 h 12 h 6 h 12 h 6 h 12 h M - t 4.6722*** W - t 6.1478* N - t 8.8519*** M - t 3.4675** W - T 3.3426** N - t 3.5838** M - 4 3.7824** W - 4 5.1023*** N - 4 6.0235*** M - i 4.9273*** W - i 3.8522** N - i 4.8517*** M - i 12.9421*** W - 4 7.2541*** N - 4 3.0522* M - 4 9.1734*** W - 4 2.4517* N - 4 2.7984* * statystycznie istotne przy pś 0.005 (*), pś 0.01 (**) oraz p^ 0.001 (***), n = 10 30
c z a s p o in ie k c ji 4 C [ I S - 6h Ryc. 4. Stężenie CSH w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) R. esculenta L. w temperaturze: a) 4'C, b) 14'C po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub insuliny (In) (0.2 Ul/kg), 6 h lub 12 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p < 0.001 (***), n = 10 31
c z a s p o in ie k c ji 0,025 -, 0.020 - GSSG pm/g GSSG pm/g 0,015-0,010-0,005-0.000-0,014-0,012-0,010-0,008-0, 00 6-0,004-0,002-0,000 - Ryc. 5. Stężenie GSSG w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) R. esculenta L. w temperaturze: a) 4'C, b) 14'C po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub insuliny (In) (0.2 Ul/kg), 6 h lub 12 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p < 0.01 (**) oraz p < 0.001 (***), n = 10 32
c z a s p o in ie k c ji 4 C I I S-6h x co o CD co co CD M W N 14 C M W N Ryc. 6. Wartość stosunku CSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W) i nerkach (N) R. esculenta L. w temperaturze: a) 4'C, b) 14'C po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub insuliny (In) (0.2 Ul/kg), 6 h lub 12 h po iniekcji. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p < 0.05 (*) oraz p < 0. 001 (***), n = 10 33
3.4. Wpływ estru monoetylowego glutationu na stężenie GSH, GSSG oraz wartość stosunku GSSG/GSH Podanie estru monoetylowego glutationu płazom przetrzymywanym w temperaturze 4'C nie wywołało istotnych zmian w koncentracji GSH, GSSG oraz w wartości stosunku GSSG/GSH. Zmiany takie wykazano tylko u żab przetrzymywanych w temperaturze 14 C (tab. 4) w odniesieniu do niektórych przedziałów czasowych i niektórych organów. Tabela 4. Zmiany stężenia GSH, GSSG oraz wartości stosunku GSSG/GSH w mózgu (M), wątrobie (W), nerkach (N) i sercu (Se) żab po 6 lub 12 godzinach od jednorazowego podania estru monoetylowego glutationu (10 mg/kg). Wartości istotnie wzrastają (f), maleją ( ), pozostają bez zmian (-) GSH GSSG GSSG/GSH Po podaniu estru 6 h 12 h 6 h 12 h 6 h 12 h Organ 4'C 14'C Test t" M _ t 3.1522* W _ N _ t 2.7541* Se _ t 7.1182*** M _ t 5.1117*** W _ t 5.1312*** N 4-3.4817** Se _ t 9.8115*** M _ W _ N i 3.1681* Se _ _ M _ i 3.4276** W _ i 4.1122** N i 5.0112*** Se _ i 3.3428** M - W N 1 2.5873* Se _ i 9.1876*** M _ i 5.1341*** W _ i 4.8972*** N _ i 4.1122** Se - i 10.3542*** * statystycznie istotne przy p < 0.005 (*), p < 0.01 (*) oraz p^ 0.001 (***), n = 10 34
Niezależnie od temperatury, w której były przetrzymywane żaby, największą ilość CSH stwierdzono w wątrobie, a najmniejszą w sercu. Największe statystycznie potwierdzone zmiany w stężeniu GSH po podanym estrze zanotowano po 6 i 12 godzinach w sercu (ryc. 7). 1,61 1,4-1,2 - O ) 1,o - A 0,8 - X 0,6 - CO 0 0,4-0,2-0,0-14 C Ryc. 7. Stężenie GSH w mózgu (M), wątrobie (W), nerkach (N) i sercu (Se) R. esculenta L. w temperaturze: a) 4'C, b) 14'C po iniekcji płynu fizjologicznego (S) lub estru monoetylowego glutationu (E) (10 mg/kg), 6 h lub 12 h po podaniu. Różnica statystycznie istotna w stosunku do grupy S przy p ^ 0.05 (*), p < 0.01 (**), p < 0.001 (***), n = 10 35