PL 214675 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 214675 (21) Numer zgłoszenia: 364729 (22) Data zgłoszenia: 07.06.2000 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 07.06.2000, PCT/IT00/000230 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 14.12.2000, WO00/74712 (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 38/46 (2006.01) A61K 35/74 (2006.01) C12N 9/16 (2006.01) A61P 1/00 (2006.01) A61P 25/00 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (54) Kompozycja dietetyczna, odżywcza lub farmaceutyczna zawierająca sfingomielinazę zasadową i zastosowanie sfingomielinazy zasadowej (30) Pierwszeństwo: 09.06.1999, IT, RM99A000376 (73) Uprawniony z patentu: ACTIAL FARMACEUTICA, LDA., Funchal, PT (43) Zgłoszenie ogłoszono: 13.12.2004 BUP 25/04 (72) Twórca(y) wynalazku: CLAUDIO DE SIMONE, Ardea, IT (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.09.2013 WUP 09/13 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska
2 PL 214 675 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest dietetyczna, odżywcza lub farmaceutyczna kompozycja zawierająca sfingomielinazę zasadową pochodzenia bakteryjnego oraz zastosowanie sfingomielinazy zasadowej pochodzenia bakteryjnego. Prezentowany wynalazek odnosi się do zastosowania sfingomielinazy zasadowej do wytwarzania kompozycji przeznaczonych do zastosowania odżywczego, dietetycznego lub ściśle leczniczego, oraz kompozycji wytworzonych w ten sposób. W rezultacie, kompozycje mogą mieć postać i działanie dodatków do żywności, baz dietetycznych lub odpowiednich preparatów leczniczych, w zależności od tego czy są przewidziane jako bazy lub preparaty profilaktyczne lub preparaty terapeutyczne dla pacjentów, dla których powyższe kompozycje są przeznaczone. Dotychczas zidentyfikowano trzy, różne, rodzaje sfingomielinazy (SMazy). Istnieje sfingomielinaza kwasowa, która jest enzymem lizosomalnym (z optimum ph wynoszącym 4,5-5), której niedobór powoduje chorobę Niemanna-Picka, istnieje także sfingomielinaza obojętna, z optimum ph wynoszącym 7,5, dla której opisano dwie izoformy. Jedna z tych izoform zlokalizowana jest w błonie cytoplazmatycznej i jest zależna od magnezu, podczas gdy druga zlokalizowana jest w cytozolu i jest niezależna od kationów. Zarówno sfingomielinaza kwasowa jak i obojętna występuje w wielu tkankach oraz komórkach będąc tym samym wszechobecnym enzymem regulującym wiele funkcji komórkowych. Trzeci typ jest nazywany sfingomielinazą zasadową, ponieważ jest on główne aktywny w ph 9. Jest on niezależny od magnezu i występuje zarówno w jelitowych brzeżkach szczoteczkowych, jak i w żółci. Sfingomielinaza zasadowa nie występuje w żołądku, dwunastnicy lub trzustce, ale występuje w jelicie, głównie w dystalnej części jelita czczego. Znaczną aktywność sfingomielinazy zasadowej zaobserwowano także w okrężnicy i odbytnicy. Wysoki poziom sfingomielinazy zasadowej zaobserwowano także w żółci, ale wydaje się to być charakterystyczne dla ludzi. Te dwojakie źródła sfingomielinazy czynią ludzi bardzo sprawnymi w porównaniu z innymi organizmami pod względem hydrolizy sfingomielin (SM) wprowadzanych wraz z dietą. Dotychczas sądzono, że sfingomielinaza zasadowa nie może być produkowana przez bakterie jelitowe, ponieważ nie stwierdzono różnic pomiędzy zwykłymi i wolnymi od zarazków zwierzętami (zobacz R.D. Duan, Scand. J. Gastroenterology, 33 (1998), str. 673-683). Oprócz sfingomielinazy zasadowej, która występuje w jelitach i w żółci, nie jest znana obecnie żadna inna sfingomielinaza zasadowa, która mogłaby być zastosowana do produkcji kompozycji przeznaczonych do zastosowania odżywczego, dietetycznego lub ściśle leczniczego. Co więcej, sfingomielinazy kwasowa oraz obojętna nie mogą być zastosowane ze względu na ich inne właściwości (zobacz poniższą tabelę). T a b e l a Smaza kwasowa Smaza obojętna Smaza zasadowa Lokalizacja Lizosomy Błona cytoplazmatyczna Jelita ludzkie oraz żółć Optymalne ph 5,5 7,4 9 Zależność od Mg 2+ Nie Tak Nie Oporność na trypsynę Nie Nie Tak Stabilność cieplna 40 C - 50-60 C Substrat Wewnątrzkom. SM SM błona SM w żywności Znane jest obecnie zastosowanie sfingomielinazy do celów kosmetycznych oraz dermatologicznych. Japoński Patent nr 63 216, 813 opisuje kompozycje kosmetyczne, które zawierają sfingomielinazę i są przeznaczone do przeciwdziałania fizjologicznemu spadkowi poziomu tego enzymu, który pojawia się w skórze wraz ze starzeniem, oraz do sprzyjania jej transformacji do ceramidu, który z kolei wykazuje dobroczynny wpływ nawilżający na naskórek. Międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT WO 98/22,082 opisuje zastosowanie sfingomielinazy do wytwarzania kompozycji dermatologicznych odpowiednich do leczenia zaburzeń skóry,
PL 214 675 B1 3 takich jak zapalenie skóry, łuszczyca, rybia łuska oraz podobne stany. Co więcej, powyższe zgłoszenie patentowe PCT opisuje wytwarzanie sfingomielinazy ze szczepów bakterii Gram-ujemnych, Gramdodatnich oraz bakterii kwasu mlekowego, opisując widoczne zalety nad innymi metodami, w których jako surowców używa się organów wyższych zwierząt, takich jak mózg czy wątroba. Nieoczekiwanie stwierdzono ostatnio, że niektóre bakterie posiadają wysoki poziom sfingomielinazy zasadowej, a ich spożycie może być dobroczynne dla gospodarza. Bakterie mogą być spożywane, jako bakterie żywe lub w formie ekstraktów, pod warunkiem, że są one czynne enzymatycznie, możliwie w skojarzeniu z innymi bakteriami, takimi jak bakterie kwasu mlekowego, wraz z SM i/lub z pożywieniem zawierającym SM. Jednym z celi niniejszego wynalazku jest dostarczenie dietetycznej, odżywczej lub farmaceutycznej kompozycji, która zawiera sfingomielinazę zasadową w ilości wystarczającej do wywołania dietetycznych, odżywczych lub leczniczych skutków u osób tego potrzebujących. Przedmiotem wynalazku jest dietetyczna, odżywcza lub farmaceutyczna kompozycja, charakteryzująca się tym, że zawiera sfingomielinazę zasadową pochodzenia bakteryjnego, gdzie bakterie zawierające sfingomielinazę zasadową są wybrane spośród bakterii Gram-dodatnich, bakterii Gramujemnych oraz bakterii kwasu mlekowego lub ich mieszanin, w ilości wystarczającej do wywołania dietetycznego, odżywczego lub terapeutycznego skutku u osobnika tego potrzebującego. Korzystnie kompozycja według wynalazku jest odpowiednia do profilaktyki i/lub leczenia zaburzeń związanych z rozwojem jelit, procesami nowotworowymi, zaburzeniami odpowiedzi immunologicznej, stanami zapalnymi oraz procesami apoptozy jelit oraz struktur z nimi związanych, zaburzeń związanych z syntezą cholesterolu, zaburzeń związanych z hydrofobową naturą powierzchni przewodu pokarmowego, zaburzeń alergicznych układu pokarmowego, zaburzeń związanych z procesem trawienia, chorób zapalnych jelit, polipowatości, w szczególności polipowatości rodzinnej, hipercholesterolemii, infekcji Helicobacter pylori, zaburzeń wzrostu niemowląt, zaburzeń związanych z homeostazą jelitową oraz chorób centralnego i obwodowego układu nerwowego. Korzystnie kompozycja według wynalazku jest odpowiednia do zastosowania w dietach pediatrycznych. Korzystnie kompozycja według wynalazku jest odpowiednia do żywienia enteralnego. Korzystnie kompozycja według wynalazku jest podawana w skojarzeniu z mlekiem sztucznym, mlekiem zagęszczonym, mlekiem sojowym, mlekiem w proszku, mlekiem częściowo humanizowanym oraz ogólnie żywnością dla dzieci. Korzystnie w kompozycji według wynalazku bakterie kwasu mlekowego są wybrane z grupy zawierającej: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus minutus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium eriksonii, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium plantarum, Bifidobacterium peudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, Streptococcus lactis, Streptococcus raffinolactis oraz Streptococcus thermophilus. Korzystniej w kompozycji według wynalazku zastosowanym szczepem jest Lactobacillus brevis CD2, zdeponowany 6 lutego, 1998 pod numerem dostępu DSM 11,988, w Niemieckiej Kolekcji Drobnoustrojów i Hodowli Komórkowych (DSM) (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) w Braunschweig, Niemcy, zgodnie z Traktatem budapeszteńskim, lub jego mutanty lub pochodne. Korzystnie w kompozycji według wynalazku bakterie kwasu mlekowego są stosowane, jako bakterie żywe, liofilizowane lub sonikowane. Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera na gram kompozycji od 1 x 10 2 do 1 x 10 13 CFU bakterii kwasu mlekowego. Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera 200 x 10 9 Streptococcus thermophilus, 150 x 10 9 Bifidobacteria oraz 4 x 10 9 Lactobacillus acidophilus na gram kompozycji. Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera ponadto kwasy żółciowe, w szczególności kwas ursodeoksycholowy, pektynę, sfingomielinę lub jej składniki, leki lub żywność zawierającą sfingomieliny, deiminazę argininy, kwasy tłuszczowe, wielonienasycone kwasy tłuszczowe, cukry niefermentujące, w szczególności laktulozę, inhibitory cholesterolu, inhibitory ceramidazy, inhibitory
4 PL 214 675 B1 proteazy, immunomodulatory, czynniki antyrakowe, witaminy, czynniki wzrostu, czynniki powierzchniowo czynne, płatki zbożowe, włókna, czynniki emulgujące, stabilizatory, tłuszcze, antyutleniacze, konserwanty, środki zobojętniające wolne rodniki i/lub związki chroniące naczynia. Korzystnie kompozycja według wynalazku może być podawana doustnie jako dodatek do żywności. Korzystnie kompozycja według wynalazku może być podawana doustnie lub pozajelitowo, jako lek. Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie sfingomielinazy zasadowej pochodzenia bakteryjnego, gdzie bakterie zawierające sfingomielinazę zasadową są wybrane spośród bakterii Gram- -dodatnich, bakterii Gram-ujemnych oraz bakterii kwasu mlekowego lub ich mieszanin, do wytwarzania dietetycznej, odżywczej lub farmaceutycznej kompozycji odpowiedniej do profilaktyki i/lub leczenia zaburzeń związanych z rozwojem jelit, procesami nowotworowymi, zaburzeniami odpowiedzi immunologicznej, stanami zapalnymi oraz procesami apoptozy jelit oraz struktur z nimi związanych, zaburzeń związanych z syntezą cholesterolu, zaburzeń związanych z hydrofobową naturą powierzchni przewodu pokarmowego, zaburzeń alergicznych układu pokarmowego, zaburzeń związanych z procesem trawienia, chorób zapalnych jelit, polipowatości, w szczególności polipowatości rodzinnej, hipercholesterolemii, infekcji Helicobacter pylori, zaburzeń wzrostu niemowląt, zaburzeń związanych z homeostazą jelitową oraz chorób centralnego i obwodowego układu nerwowego. Korzystnie jest stosowane w dietach pediatrycznych. Korzystnie jest stosowane w żywieniu enteralnym. Korzystnie kompozycja jest podawana w skojarzeniu z mlekiem sztucznym, mlekiem zagęszczonym, mlekiem sojowym, mlekiem w proszku, mlekiem częściowo humanizowanym oraz ogólnie żywnością dla dzieci. Korzystnie bakterie kwasu mlekowego są wybrane z grupy zawierającej: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus minutus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium eriksonii, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium plantarum, Bifidobacterium peudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, Streptococcus lactis, Streptococcus raffinolactis oraz Streptococcus thermophilus. Korzystnie stosuje się szczep Lactobacillus brevis CD2, zdeponowany 6 lutego, 1998 pod numerem dostępu DSM 11,988, w Niemieckiej Kolekcji Drobnoustrojów i Hodowli Komórkowych (DSM) (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) w Braunschweig, Niemcy, zgodnie z Traktatem budapeszteńskim, lub jego mutanty lub pochodne. Korzystnie stosuje się bakterie kwasu mlekowego jako bakterie żywe, liofilizowane lub son i- kowane. Korzystnie na gram kompozycji stosuje się od 1 x 10 2 do 1 x 10 13 CFU bakterii kwasu mlekowego. Korzystnie stosuje się 200 x 10 9 Streptococcus thermophilus, 150 x 10 9 Bifidobacteria oraz 4 x 10 9 Lactobacillus acidophilus na gram kompozycji. W szczególności, kompozycja ta jest odpowiednia do profilaktyki i/lub leczenia zaburzeń związanych z jelitami, procesami nowotworowymi, zaburzeniami odpowiedzi immunologicznej, stanami zapalnymi oraz procesami apoptozy jelit oraz struktur z nimi związanych, zaburzeń związanych z syntezą cholesterolu, zaburzeń związanych z hydrofobową naturą powierzchni przewodu pokarmowego, zaburzeń alergicznych układu pokarmowego, zaburzeń związanych z procesem trawienia, chorób zapalnych jelit, polipowatości, w szczególności polipowatości rodzinnej, hipercholesterolemii, infekcji Helicobacter pylori, zaburzeń wzrostu niemowląt, zaburzeń związanych homeostazą jelitową oraz chorób centralnego i obwodowego układu nerwowego. Kompozycja jest także użyteczna do zastosowania w dietach pediatrycznych i/lub w żywieniu enteralnym. W diecie pediatrycznej kompozycja może być podana, np., w skojarzeniu z mlekiem sztucznym, mlekiem zagęszczonym, mlekiem sojowym, mlekiem w proszku, mlekiem częściowo humanizowanym lub ogólnie żywnością dla dzieci. Kompozycja zawiera zasadową sfingomielinazę pochodzenia bakteryjnego, a bakterie zawierające sfingomielinazę zasadową są wybrane spośród bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych oraz bakterii kwasu mlekowego, oraz z ich mieszanin.
PL 214 675 B1 5 Co więcej sfingomielinazę zasadową kompozycji uzyskuje się z bakterii kwasu mlekowego, które są wybrane spośród: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus minutus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium eriksonii, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium plantarum, Bifidobacterium peudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, Streptococcus lactis, Streptococcus raffinolactis oraz Streptococcus thermophilus. Szczególnie korzystnym szczepem spośród tych szczepów bakterii jest Lactobacillus brevis CD2, zdeponowany 6 lutego, 1998 pod numerem dostępu DSM 11, 988 w German Collection of Microorganisms i Cell Cultures (DSM) w Braunschweig, Germany (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) zgodnie z Traktatem budapeszteńskim, lub jego mutanty lub pochodne. Zgodnie z korzystnym wykonaniem wynalazku, bakterie kwasu mlekowego są stosowane jako bakterie żywe, liofilizowane lub sonikowane. Kompozycja korzystnie zawiera od 1 x 10 2 do 1 x 10 13 CFU bakterii kwasu mlekowego na gram kompozycji. Szczególnie korzystna kompozycja zawiera 200 x 10 9 Streptococcus thermophilus, 150 x 10 9 Bifidobacteria oraz 4 x 10 9 Lactobacillus acidophilus na gram kompozycji. Kompozycja według wynalazku może także zawierać kwasy żółciowe, w szczególności kwas ursodeoksycholowy, pektynę, sfingomielinę lub jej składniki, leki lub żywność zawierające sfingomieliny, deaminazę argininy, kwasy tłuszczowe, wielonienasycone kwasy tłuszczowe, cukry niefermentujące, w szczególności laktulozę, inhibitory cholesterolu, inhibitory ceramidazy, inhibitory proteazy, immunomodulatory, czynniki antyrakowe, witaminy, czynniki wzrostu, czynniki powierzchniowo czynne, płatki zbożowe, włókna, czynniki emulgujące, stabilizatory, tłuszcze, antyutleniacze, konserwanty, środki zobojętniające wolne rodniki i/lub związki chroniące naczynia. Kompozycja według wynalazku może być podawana doustnie jako dodatek do żywności albo doustnie lub pozajelitowo jako lek. Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie sfingomielinazy zasadowej do wytwarzania dietetycznej, odżywczej lub farmaceutycznej kompozycji odpowiedniej do profilaktyki i/lub leczenia zaburzeń związanych z jelitami, procesami nowotworowymi, zaburzeniami odpowiedzi immunologicznej, stanami zapalnymi oraz procesami apoptozy jelit oraz struktur z nimi związanych, zaburzeń związanych syntezą cholesterolu, zaburzeń związanych z hydrofobową naturą powierzchni przewodu pokarmowego, zaburzeń alergicznych układu pokarmowego, zaburzeń związanych z procesem trawienia, chorób zapalnych jelit, polipowatości, w szczególności polipowatości rodzinnej, hipercholesterolemii, infekcji Helicobacter pylori, zaburzeń wzrostu niemowląt, zaburzeń związanych homeostazą jelitową oraz chorób centralnego i obwodowego układu nerwowego. Kompozycja jest także użyteczna w przypadku diet pediatrycznych i/lub w żywieniu enteralnym. W dietach pediatrycznych kompozycja może być podawana, np., w skojarzeniu z mlekiem sztucznym, mlekiem zagęszczonym, mlekiem sojowym, mlekiem w proszku, mlekiem częściowo humanizowanym lub ogólnie żywnością dla dzieci. Zastosowana sfingomielinaza zasadowa jest pochodzenia bakteryjnego, a bakterie zawierające sfingomielinazę zasadową są wybrane spośród bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych oraz bakterii kwasu mlekowego, oraz z ich mieszanin. Co więcej sfingomielinazę zasadową kompozycji uzyskuje się z bakterii kwasu mlekowego, które są wybrane z grupy: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus minutus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium eriksonii, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium plantarum, Bifidobacterium peudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, Streptococcus lactis, Streptococcus raffinolactis oraz Streptococcus thermophilus.
6 PL 214 675 B1 Szczególnie korzystnym szczepem spośród tych szczepów bakterii jest Lactobacillus brevis CD2, zdeponowany 6 lutego, 1998 pod numerem dostępu DSM 11, 988 w German Collection of Microorganisms i Cell Cultures (DSM) w Braunschweig, Germany (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) zgodnie z Traktatem budapeszteńskim, lub jego mutanty lub pochodne. Zgodnie z korzystnym wykonaniem wynalazku bakterie kwasu mlekowego są stosowane w kompozycji, jako bakterie żywe, liofilizowane lub sonikowane. Zastosowana kompozycja korzystnie zawiera od 1 x 10 2 do 1 x 10 13 CFU bakterii kwasu mlekowego na gram kompozycji. Szczególnie korzystna kompozycja zawiera 200 x 10 9 Streptococcus thermophilus, 150 x 10 9 Bifidobacteria oraz 4 x 10 9 Lactobacillus acidophilus na gram kompozycji. Następujące doświadczenia przeprowadzono w celu potwierdzenia obecności oraz skuteczności sfingomielinazy zasadowej w bakteriach według niniejszego wynalazku. Doświadczenia dotyczyły wykrywania sfingomielinazy zasadowej, enzymu odpowiedzialnego za tworzenie ceramidów w ludzkiej skórze. Metody Test sfingomielinaz kwasowych, obojętnych oraz zasadowych w bakteriach kwasu mlekowego oraz materiale z biopsji jelit 10 mg liofilizowanych bakterii Streptococcus thermophilus rozpuszczono w 500 μl buforu zawierającego 50 mm Tris-HCl, ph 7,4, 10 mm MgCl 2, 2 mm EDTA, 5 mm DTT, 0,1 mm Na 3 VO 4, 0,1 mm Na 2 MoO 4, 30 mm p-nitrofenylo fosforanu, 10 mm β-glicerofosforanu, 750 mm ATP, 1 μμ PMSF, 10 μμ leupeptyny, 10 μμ peptastatyny (z Sigma Chemical Co.) oraz 0,2% Triton X-100 (w celu przetestowania aktywności SMazy obojętnej) lub 500 μl 0,2% Triton X-100 (w celu przetestowania aktywności SMazy kwasowej). Aby przetestować SMazę zasadową, bakterie oraz (zhomegenizowany) materiał z biopsji jelit rozpuszczono w 0,25 M buforze sacharozowym zawierającym 5 mm MgCl 2, 0,15 M KCl, 50 mm KH 2 PO 4, 1 mm PMSF oraz 1 mm benzamidynę (ph 7,4). Próbki przygotowane w ten sposób poddano następnie lizie przez sonikację (przez 30 minut, podczas których, 10 sekundowe okresy włączony przerywano 10 sekundowymi okresami wyłączony ) przy użyciu sonikatora Vibracell (Sonic and Materials Inc., Danbury, CT). Poddane sonikacji próbki następnie odwirowano przez 30 minut przy 14 000 obr/min w temp. 4 C, następnie usunięto supernatant, a stężenie białka określono za pomocą zestawu Bio-Rad Labolatories, (Richmond, CA). Aby określić obojętną SMazę, 100 g próbki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37 C w buforze (końcowa objętość: 50 μl) zawierającym 50 mm Tris-HCl, 1 mm MgCl 2, ph 7,4 oraz 2,25 μl [N-metylo- 14 C]-sfingomieliny (SM) (0,2 μci/mι, aktywność specyficzna: 56,6 mci/mmol, Amersham). Aby określić aktywność sfingomielinazy kwasowej, 100 μg lizatu bakteryjnego inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37 C w buforze (końcowa objętość: 50 μl) zawierającym 250 mm octanu sodu, 1 mm EDTA, ph 5,0, oraz 2,25 μl [N-metylo- 14 C]-SM. Aby przetestować SMazę zasadową, próbki dodano do 375 25 μl buforu Tris-EDTA (ph 9) do końcowej objętości 0,4 ml, zawierającego 50 mm Tris, 0,15 M NaCl, 2 mm EDTA oraz mieszaninę 3 mm soli żółciowych z TC:TDC:GC:GCDC w stosunku molowym 3:2:1,8:1. Mieszanina tych soli żółciowych wywierała największy skutek stymulujący na SMazę zasadową. Dodatek EDTA do buforu służył inhibicji aktywności obojętnej SMazy, która jest zależna od Mg ++ z optimum ph 7,5. 14 C-SM rozpuszczono w etanolu, wysuszono pod azotem i zawieszono w buforze testowym, zawierającym mieszaninę 3% Triton X-100 oraz 3 mm soli żółciowych. Reakcję zakończono przez dodanie 2 ml mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku 2:1. Fosfolipidy ekstrahowano i analizowano na płytkach TLC, podczas gdy hydroliza SM była liczona z użyciem autoradiografii oraz licznika z ciekłym scyntylatorem. SMaza obecna w sonikowanych bakteriach oraz materiale z biopsji jelit została wyrażona w pmol SM zhydrolizowanej na godzinę na miligram białka. Aktywność SMazy ze Streptococcus thermophilus Figura 1 pokazuje poziom aktywności sfingomielinazy w sonikowanych bakteriach kwasu mlekowego. Nie zaobserwowano aktywności SMazy kwasowej, ale zaobserwowano znaczny poziom zarówno SMazy obojętnej jaki i zasadowej w próbkach bakteryjnych testowanych w warunkach doświadczalnych (różne wartości ph z oraz bez MgCl 2 ).
PL 214 675 B1 7 Zasadowa SMaza obecna w materiale z biopsji jelit Figura 2 pokazuje, że analiza aktywności SMazy w materiale z biopsji jelit wykazuje wysoką aktywność SMazy zasadowej typu zależnego od soli żółciowych, której nie można było wykryć w nieobecności soli żółciowych. Poziomy aktywności enzymatycznych SMazy zasadowej w tkankach pacjenta cierpiącego na chorobę Crohna były niższe niż w próbce kontrolnej. Wpływ Streptococcus thermophilus na jelitową SMazę zasadową Jak pokazano na figurze 3, test aktywności SMazy w próbkach Streptocpcus thermophilus, w warunkach doświadczalnych użytych do określenia poziomu jelitowej SMazy, wykazał, iż enzym bakteryjny nie był zmieniony przez obecność lub brak soli żółciowych. Co więcej, gdy testowano aktywność bakteryjnej oraz jelitowej Smaży, to jednocześnie addytywnie wzrosła hydroliza SM. Podobne rezultaty (niepokazane) uzyskano ze szczepem Lactobacillus brevis CD2, zdeponowanym 6 lutego, 1998 pod numerem dostępu DSM 11, 988 w German Collection of Microorganisms i Cell Cultures (DSM) w Braunschweig, Germany (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) zgodnie z Traktatem budapeszteńskim, lub jego mutantami lub pochodnymi. Zastrzeżenia patentowe 1. Dietetyczna, odżywcza lub farmaceutyczna kompozycja, znamienna tym, że zawiera sfingomielinazę zasadową pochodzenia bakteryjnego, gdzie bakterie zawierające sfingomielinazę zasadową są wybrane spośród bakterii Gram-dodatnich, bakterii Gram-ujemnych oraz bakterii kwasu mlekowego lub ich mieszanin, w ilości wystarczającej do wywołania dietetycznego, odżywczego lub terapeutycznego skutku u osobnika tego potrzebującego. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jest odpowiednia do profilaktyki i/lub leczenia zaburzeń związanych z rozwojem jelit, procesami nowotworowymi, zaburzeniami odpowiedzi immunologicznej, stanami zapalnymi oraz procesami apoptozy jelit oraz struktur z nimi związanych, zaburzeń związanych z syntezą cholesterolu, zaburzeń związanych z hydrofobową naturą powierzchni przewodu pokarmowego, zaburzeń alergicznych układu pokarmowego, zaburzeń związanych z procesem trawienia, chorób zapalnych jelit, polipowatości, w szczególności polipowatości rodzinnej, hipercholesterolemii, infekcji Helicobacter pylori, zaburzeń wzrostu niemowląt, zaburzeń związanych z homeostazą jelitową oraz chorób centralnego i obwodowego układu nerwowego. 3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że jest odpowiednia do zastosowania w dietach pediatrycznych. 4. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że jest odpowiednia do żywienia enteralnego. 5. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że jest podawana w skojarzeniu z mlekiem sztucznym, mlekiem zagęszczonym, mlekiem sojowym, mlekiem w proszku, mlekiem częściowo humanizowanym oraz ogólnie żywnością dla dzieci. 6. Kompozycja według zastrz. jednego z zastrz. 1 do 5, znamienna tym, że bakterie kwasu mlekowego są wybrane z grupy zawierającej: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus minutus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium eriksonii, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium plantarum, Bifidobacterium peudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, Streptococcus lactis, Streptococcus raffinolactis oraz Streptococcus thermophilus. 7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że zastosowanym szczepem jest Lactobacillus brevis CD2, zdeponowany 6 lutego, 1998 pod numerem dostępu DSM 11,988, w Niemieckiej Kolekcji Drobnoustrojów i Hodowli Komórkowych (DSM) (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) w Braunschweig, Niemcy, zgodnie z Traktatem budapeszteńskim, lub jego mutanty lub pochodne. 8. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 7, znamienna tym, że bakterie kwasu mlekowego są stosowane, jako bakterie żywe, liofilizowane lub sonikowane.
8 PL 214 675 B1 9. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 8, znamienna tym, że zawiera na gram kompozycji od 1 x 10 2 do 1 x 10 13 CFU bakterii kwasu mlekowego. 10. Kompozycja według jednego z zastrz. 6 do 8, znamienna tym, że zawiera 200 x 10 9 Streptococcus thermophilus, 150 x 10 9 Bifidobacteria oraz 4 x 10 9 Lactobacillus acidophilus na gram kompozycji. 11. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 10, znamienna tym, że zawiera ponadto kwasy żółciowe, w szczególności kwas ursodeoksycholowy, pektynę, sfingomielinę lub jej składniki, leki lub żywność zawierającą sfingomieliny, deiminazę argininy, kwasy tłuszczowe, wielonienasycone kwasy tłuszczowe, cukry niefermentujące, w szczególności laktulozę, inhibitory cholesterolu, inhibitory ceramidazy, inhibitory proteazy, immunomodulatory, czynniki antyrakowe, witaminy, czynniki wzrostu, czynniki powierzchniowo czynne, płatki zbożowe, włókna, czynniki emulgujące, stabilizatory, tłuszcze, antyutleniacze, konserwanty, środki zobojętniające wolne rodniki i/lub związki chroniące naczynia. 12. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 11, znamienna tym, że może być podawana doustnie, jako dodatek do żywności. 13. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 12, znamienna tym, że może być podawana doustnie lub pozajelitowo jako lek. 14. Zastosowanie sfingomielinazy zasadowej pochodzenia bakteryjnego, gdzie bakterie zawierające zasadową sfingomielinazę są wybrane spośród bakterii Gram-dodatnich, bakterii Gram-ujemnych oraz bakterii kwasu mlekowego lub ich mieszanin, do wytwarzania dietetycznej, odżywczej lub farmaceutycznej kompozycji odpowiedniej do profilaktyki i/lub leczenia zaburzeń związanych z rozwojem jelit, procesami nowotworowymi, zaburzeniami odpowiedzi immunologicznej, stanami zapalnymi oraz procesami apoptozy jelit oraz struktur z nimi związanych, zaburzeń związanych z syntezą cholesterolu, zaburzeń związanych z hydrofobową naturą powierzchni przewodu pokarmowego, zaburzeń alergicznych układu pokarmowego, zaburzeń związanych z procesem trawienia, chorób zapalnych jelit, polipowatości, w szczególności polipowatości rodzinnej, hipercholesterolemii, infekcji Helicobacter pylori, zaburzeń wzrostu niemowląt, zaburzeń związanych z homeostazą jelitową oraz chorób centralnego i obwodowego układu nerwowego. 15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że jest stosowane w dietach pediatrycznych. 16. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że jest stosowane w żywieniu enteralnym. 17. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że kompozycja jest podawana w skojarzeniu z mlekiem sztucznym, mlekiem zagęszczonym, mlekiem sojowym, mlekiem w proszku, mlekiem częściowo humanizowanym oraz ogólnie żywnością dla dzieci. 18. Zastosowanie według jednego z zastrz. 14 do 17, znamienne tym, że bakterie kwasu mlekowego są wybrane z grupy zawierającej: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus minutus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium eriksonii, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium plantarum, Bifidobacterium peudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, Streptococcus lactis, Streptococcus raffinolactis oraz Streptococcus thermophilus. 19. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że stosuje się szczep Lactobacillus brevis CD2, zdeponowany 6 lutego, 1998 pod numerem dostępu DSM 11,988, w Niemieckiej Kolekcji Drobnoustrojów i Hodowli Komórkowych (DSM) (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) w Braunschweig, Niemcy, zgodnie z Traktatem budapeszteńskim, lub jego mutanty lub pochodne. 20. Zastosowanie według jednego z zastrz. 14 do 19, znamienne tym, że bakterie kwasu mlekowego stosuje się jako bakterie żywe, liofilizowane lub sonikowane. 21. Zastosowanie według jednego z zastrz. 14 do 19, znamienne tym, że na gram kompozycji stosuje się od 1 x 10 2 do 1 x 10 13 CFU bakterii kwasu mlekowego. 22. Zastosowanie według jednego z zastrz. 14 do 19, znamienne tym, że stosuje się 200 x 10 9 Streptococcus thermophilus, 150 x 10 9 Bifidobacteria oraz 4 x 10 9 Lactobacillus acidophilus na gram kompozycji.
PL 214 675 B1 9 Rysunki
10 PL 214 675 B1
PL 214 675 B1 11
12 PL 214 675 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)