ZASTOSOWANIA SPEKTROMETRII MAS W CHEMII ORGANICZNEJ I BIOCHEMII WYKŁAD II JONIZACJA CHEMICZNA (CI), JONIZACJA POLEM (FI) I DESORPCJA POLEM (FD), SPEKTROMETRIA JONÓW WTÓRNYCH (FAB, LSIMS)
W jaki sposób można otrzymać jony w warunkach wysokiej próżni? 1. Przeprowadzenie substancji obojętnej z jej naturalnego stanu skupienia pod ciśnieniem atmosferycznym do warunków wysokiej próżni, a następnie jonizacja. 2. Przeprowadzenie jonów z układu pod ciśnieniem atmosferycznym (roztwór, ciało stałe) do warunków wysokiej próżni.
Metody jonizacji substancji obojętnej w warunkach wysokiej próżni Jonizacja substancji w fazie gazowej: Jonizacja elektronowa (EI Electron Ionization) Jonizacja polem (FI Field Ionization) Jonizacja w wyniku reakcji z innymi jonami, czyli jonizacja chemiczna (CI Chemical Ionization)
Metody jonizacji substancji obojętnej w warunkach wysokiej próżni Jonizacja substancji, która w warunkach wysokiej próżni znajduje się w fazie ciekłej lub stałej: Bombardowanie szybkimi atomami lub jonami (FAB Fast Atom Bombardment lub LSIMS Liquid matrix Secondary Ions Mass Spectrometry) Jonizacja laserowa (MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) Bezpośrednia jonizacja chemiczna (DCI Direct Chemical Ionization) Desorpcja polem (FD Field Desorption)
Kwasowość i zasadowość w fazie gazowej Powinowactwo do protonu cząsteczki obojętnej B + H + BH + PA(B) = H Powinowactwo do protonu anionu A - + H + AH PA(A - ) = H PA = Proton Affinity Kwasowość w roztworze HA + H 2 O A - + H 3 O + K a = [A - ][H 3 O + ]/[HA] pk a = - log(k a )
Kwasowość w roztworze i w fazie gazowej Tam, gdzie różnice energii solwatacji są duże, kwasowości w roztworze i w fazie gazowej mogą różnić się zasadniczo. Klasycznym przykładem jest szereg alkoholi alifatycznych: W roztworze: MeOH > EtOH > iproh > t-buoh pk a 15,5 16 17,1 18 W fazie gazowej: t-buoh > iproh > EtOH > MeOH PA(A - ) 1567 1570 1582 1596 kj/mol Orientacyjne przeliczenie: jednostka pk a = 5,7 kj/mol
JONIZACJA CHEMICZNA (CI)
Źródło jonów do EI i CI doprowadzenie gazu reagującego miejsce wprowadzania próbki (prostopadle do płaszczyzny rysunku) elektroda odpychająca katoda + obudowa komory jonizacyjnej (U A = 8000 V) magnes N S - magnes - soczewki ogniskujące elektroda przyspieszająca (U = 0 V) szczelina wejściowa wiązka jonów (do analizatora) E = zeu A Czas przebywania próbki w źródle jonów: ok. 10-6 s
Źródło jonów w spektrometrze AMD 604
Jonizacja chemiczna z wykorzystaniem metanu e CH - 4 CH + 4 + e - EI niskie CH + 4 CH + 3 + H ciśnienie Ułamek molowy I I CH 4 + CH 5 + C 2 H 5 + CH + 4 + CH 4 CH + 5 + CH 3 CI wysokie CH 3+ + CH 4 C 2 H + 5 + H 2 ciśnienie CH 4 + CH 5 + C 2 H 5 + CH 3 + Ciśnienie P P = 10-5 Torr P = 1 Torr C 3 H 5 +
Reakcje tworzenia kationów w źródle CI Wymiana protonu Wymiana ładunku M + XH + MH + + X M + X + M + + X Addycja elektrofilowa M + X + MX + Oderwanie anionu AB + X + A + + BX Utworzone w ten sposób kationy mogą ulegać dalszym reakcjom
Powinowactwo do protonu cząsteczek obojętnych B + H + BH + Zasada sprzężona (B) PA(B) = H Kation (BH + ) PA(B) [kj/mol] H 2 H + 3 423 CH 4 CH + 5 536 C 2 H 6 C 2 H + 7 585 H 2 O CH 3 OH H 3 O + CH 3 OH 2 + 712 762 CH 3 CN CH 3 CNH + 782 (CH 3 ) 2 C=CH 2 (CH 3 ) 3 C + 810 NH 3 NH + 4 847 CH 3 NH 2 CH 3 NH + 3 884 NH 2 (CH 2 ) 2 NH 2 NH 2 (CH 2 ) 2 NH + 3 936 Zdolność do protonowania
Wykorzystanie wartości powinowactwa do protonu Porównanie jonizacji chemicznej octanu etylu z wykorzystaniem CH 4 i NH 3 CH 3 COOEt + CH 5+ [CH 3 COOEt + H + ] + + CH 4 H r =? CH 4 + H + CH 5+ H 1 = -PA(CH 4 ) = -536 kj/mol CH 3 COOEt + H + [CH 3 COOEt + H + ] + H 2 = - PA(EtOAc) = -836 kj/mol H r = H 2 H 1 = PA(CH 4 ) PA(EtOAc) = -300 kj/mol CH 3 COOEt + NH 4+ [CH 3 COOEt + H + ] + + NH 3 H r =? NH 3 + H + NH 4+ H 1 = -PA(NH 3 ) = -847 kj/mol CH 3 COOEt + H + [CH 3 COOEt + H + ] + H 2 = - PA(EtOAc) = -836 kj/mol H r = H 2 H 1 = PA(NH 3 ) PA(EtOAc) = 11 kj/mol Zasada sprzężona (B) H 2 423 CH 4 536 C 2 H 6 585 H 2 O CH 3 OH PA(B) [kj/mol] 712 762 CH 3 CN 782 (CH 3 ) 2 C=CH 2 NH 3 810 CH 3 NH 2 847 884 NH 2 (CH 2 ) 2 NH 2 936 Średnia energia dysocjacji wiązania: C CO 354 kj/mol, O CO 420 kj/mol, C Br 302 kj/mol, C I 241 kj/mol
Zależność stopnia fragmentacji od rodzaju reagenta w CI HO N O CH3 M = 241 Zasada sprzężona (B) H 2 O CH 3 OH PA(B) [kj/mol] H 2 423 CH 4 536 C 2 H 6 585 712 762 CH 3 CN 782 (CH 3 ) 2 C=CH 2 NH 3 810 CH 3 NH 2 847 884 NH 2 (CH 2 ) 2 NH 2 936
Widma CI (CH 4 ) chlorku benzylu i p-chlorotoluenu CH 2 Cl CH 3 [M + H] + Cl [M + C 2 H 5 ] +
Widmo bezpośredniej jonizacji chemicznej (DCI)
Widma EI i CI n-dekanolu (M = 158) [M OH] + EI C 10 H 21 + [M H] + CI (CH 4 ) [M H] + CI (i-c 4 H 10 ) [C 9 H 19 CH=OH] +
Powstawanie jonów o m/z 141 i 157 w widmie CI n-dekanolu Powstawanie jonu o m/z 141 C 9 H 19 CH 2 OH + CH 5+ C 9 H 19 CH 2 OH 2+ + CH 4 C 9 H 19 CH 2 OH 2 + C 9 H 19 CH 2+ + H 2 O Powstawanie jonu o m/z 157 C 9 H 19 CH 2 OH + CH 5+ C 9 H 19 CH=OH + + CH 4 + H 2
Widma CI (H 3 + ) nitroanilin
Energia rekombinacji X + + e - X RE(X + ) = H Kationorodnik (X + ) He + He 24.6 Ar + Ar 15.8 N + 2 N 2 15.3 CO + CO 14.0 CO 2 + CO 2 Związek (X) RE(X + ) [ev] 13.8 CS + 2 CS 2 ~10 NO + NO 9.3 Wzrost zdolności do pobierania elektronu przez kationorodnik C 6 H 6 + C 6 H 6 9.2 1eV 96 kj/mol 23 kcal/mol
Kombinowane widmo CI z przeniesieniem protonu i przeniesieniem ładunku Układ Ar H 2 O H 3 O + przeniesienie protonu: powstaje jon M+H + Ar + przeniesienie ładunku: powstaje jon M +, który ulega fragmentacji
Mechanizmy tworzenia anionów w warunkach CI A. WYCHWYT ELEKTRONU Asocjacyjny wychwyt elektronu AB + e - AB - Dysocjacyjny wychwyt elektronu AB + e - A - + B Tworzenie par jonowych AB + e - A - + B + + e - B. REAKCJE JONOWO-CZĄSTECZKOWE Przeniesienie protonu MH + X - M - + HX Wymiana ładunku M + X - M - + X Addycja nukleofilowa M + X - MX - Podstawienie nukleofilowe AB + X - BX + A -
Powinowactwo do protonu anionów A - + H + HA PA(A - ) = H Anion (A - ) Kwas sprzężony (HA) PA(A - ) [kj/mol] NH - 2 NH 3 1689 H - H 2 1676 OH - H 2 O 1636 O - HO 1595 CH 3 O - CH 3 OH 1583 (CH 3 ) 2 CHO - (CH 3 ) 2 CHOH 1565 CH 2 CN - CH 3 CN 1556 F - HF 1554 Zasadowość C 5 H 5 - C 5 H 6 1480 O - 2 HO 2 1465 CN - HCN 1462 Cl - HCl 1395 p-no 2 -Ph-CHCN - p-no 2 -Ph-CH 2 CN 1378
Najważniejsze reagenty dla NCI N 2 O N 2 O + e - N 2 + O - PA(A - ) = 1595 kj/mol N 2 O i CH 4 N 2 O + e - N 2 + O - O - + CH 4 HO - + CH 3 PA(A - ) = 1636 kj/mol CH 3 ONO CH 3 ONO + e - CH 3 O - + NO PA(A - ) = 1583 kj/mol CH 2 Cl 2 CH 2 Cl 2 + e - Cl - + CH 2 Cl PA(A - ) = 1395 kj/mol
Widma PCI (CH 5 + ) i NCI (OH - ) fenyloalaniny NCI PCI
Widmo bezpośredniej NCI glikozydu
Widmo bezpośredniej NCI glukozy (Cl - ) [M + Cl] -
JONIZACJA POLEM (FI) DESORPCJA POLEM (FD)
Źródło jonów do jonizacji polem (FI) i desorpcji polem (FD) Powiększenie aktywowanego emitera do FI/FD
Źródło jonów do jonizacji polem (FI) Spektrometr GCT firmy Micromass
Widma EI i FI stearynianu metylu O M = 298 O
Widma EI, CI (NH 3 ) i FI kaprylanu butylu O M = 200 O FI CI EI
Widma EI, FI I FD kwasu glutaminowego EI FI FD
Widma FD peptydu przy różnych natężeniach prądu emitera
SPEKTROMETRIA JONÓW WTÓRNYCH: FAB i LSIMS
Źródło jonów do LSIMS + wiązka jonów Cs + (wiązka pierwotna) o energii 10 30keV działo cezowe soczewki ogniskujące wiązka jonów wtórnych (do analizatora) komora jonizacyjna roztwór próbki w matrycy stal kwasoodporna lub miedź sonda końcówka sondy w powiększeniu
Sonda do LSIMS
Matryce stosowane w technikach FAB i LSIMS Nazwa Skrót Wzór Masa Gliceryna GLY HOCH 2 -CH(OH)-CH 2 OH 92 Tiogliceryna TGL HOCH 2 -CH(OH)-CH 2 SH 108 Ditioerytrytol/ditiotreitol DTE/DTT HSCH 2 -CH(OH)-CH(OH)-CH 2 SH 154 Alkohol NBA 153 m-nitrobenzylowy O 2 N OH Eter o-nitrofenylowo-noktylowy NPOE O C8 H 17 NO 2 251 Dietanoloamina DEA (HO-CH 2 CH 2 -) 2 NH 105 Trietanoloamina TEA (HO-CH 2 CH 2 -) 3 N 149 Glikol polietylenowy PEG HO-(-CH 2 CH 2 -O-) n -H 44 n + 18 (n = 4 8)
Widma LSIMS (+) I (-) gliceryny M = 92 93 185 LSIMS (+) 183 LSIMS ( ) 277 369 461 553 645 91 275 367 459 551 737 829 643 735 827 Jony n M + H + Jony n M H -
Widmo SIMS CsI (M = 260) Jony n M + Cs +
Porównanie widm EI i LSIMS Intensity (%age) Intensity (%age) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 81 95 105 125 140 152 162 179 192 205 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 Low Resolution M/z 84 93 97 108 120 124 136 137 152 154 166 176 179 221 221 243 257 259 P O Ph M = 256 M + H + 273 279 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 Low Resolution M/z 289 Cl 291
Widma LSIMS (+) i (-) peptydu (M = 1188) 1189 [M + H] + 1187 [M H] -
Widmo LSIMS insuliny 2868.0 1912.4 200 pmol insuliny w 2 µl NBA 5733.6
Klastery w widmach LSIMS M + H + 2M + H + M + Na + 3M + H + M + NBA + H + 2M + Na + 3M + Na +