Laboratorium 4 Określenie aktywności katalitycznej enzymu. Wprowadzenie do metod analitycznych. Prowadzący: dr inż. Karolina Labus 1. CZĘŚĆ TEORETYCZNA Enzymy to wielkocząsteczkowe, w większości białkowe, katalizatory przyspieszające specyficzne reakcje chemiczne poprzez obniżenie ich energii aktywacji. Większość reakcji enzymatycznych przebiega miliony razy szybciej niż ich niekatalizowane enzymatycznie odpowiedniki. Jak wszystkie katalizatory, również enzymy nie zużywają się w trakcie przebiegu reakcji, a także nie wpływają na ich równowagę. Niemniej jednak znacznie różnią się od zwykłych katalizatorów, ponieważ charakteryzują się zwykle dużą specyficznością pod względem katalizowanej reakcji, jak również konwertowanych substratów (tzw. specyficzność substratowa). Za wysoką specyficzność odpowiada kształt cząsteczki enzymu dopasowany do substratów geometrycznie, ale także pod względem oddziaływań hydrofobowo-hydrofilowych oraz elektrostatycznych. Enzymy wykazują także wysoki poziom stereospecyficzności, regioselektywności i chemoselektywności. Od wielu lat obserwowany jest ciągły wzrost zainteresowania efektywnym wykorzystaniem reakcji enzymatycznych, zarówno w przemyśle spożywczym, chemicznym, farmaceutycznym, jak również w medycynie i ochronie środowiska. Z głównych zalet wykorzystania biokatalizy, jako alternatywy do konwencjonalnych procesów chemicznych, należy wymienić m. in. wielokrotny wzrost szybkości reakcji katalizowanych przez enzymy, ich wysoką specyficzność substratową, regio- i stereoelektywność, jak również możliwość prowadzenia procesów w szerokim zakresie stężeń substratów oraz w łagodnych wartościach ph i temperatury. W reakcjach biotransformacji najczęściej wykorzystuje się preparaty enzymatyczne będące mieszaninami różnych białek i substancji balastowych. Izolacja enzymu w postaci homogenicznej (czystej) z materiału biologicznego wiąże się z dużym nakładem pracy i wysokimi kosztami. Dlatego też ilość enzymu w preparacie określa się najczęściej na podstawie szybkości reakcji, którą katalizuje, a nie poprzez jego masę. W określonych warunkach szybkość ta jest proporcjonalna do stężenia enzymu i można przedstawić ją w jednostkach definiowanych jako taką ilość enzymu, która wywołuje określoną szybkość reakcji (zwykle określoną przez ubytek substratu lub pojawienie się produktu). Ważnym punktem w określaniu aktywności enzymów jest wybór odpowiedniej metody analitycznej. Do większości katalizowanych enzymatycznie reakcji można zastosować bezpośredni pomiar zmian stężeń produktów lub substratów stosując klasyczne metody chemii analitycznej, 1
czyli analizę miareczkową, kolorymetrię, spektrofotometrię, chromatografię, ale także metody fizyczne, np. pomiary lepkości, zmętnienia, polarymetrię. Jednak niektóre enzymy wymagają pośredniej metody oznaczenia aktywności, najczęściej przez dodanie reagentów, które nie są substratami dla enzymu, a są niezbędne do wizualizacji efektu reakcji. Podziału metod można dokonać również na podstawie ilości punktów pomiarowych. Mówi się wtedy o metodach statycznych i kinetycznych: metoda statyczna np. dwupunktowa - zakłada porównanie ilości substratu i produktu w 2 punktach czasowych - w czasie zero i po zakończeniu inkubacji. Wymaga ona zapewniania odpowiednich warunków reakcji tak, aby jej szybkość była stała przez cały czas inkubacji. metoda kinetyczna zakłada pomiar stężenia substratu lub produktu w jednostce czasu najczęściej w początkowym etapie procesu przeprowadza się pomiar ciągły zmian stężenia wybranego składnika w krótkich odstępach czasu. Jednostki aktywności enzymów konwencjonalne ustalane przez autorów metod jednostka aktywności enzymatycznej (katal = kat) jest to taka ilość enzymu, która przekształca 1 mol substratu w czasie 1 sekundy międzynarodowa standardowa jednostka aktywności enzymu (U lub IU) jest to taka ilość enzymu, która przekształca 1 µmol substratu (lub 1 µmol odpowiednich grup chemicznych) w ciągu 1 minuty, w danej temperaturze i w optymalnych warunkach (szczególnie ph i stężenia substratu) 1 kat = 6 10 7 U 1 U = 16,67 10-9 kat = 16,67 nkat w przypadku takich substratów jak białko, wielocukier lub inna substancja, w której więcej niż jedno wiązanie ulega reakcji określenie 1 µmol substratu zastępuje się wyrażeniem 1 µmol odpowiednich grup miarą szybkości tej reakcji jest liczba rozłożonych wiązań peptydowych czy glikozydowych, a nie liczba całkowicie zhydrolizowanych cząsteczek aktywność enzymów w płynach biologicznych wyraża się w ilości jednostek standardowych (U) na objętość zastosowanego enzymu wyrażoną w ml. Do najczęściej stosowanych metod pomiaru aktywności enzymów należy spektrofotometria UV-VIS, której głównymi zaletami są: duża czułość, precyzja oraz selektywność oznaczeń. Analiza ilościowa tą metodą polega na pomiarze absorbancji A badanego roztworu przy określonej długości fali przy równoczesnym wykorzystaniu prawa Lambera-Beera. Jest to drugie z trzech praw absorpcji, które zostało sformułowane w następujący sposób: 2
Jeżeli współczynnik absorpcji rozpuszczalnika jest równy zeru to absorbancja (A) wiązki promieniowania monochormatycznego przechodzącego przez jednorodny roztwór jest wprost proporcjonalna do stężenia roztworu C i do grubości warstwy absorbującej l., A = ε*c*l gdzie: ε molowy współczynnik absorpcji przy określonej długości fali [mol/(dm 3 *cm)] C stężenie [mol/dm 3 ] l grubość warstwy [cm] Metodą spektrofotometrii UV-VIS można oznaczać: Bezbarwne związki organiczne i nieorganiczne, w których występują wiązania π lub elektrony n pochodzące od wolnych par elektronowych (węglowodory aromatyczne, aldehydy, ketony, kwasy i aminy oraz pierwiastki ziem rzadkich, ozon, SO 2 ) Barwne związki organiczne i barwne sole metali (KMnO 4, CuSO 4 ) Substancje, których formy absorbujące promieniowanie uzyskuje się na drodze przemian chemicznych (np. w reakcjach kompleksowania metali z ligandami organicznymi) Do kartkówki obowiązuje materiał umieszczony w instrukcji (zarówno część teoretyczna i praktyczna). 2. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA 2.1. Pomiar aktywności katalitycznej enzymu pośrednią metodą spektrofotometryczną W pomiarach aktywności enzymu (β-galaktozydazy) wykorzystywany będzie test analityczny na glukozę, która jest jednym z produktów reakcji katalizowanej przez ten enzym (Rys. 1) galactose glucose Rys. 1. Hydroliza laktozy do glukozy i galaktozy katalizowana przez β-galaktozydazę. 3
Zasada tej metody analitycznej jest następująca: glukoza pod wpływem oksydazy glukozowej (zawartej w Odczynniku I) utlenia się do kwasu glukonowego z wytworzeniem nadtlenku wodoru. Ten ostatni reaguje w obecności peroksydazy z kwasem hydroksybenzoesowym (HBA) i 4-aminoantypiryną (AAP) tworząc czerwony barwnik chinonoiminę, którego intensywność zabarwienia mierzona na spektrofotometrze przy długości fali 500 nm jest wprost proporcjonalna do stężenia glukozy w badanej próbce. Odczynnik I: (składniki aktywne: oksydaza glukozowa, peroksydaza, AAP, HBA, bufor fosforanowy). Sposób wykonania testu analitycznego na zawartość glukozy: Z odpowiednio rozcieńczonej próbki pobrać 10 µl do 1 ml Odczynnika I (Glukoza OXY DST, Alpha Diagnostics), inkubować przez 5 min w 37 C, a następnie mierzyć absorbancję przy długości fali 500 nm. Przed rozpoczęciem pomiarów spektrofotometr należy wyzerować na 1 ml Odczynnika I. Etapy wykonania doświadczenia: I wyznaczenie krzywej standardowej na glukozę Przygotować roztwory glukozy o zadanym stężeniu (0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 i 4.0 g/l) w 0,1M buforze fosforanowym o ph 7.0 Dla wszystkich przygotowanych stężeń glukozy w dwóch powtórzeniach wykonać test analityczny na obecność glukozy zgodnie z powyższą procedurą: Do 1 ml odczynnika I dodać 10 µl próbki o znanym stężeniu glukozy Inkubować dokładnie 5 min w 37 C Po upływie tego czasu zmierzyć abosrbancję przy 500 nm 4
Na podstawie uzyskanych wyników sporządzić wykres C GLUKOZY =f(abs500) z uwzględnieniem punktu (0,0). II pomiar aktywności katalitycznej enzymu (β-galaktozydazy) W 0,1M buforze fosforanowym o ph 7.0 przygotować roztwór substratu (laktozy) o stężeniu 50 g/l Następnie do termostatowanego reaktora (40 C) wprowadzić 20 ml roztworu substratu i inkubować przez około 10 min. W międzyczasie przygotować statyw z 20 probówkami i dodać do nich po 1 ml Odczynnika I (różowego). Po upływie tego czasu do reaktora dodać 2 ml roztworu enzymu o zadanym stężeniu (przygotowany przez prowadzącego zajęcia) i włączyć stoper. Przez 20 min co 2 minuty pobierać próbkę z reaktora (10 µl), którą od razu należy umieścić w 1 ml odczynnika różowego i wstawić dokładnie na 5 min do łaźni wodnej (37 C), a następnie na spektrofotometrze zmierzyć absorbancję przy 500 nm. Aparat wyzerować na 1 ml Odczynnika I. Pomiar aktywności wykonać dla trzech różnych stężeń enzymu. 2.2. Opracowanie wyników Na podstawie wyników absorbancji dla różnych stężeń glukozy sporządzić wykres zależności C GLUKOZA = f(abs500). Wyznaczyć równanie krzywej wzorcowej (z uwzględnieniem punktu [0,0]), które w dalszej kolejności posłuży do oznaczania ilości glukozy powstałej w wyniku reakcji enzymatycznej Wyniki absorbancji (500 nm) uzyskane dla próbek pobieranych z reaktora podczas reakcji enzymatycznej przeliczyć z krzywej wzorcowej na stężenie glukozy [g/l], a następnie sporządzić wykres zależności C GLUKOZA = f(t). Na jego podstawie wyznaczyć szybkość powstawania glukozy w czasie i uzyskane wartości wyrazić w przyjętych dla enzymów jednostkach aktywności [U] oraz [kat] Na jednym wykresie zależności C GLUKOZA = f(t) umieścić wyniki uzyskane dla trzech różnych stężeń badanego enzymu. 5