JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

TOM 6 NUMER 3 CZERWIEC 2008 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY PRACA ORYGINALNA Diagnostyka raka płuca z wykorzystaniem zestawu markerów biologicznych w surowicy Edward F. Patz, Jr, Michael J. Campa, Elizabeth B. Gottlin, Irina Kusmartseva, Xiang Rong Guan i James E. Herndon II Departments of Radiology, Biostatistics and Bioinformatics, and Pharmacology and Cancer Biology, Duke University Medical Center, Durham, NC. Otrzymano 16 lipca 2007; zaakceptowano 12 września 2007. Oświadczenia autorów na temat potencjalnych konfliktów interesów oraz wkładu poszczególnych autorów zamieszczono na końcu artykułu. Prośby o przedruki należy adresować: Edward F. Patz Jr, MD, Department of Radiology, Duke University Medical Center, Box 3808, Durham, NC 27710; e-mail: patz2000@mc.duke.edu. 2007 by American Society of Clinical Oncology 0732-183X/07/2535-5578/$20.00 DOI: 10.1200/JCO.2007.13.5392 S T R E S Z C Z E N I E Cel Obecnie nie ma testu wykorzystującego surowice krwi, który mógłby być wykorzystany w diagnostyce raka płuca. Niezwykle przydatne byłyby markery biologiczne, które pozwoliłyby na podjęcie decyzji klinicznych. Bazując na wynikach badań proteomicznych i przeglądu piśmiennictwa wytypowaliśmy markery obecne w surowicy krwi, które mogłyby znaleźć zastosowanie w diagnostyce raka płuca. Metody Początkowo zbadano sześć białek w 100 surowicach krwi stanowiących zbiór uczący (50 surowic od chorych na nowo rozpoznanego raka płuca i 50 od zdrowych dawców dobranych pod względem płci i wieku). Cztery z tych markerów wykryto z wykorzystaniem metod proteomiki, a dwa pozostałe znane były już wcześniej jako związane z nowotworami. Na podstawie analizy przy użyciu drzewa klasyfikacyjno-regresyjnego (Classification and Regression Tree, CART) wybrano zestaw czterech markerów, które najlepiej identyfikowały chorych na raka płuca. Dokładność klasyfikacji chorych na raka płuca za pomocą oznaczania tych czterech markerów określono za pomocą niezależnej, zaślepionej grupy 97 surowic (49 od chorych na raka płuca i 48 odpowiednio dobranych kontroli). Wyniki Jednoczesne oznaczenia czterech białek w surowicy, tj. antygenu karcynoembrionalnego (CEA), białka wiążącego retynol, antytrypsyny R1 i antygenu raka płaskonabłonkowego, prawidłowo klasyfikowały większość chorych na raka płuca i osób zdrowych w zbiorze uczącym (czułość: 89,3%; swoistość: 84,7%), jak również w niezależnym zbiorze testującym (czułość: 77,8%; swoistość: 75,4%). Godne zauważenia jest to, że 90% surowic charakteryzujących się ekspresją markerów zgodną z którymkolwiek z trzech wzorów określonych w analizie CART pochodziło od chorych na raka płuca. Wniosek Badanie panelu czterech powyższych markerów może być wartościową metodą służącą rozpoznaniu raka płuca. Metoda ta może być użyteczna w rozpoznaniu chorych ze zmianami w płucach nieokreślonego pochodzenia, a także może być wykorzystana do identyfikacji chorych o wysokim ryzyku raka płuca. J Clin Oncol 25:5578 5583. 2007 przez Amerykańskie Towarzystwo Onkologii Klinicznej WSTĘP Rak płuca pozostaje nadal istotnym problemem zdrowia publicznego na całym świecie. Pomimo że postęp w nieinwazyjnym obrazowaniu zwiększył możliwość wykrywania raka płuca, 75% pacjentów jest diagnozowanych w stadium zaawansowanym, kiedy możliwości leczenia są ograniczone. 1 Jednak nawet ci chorzy, u których rozpoznano raka płuca w I stopniu zaawansowania, mają najwyżej 60% prawdopodobieństwo 5-letniego przeżycia, co oznacza, że u dużej części z tych chorych już wówczas występują klinicznie niewykrywalne przerzuty. 1 Dane te przemawiają za koniecznością poszukiwania nowych sposobów wczesnego wykrywania i dokładniejszego określania stopnia zaawansowania raka na poziomie molekularnym. Niedawno zaproponowano zastosowanie w badaniach przesiewowych niskodawkowej spiralnej tomografii komputerowej do wczesnego wykrywania raka płuca. 2 Jednak pomimo wysokiej czułości tej metody jej swoistość jest niska. W jednym z badań u 70% chorych wykryto węzły pozytywne, podczas gdy jedynie 4% badanych miało raka płuca. 2 Z powodu podejrzenia raka płuca wszyscy chorzy o węzłach chłonnych podejrzanych z niewiadomej przyczyny muszą być dalej monitorowani w celu oceny wzrostu obserwowanych zmian. Takie zastosowanie technik obrazowych jest niewy- 177

Patz i wsp. starczające, gdyż skutkuje opóźnieniem prawidłowej diagnozy. Jednocześnie aż do 30% zmian usuwanych z powodu podejrzenia raka płuca okazuje się zmianami łagodnymi. Koszty tego typu postępowania są zbyt wysokie. 3-5 Wykrycie markerów biologicznych, które pozwoliłyby na identyfikację chorych o wysokim ryzyku raka płuca i które pozwalałyby wskazać chorych na raka płuca wśród pacjentów o podejrzanych węzłach chłonnych, polepszyłoby diagnostykę raka płuca. Takie badanie z wykorzystaniem biomarkerów uzupełniłoby badania obrazowe i pozwoliłoby na osiągnięcie większych korzyści klinicznych. Przedstawione w tej pracy badanie zostało podjęte jako pierwszy krok w celu wykrycia nowego panelu biomarkerów. Po wstępnej fazie badania wyodrębniliśmy cztery markery i, biorąc za cel użycie tych markerów w leczeniu chorych z podejrzeniem raka płuca, oceniliśmy ich przydatność w różnicowaniu chorych na raka płuca od osób wolnych od tej choroby. METODY Wybór białek W celu identyfikacji białek, które ulegają różnej ekspresji u chorych na raka płuca i u odpowiadających im wiekiem i płcią osób wolnych od raka płuca, zastosowano dwie odmienne metody: dwukierunkową, różnicującą elektroforezę na żelu (2D- DIGE) oraz spektrometrię masową z jonizacją laserem wspomaganą matrycą i analizatorem czasu przepływu jonów (MA- LDI-TOF MS). Protokół badania został zaakceptowany przez lokalną komisję bioetyczną. Wszyscy badani wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu. W analizie 2D-DIGE porównywano białka surowicy od 10 chorych ze świeżo rozpoznanym niedrobnokomórkowym rakiem płuca (non-small-cell lung cancer, NSCLC) i od 10 osób wolnych od tej choroby (wyniki zamieszczono w załączniku dostępnym tylko on-line). Pozwoliła ona wybrać cztery białka (transferynę, łańcuch S fibrynogenu, białko wiążące retinol [retinol binding protein, RBP] i haptoglobinę), których poziom w badanych grupach różnił się co najmniej 1,5-krotnie (P # 0,05, Załącznik, Tabela A1). Fibrynogen S został wyłączony z dalszej analizy, ponieważ bierze udział w procesach koagulacji i jest białkiem ostrej fazy, jego stężenie w surowicy może więc zmieniać się niezależnie od zachorowania na raka płuca. 6 Przed zastosowaniem spektrometrii masowej MALDI-TOF surowice niezależnej grupy 18 chorych i grupy 18 zdrowych osób zostały poddane ogniskowaniu izoelektrycznemu w fazie płynnej za pomocą aparatu Rotofor Cell (Bio-Rad, Hercules, CA), który dzieli każdą próbkę na 20 frakcji. Każda z tych frakcji była następnie analizowana za pomocą spektrometrii masowej MALDI-TOF. Jak przedstawiono w Załączniku (dostępny jedynie on-line), obrazy spektrofotometryczne każdej z 20 frakcji wszystkich próbek łączono i uzyskiwano 36 złożonych obrazów widma. 7 Porównanie obrazów widma próbek surowic od chorych na NSCLC i surowic kontrolnych wykazało szczyt przy stosunku masy do ładunku wynoszącym 50 430, który różnił się w surowicach od osób chorych na NSCLC i kontrolnych. Następnie po częściowym oczyszczeniu, dwukierunkowej elektroforezie i za pomocą MALDI-TOF oraz tandemowej spektrometrii masowej zidentyfikowano białko tego szczytu: antytrypsynę R1 (AAT). Wykazano związek AAT zarówno z wykrywaniem, jak i etiologią raka płuca. 8,9 Do panelu markerów biologicznych włączono także dwa dobrze znane markery nowotworowe: antygen karcynoembrionalny (CEA) oraz antygen raka płaskonabłonkowego (SCCA). Choć w licznych badaniach wykazano przydatność oznaczeń każdego z tych markerów w diagnostyce i monitorowaniu leczenia chorych na raka płuca przy jednoczesnym oznaczaniu innych markerów i/lub danych klinicznych, żaden z tych markerów pojedynczo nie ma znaczenia diagnostycznego. 10,11 Materiał badawczy Wszystkie surowice pochodziły z uniwersyteckiego banku surowic podlegającego kontroli komisji etyki. Wszystkie próbki surowic były pozyskiwane, przetwarzane i przechowywane w podobny sposób. Wybrano surowice pobierane w momencie rozpoznania raka płuca od 99 kolejnych, wcześniej nieleczonych chorych z nowo rozpoznanym rakiem płuca, oraz surowice od 98 osób wolnych od raka płuca, dobranych pod względem wieku i płci, zgłaszających się do klinik uniwersyteckich w tym samym okresie z innych powodów. Charakterystykę badanych grup przedstawiono w Tabeli 1. Po 50 surowic z grupy badanej i kontrolnej wykorzystano do stworzenia modelu, który następnie testowano na niezależnym, zaślepionym zbiorze testującym składającym się z 49 surowic od chorych na raka płuca i 48 od chorych z grupy kontrolnej. Dla wszystkich chorych, od których uzyskano surowice dla potrzeb tego badania, dostępne były dane kliniczne, m.in. informacje dotyczące przebytych chorób, stosowanego leczenia, stopnia zaawansowania w momencie rozpoznania, histologii i wyników leczenia. Pomiary markerów biologicznych Stężenia wszystkich badanych markerów biologicznych (tj. transferyny, RBP, haptoglobiny, AAT, CEA i SCCA) oznaczano we wszystkich surowicach ze zbioru uczącego i testującego za pomocą komercyjnych testów ELISA przeprowadzanych według instrukcji producentów (Tabela 2 w Załączniku dostępnym jedynie on-line). Dla każdego z markerów biologicznych pomiary dla zbioru uczącego były przeprowadzane w tym samym czasie; również dla zaślepionego zbioru testującego pomiary dla każdego z markerów były dokonywane w tym samym czasie. Analiza danych W celu klasyfikacji surowic do grupy pochodzącej od chorych na raka płuca lub grupy osób wolnych od tej choroby, na podstawie stężeń badanego panelu markerów biologicznych, dane ze zbioru uczącego analizowano za pomocą techniki drzew klasyfikacyjno-regresyjnych (Classification and Regression Tree, CART). 12,13 W programie komputerowym CART (wersja 6.0; Salford Systems, San Diego, CA) zastosowano algorytm podziału Giniego z 10-krotną walidacją krzyżową, który preferuje równe podziały i nie dopuszcza podziałów węzłów z pięcioma lub mniej obserwacjami. Model CART zbudowano na podstawie oznaczeń stężeń badanych markerów w surowicach pobranych w momencie rozpoznania od 50 kolejnych, uprzednio nieleczonych chorych na raka płuca, oraz od 50 osób wolnych od raka płuca, dobranych pod względem wieku i płci. Tych 100 próbek stanowiło zbiór uczący. W tym modelu każdą próbkę przypisano do węzła końcowego drzewa klasyfikacyjnego o określonym prawdopodobieństwie występowania raka płuca u osoby, od której pobrano próbkę surowicy. Utworzone w ten sposób drzewo klasyfikacyjne testowano, bez znajomości informacji o prawdziwym rozpoznaniu, na niezależnym zbiorze testującym zawierającym dane dotyczące badanych markerów biologicznych oznaczonych u 97 osób, w tym u 49 chorych na nowo rozpo- 178 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

Diagnostyka raka płuca z wykorzystaniem zestawu markerów biologicznych w surowicy Dane demograficzne Tabela 1. Charakterystyka badanych grup chorych Rak płuca (n = 50) Zbiór uczący Kontrola (n = 50) Liczba Rak płuca (n = 49) Zbiór testujący Kontrola (n = 48) Wiek, lata 68,5 S 9,7 63,33 S 16,76 67,16 S 11,26 56,04 S 15,11 Zakres 47-91 23-93 34-91 24-87 Płeć Mężczyźni 29 28 27 23 Kobiety 21 22 22 25 Stopień I 20 16 II 2 3 III 15 19 IV 13 11 Rozpoznanie histopatologiczne Gruczolakorak 16 22 Rak gruczołowo-płaskonabłonkowy 1 0 Rak oskrzelikowo-pęcherzykowy 0 4 Rak płaskonabłonkowy 13 9 Rak wielkokomórkowy 1 0 Rak drobnokomórkowy 0 4 Rak niedrobnokomórkowy, niesklasyfikowany 19 10 znanego raka płuca i u 48 osób z grupy kontrolnej, dopasowanych pod względem wieku i płci. Na podstawie wyników oznaczeń markerów biologicznych każda próbka została niezależnie przypisana określonemu węzłowi końcowemu drzewa, któremu odpowiadało określone, ustalone na podstawie analizy danych ze zbioru uczącego, prawdopodobieństwo występowania raka płuca u osoby, od której pobrano próbkę surowicy. Gdy wszystkie próbki ze zbioru testującego zostały przypisane do węzłów końcowych, prawdziwe rozpoznania zostały ujawnione i na ich podstawie określono trafność kwalifikacji uzyskanej na podstawie stężeń badanych markerów. WYNIKI Dobór panelu markerów Aby wykryć białka surowicy różnicujące chorych na raka płuca od osób wolnych od tej choroby, zastosowano dwa podejścia metodyczne, wykorzystujące różne fizykochemiczne własności identyfikowanych białek. W analizie 2D-DIGE zidentyfikowaliśmy transferynę, RBP i haptoglobinę, a za pomocą metody MALDI-TOF MS antytrypsynę R1. Ten zestaw markerów uzupełniliśmy o dwa białka: CEA i SCCA, których stężenia w surowicy zmieniają się wraz z rozwojem raka płuca, jednak charakteryzują się niewystarczającą czułością i swoistością, aby miały wartość diagnostyczną samodzielnie lub w połączeniu z innymi białkami. 11,14,15 Dobór panelu czterech markerów na podstawie analizy zbioru uczącego Aby zrealizować cel pracy, tj. zidentyfikować zestaw białek surowicy krwi, których oznaczanie mogłoby być przydatne w diagnostyce raka płuca, zastosowano model CART dla sklasyfikowania 100 próbek surowic jako pochodzących od chorych na raka płuca lub od osób wolnych od tej choroby. Dla zbioru uczącego model ten wskazał CEA, RBP, SCCA i AAT jako optymalny zestaw markerów o siedmiu węzłach końcowych (Ryc. 1). Uzyskane drzewo pozwoliło na poprawną klasyfikację 44 (88%) z 50 surowic pochodzących od chorych na raka płuca oraz 41 (82%) z 50 surowic z grupy kontrolnej (czułość, 89,3%; swoistość, 84,7%). W węzłach końcowych 4, 5 i 7 znalazło się 68% (34 z 50) wszystkich raków płuca i jedynie 6% (3 z 50) próbek z grupy kontrolnej. Jeśli zatem próbkę zakwalifikowano do jednego z tych węzłów końcowych, oznaczało to 92% prawdopodobieństwo (34 z 37), że pochodzi ona od chorego na raka płuca. Prawdopodobieństwo raka płuca przypisane każdemu z siedmiu węzłów końcowych przedstawiono w Tabeli 2. Niezależny zaślepiony zbiór testujący dla panelu czterech markerów To samo drzewo klasyfikacyjne przetestowano następnie na oddzielnym, niezależnym, zaślepionym zbiorze 49 surowic pochodzących od chorych na raka płuca i 48 surowic pochodzących od osób wolnych od tej choroby. Na podstawie tego drzewa prawidłowo sklasyfikowano 35 (71,4%) z 49 surowic pochodzących od chorych na nowotwór i 32 (66,7%) z 48 surowic z grupy kontrolnej (czułość, 77,8%; swoistość, 75,4%). W węzłach końcowych 4, 5 i 7 znalazło się 57% przypadków raka płuca (28 z 49) i jedynie 6% kontroli (3 z 48). Jeśli próbka została www.jco.org 179

Patz i wsp. Ryc. 1. Analiza danych ze zbioru uczącego dla czterech wybranych białek za pomocą drzewa klasyfikacyjno-regresyjnego (CART) o siedmiu węzłach końcowych. Trzy węzły końcowe charakteryzujące raki zaznaczono grubą czcionką. CEA antygen karcynoembrionalny; RBP białko wiążące retynol; SCCA antygen raka płaskonabłonkowego; AAT antytrypsyna R1. przypisana do jednego z tych trzech węzłów końcowych, prawdopodobieństwo, że pochodzi od chorego na raka płuca wynosiło 90% (27 z 30). Prawdopodobieństwo raka płuca przypisane każdemu z siedmiu węzłów końcowych przedstawiono w Tabeli 2. Jak przedstawiono na Ryc. 2A, 62% chorych w stopniu I (10 z 16), 66% w stopniu II (2 z 3), 63% w stopniu III (12 z 19) i 100% w stopniu IV (11 z 11) zostało prawidłowo zaklasyfikowanych do węzłów końcowych określających raka płuca. Na Ryc. 2B pokazano rozkład typów histopatologicznych raka płuca w poszczególnych węzłach końcowych. Chociaż częstości prawidłowej klasyfikacji próbki dla zbioru testującego były średnio niższe niż dla zbioru uczącego, jednak poszczególne węzły drzewa różniły się zdolnością do klasyfikacji próbek w zbiorze testującym. Jak przedstawia Tabela 2, w porównaniu ze zbiorem uczącym, węzły 1, 5 i 7 dawały dla zbioru testującego wyniki równie dobre lub lepsze. Łącznie w zbiorze testującym te trzy węzły prawidłowo sklasyfikowały 20 (83%) z 24 surowic kontrolnych i 21 (84%) z 25 surowic od chorych na raka płuca. Węzły 2, 3, 4 i 6 wykazywały większą dokładność w zbiorze uczącym, z częstością prawidłowej klasyfikacji próbki w zbiorze testującym przyjmującą wartości od 35% do 70%. Najdokładniejsze węzły końcowe, zarówno w zbiorze uczącym, jak i testowym, zależały od stężenia samego CEA lub CEA wraz z RBP. Sugeruje to, że te dwa markery będą mogły stanowić podstawę testu diagnostycznego o dużej mocy dla wykrywania raka płuca. 180 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

Diagnostyka raka płuca z wykorzystaniem zestawu markerów biologicznych w surowicy Węzeł końcowy Klasa* Markery definiujące Tabela 2. Klasyfikacja chorych za pomocą analizy CART Zbiór uczący Zbiór testujący Raki Kontrole Raki Kontrole Liczba chorych Liczba % Liczba % Liczba chorych Liczba % Liczba % 1 2 CEA # 1,01 22 3 13,6 19 86,4 24 4 16,7 20 83,3 2 1 1,01! CEA # 2,14; SCCA # 0,77 16 10 62,5 6 37,5 20 7 35 13 65 3 2 1,01! CEA # 2,14; SCCA 0,77; AAT # 2,04 19 2 10,5 17 89,5 15 7 46,7 8 53,3 4 1 1,01! CEA # 2,14; SCCA 0,77; AAT 2,04 5 4 80 1 20 10 7 70 3 30 5 1 CEA! 2,14; RBP# 102,9 15 15 100 0 0 8 8 100 0 0 6 2 2,14! CEA # 3,47; RBP 102,9 6 1 16,7 5 83,3 7 3 42,9 4 57,1 7 1 CEA 3,47; RBP 102,9 17 15 88,2 2 11,8 13 13 100 0 0 UWAGA. Grubą czcionką zaznaczono prawidłowo sklasyfikowane próbki surowic. Skróty: CART drzewo klasyfikacyjno-regresyjne; CEA antygen karcynoembrionalny; SCCA antygen raka płaskonabłonkowego; AAT antytrypsyna R1; RBP białko wiążące retynol. *Klasa 1 = rak; klasa 2 = kontrola. Jednostki pomiaru poszczególnych markerów: CEA ng/ml; SCCA ng/ml; AAT mg/ml; RBP \g/ml. DYSKUSJA Rak płuca wiąże się z najwyższą liczbą zgonów w porównaniu z wszystkimi innymi nowotworami złośliwymi. Pomimo postępów w diagnostyce i leczeniu nowotworów, śmiertelność z powodu raka płuca nie zmieniła się zasadniczo w ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat. Większość chorych jest diagnozowana w wysokich stopniach zaawansowania, kiedy dostępne sposoby leczenia, włącznie z chemio- i radioterapią, mają niską skuteczność. Badania przesiewowe w kierunku raka płuca, obejmujące RTG klatki piersiowej i badania cytologiczne plwociny, nie wykazały, że postępowanie to doprowadzi do zmniejszenia liczby osób, które umierają z powodu raka płuca. 16 Niedawne próby kliniczne z zastosowaniem tomografii komputerowej (CT) wykazały, że można w ten sposób wykryć mniejsze zmiany. Nie udało się jednak wykazać, że tego typu badanie zmniejszy umieralność z powodu raka płuca, co jest podstawowym celem badań przesiewowych. 17 Próby te pokazały także wiele trudności w zastosowaniu badań obrazowych jako wyłącznej metody wczesnego wykrywania raka płuca. Zaleca się, aby za pomocą CT badać wszystkie osoby z grupy wysokiego ryzyka, tj. palaczy i byłych palaczy. 2,18 Jedynie niewielki procent osób zaliczanych obecnie do grupy wysokiego ryzyka faktycznie zachoruje na raka płuca; co więcej, część z tych raków może dodatkowo charakteryzować się powolnym przebiegiem, tj. występuje błąd nadwykrywalności. 3,17,19,20 Tak więc problem określenia optymalnej populacji, którą należałoby poddać przesiewaniu, pozostaje nadal nierozwiązany. Wysokie prawdopodobieństwo fałszywie dodatnich wyników w próbach klinicznych z użyciem CT powoduje, że duża liczba osób poddawana jest dalszym procedurom diagnostyczno-terapeutycznym. Ponadto w niektórych próbach klinicznych z użyciem CT aż do 30% usuwanych zmian okazało się zmianami łagodnymi. Oznacza to, że pewna liczba osób została poddana niepotrzebnej torakotomii, ze wszystkimi konsekwencjami dotyczącymi śmiertelności i powikłań związanymi z tą operacją. 3 Mimo że zaproponowano różne sposoby oceny zmian nieokreślonego pochodzenia, nie istnieje jeden, ogólnie przyjęty i oparty na naukowych przesłankach, sposób postępowania z tymi chorymi. Wobec opisanego powyżej fundamentalnego ograniczenia CT jakim jest jej niska swoistość, celem naszych badań stało się określenie nowego panelu markerów, który umożliwiałby różnicowanie pomiędzy rakiem płuca i zmianami łagodnymi. Idea stosowania markerów biologicznych wiąże się z biologią nowotworów jako choroby układowej. W rozwoju nowotworów dochodzi do uwalniania białek niezbędnych do wzrostu i inwazyjności komórek nowotworowych; ponadto komórki nowotworowe przedostają się do krwiobiegu. W otoczeniu rozwijającego się nowotworu zmianie ulega struktura i unaczynienie tkanek gospodarza, uruchomione zostają mechanizmy odpornościowe w postaci odpowiedzi naturalnej i adaptywnej, z naciekaniem nowotworu przez komórki zapalne, w tym makrofagi,histiocytyilimfocytyiprodukcjąprzeciwciał. 21-24 Wydaje się zatem, że określona kombinacja białek uwalnianych przez nowotwór i produkowanych przez komórki gospodarza w odpowiedzi na nowotwór mogłaby charakteryzować chorobę nowotworową i służyć do badań przesiewowych. Ze względu na heterogenność raka płuca niezbędny jest panel markerów, które odpowiadałyby różnym typom klinicznym tego nowotworu. W poszukiwaniu zestawu takich markerów w surowicy zastosowaliśmy różne metody badawcze. Chociaż początkowo testowaliśmy sześć białek, analiza zbioru uczącego przy zastosowaniu metody CART wykazała, że użycie czterech markerów, tj. CEA, RBP, SCC i AAT, jest wystarczające do prawidłowej klasyfikacji 88% chorych na raka i 82% osób wolnych od tej choroby. Procedura klasyfikacji wynikająca z analizy CART przypisuje każdej osobie prawdopodobieństwo cho- www.jco.org 181

Patz i wsp. Ryc. 2. Rozkład częstości surowic od chorych na raka płuca w węzłach końcowych w zależności od stopnia zaawansowania (A) i rozpoznania histopatologicznego (B). Odsetek (oś y) odnosi się do odsetka nowotworów o określonym stopniu zaawansowania lub rozpoznaniu histopatologicznym przypisanych do określonego węzła końcowego. BAC rak oskrzelikowo-pęcherzykowy; SCLC rak drobnokomórkowy płuca; NSCLC rak niedrobnokomórkowy płuca. roby nowotworowej odpowiadające węzłowi końcowemu drzewa klasyfikacyjnego, do którego dana osoba została zakwalifikowana w oparciu o badanie markerów. Jeśli osoba ze zbioru uczącego została zaliczona do jednego z trzech następujących węzłów końcowych: 4, 5 lub 7, oznaczało to 92% prawdopodobieństwo, że była chora na raka płuca. W fazie testującej naszego badania drzewo klasyfikacyjne prawidłowo sklasyfikowało 71,4% chorych na raka i 66,6% osób z grupy kontrolnej. Podobnie jak dla zbioru uczącego, węzły 4, 5 i 7 były najważniejsze w predykcji raka płuca: 57% wszystkich chorych na raka płuca i jedynie 6% osób z grupy kontrolnej zostało przydzielonych do tych węzłów. Oznacza to, że jeśli pacjent został przypisany do jednego z tych węzłów, miał 90% prawdopodobieństwo, że był chory na raka. Wszystkie markery białkowe opisane w niniejszym badaniu są związane z rakiem płuca, ale żaden z nich, oznaczany pojedynczo, nie może być stosowany do diagnostyki chorych z podejrzeniem raka płuca. Jednakże wydaje się, że jeśli są one oznaczane jednocześnie, mogą być użyteczne klinicznie. Najbardziej oczywiste, natychmiastowe zastosowanie takiego panelu markerów byłoby u chorych, u których w badaniach obrazowych, przeprowadzanych w celach przesiewowych lub z jakichkolwiek innych powodów, stwierdzono by zmianę w płucach niewiadomego pochodzenia. Chorzy z grupy niskiego ryzyka, wyznaczonej na podstawie danych klinicznych, którzy nie zostaliby przypisani do węzłów końcowych typowych dla raka płuca, mogliby być poddani dalszej obserwacji z zastosowaniem badań obrazowych z częstością zależną od prawdopodobieństwa choroby charakteryzującego dany węzeł drzewa klasyfikacyjnego. Chorzy o klinicznym profilu wysokiego ryzyka, którzy zostaliby przypisani do węzła końcowego typowego dla nowotworu złośliwego, wymagaliby natychmiastowej interwencji. W niniejszym badaniu ponad 60% chorych na raka płuca zostało przydzielonych do jednego z trzech węzłów wskazujących na raka płuca z prawdopodobieństwem ponad 90%. U tych chorych można, dla oceny stopnia zaawansowania, wykonać tomografię pozytronową, a następnie, w zależności od innych czynników klinicznych, zabieg operacyjny lub biopsję. Zaproponowany panel markerów, po potwierdzeniu w próbach klinicznych, mógłby mieć zastosowanie również w innych sytuacjach klinicznych, np. przed badaniami obrazowymi do wyodrębnienia osób o wysokim ryzyku wystąpienia raka płuca. U pacjentów o klinicznym profilu wysokiego ryzyka choroby nowotworowej i wysokim prawdopodobieństwie raka płuca stwierdzonym na podstawie badania panelu markerów wykonywano by badanie CT. Pacjenci, u których badania panelu markerów wskazywałyby na niskie prawdopodobieństwo wystąpienia raka płuca, byliby poddawani kolejnym badaniom panelu markerów w ramach rutynowego monitorowania przebiegu choroby. Choć dodatkowe markery mogłyby polepszyć wartość diagnostyczną oznaczeń, proponowany obecnie zestaw wymaga dalszych badań. Należy pamiętać, że węzły końcowe określają jedynie prawdopodobieństwo, że dana osoba może być chora na raka i dane te powinno się interpretować z należytą ostrożnością. Dalsze badania na odpowiednio licznych grupach powinny udoskonalić algorytm diagnostyczny. Mamy więc nadzieję, że optymalna strategia diagnostyczna polepszy wyniki leczenia. PIŚMIENNICTWO 1. Mountain CF: Revisions in the International System for Staging Lung Cancer. Chest 111:1710-1717, 1997 2. Swensen SJ, Jett JR, Hartman TE, et al: CT screening for lung cancer: Five-year prospective experience. Radiology 235:259-265, 2005 3. Sone S, Li F, Yang ZG, Honda T, et al: Results of three-year mass screening programme for lung cancer using mobile low-dose spiral computed tomography scanner. Br J Cancer 84:25-32, 2001 4. Manser R, Dalton A, Carter R, et al: Costeffectiveness analysis of screening for lung cancer with low dose spiral CT (computed tomography) in the Australian setting. Lung Cancer 48:171-185, 2005 5. Mahadevia PJ, Fleisher LA, Frick KD, et al: Lung cancer screening with helical computed tomography in older adult smokers: A decision and cost-effectiveness analysis. JAMA 289:313-322, 2003 182 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

Diagnostyka raka płuca z wykorzystaniem zestawu markerów biologicznych w surowicy 6. Gabay C, Kushner I: Acute-phase proteins and other systemic responses to inflammation. N Engl J Med 340:448-454, 1999 7. Wang MZ, Howard B, Campa MJ, et al: Analysis of human serum proteins by liquid phase isoelectric focusing and matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry. Proteomics 3:1661-1666, 2003 8. Ljujic M, Nikolic A, Divac A, et al: Screening of alpha-1-antitrypsin gene by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). J Biochem Biophys Methods 68:167-173, 2006 9. Zelvyte I, Wallmark A, Piitulainen E, et al: Increased plasma levels of serine proteinase inhibitors in lung cancer patients. Anticancer Res 24:241-247, 2004 10. Molina R, Agusti C, Mane JM, et al: CYFRA 21-1 in lung cancer: Comparison with CEA, CA 125, SCC and NSE serum levels Int J Biol Markers 9:96-101, 1994 11. Schneider J: Tumor markers in detection of lung cancer. Adv Clin Chem 42:1-41, 2006 12. Breiman L, Friedman J, Olshen R, et al: Classification and Regression Trees. Pacific Grove, CA, Wadsworth, 1984 13. Steinberg D, Golovnya M, Tolliver D, in: CART for Windows User Guide. San Diego, CA, Salford Systems, 2002 14. Tas F, Aydiner A, Topuz E, et al: Utility of the serum tumor markers: CYFRA 21.1, carcinoembryonic antigen (CEA), and squamous cell carcinoma antigen (SCC) in squamous cell lung cancer. J Exp Clin Cancer Res 19:477-481, 2000 15. Kulpa J, Wojcik E, Reinfuss M, et al: Carcinoembryonic antigen, squamous cell carcinoma antigen, CYFRA 21-1, and neuron-specific enolase in squamous cell lung cancer patients Clin Chem 48:1931-1937, 2002 16. Marcus PM, Bergstralh EJ, Fagerstrom RM, et al: Lung cancer mortality in the Mayo Lung Project: Impact of extended follow-up. J Natl Cancer Inst 92:1308-1316, 2000 17. Bach PB, Jett JR, Pastorino U, et al: Computed tomography screening and lung cancer outcomes. JAMA 297:953-961, 2007 18. Henschke CI, Yankelevitz DF, Libby DM, et al: Survival of patients with stage I lung cancer detected on CT screening. N Engl J Med 355:1763-1771, 2006 19. Patz EF Jr, Goodman PC, Bepler G: Screening for lung cancer. N Engl J Med 343:1627-1633, 2000 20. Patz EF: Jr. Lung cancer screening, overdiagnosis bias, and reevaluation of the Mayo Lung Project. J Natl Cancer Inst 98:724-725, 2006 21. Petersen RP, Campa MJ, Sperlazza J, et al: Tumor infiltrating Foxp3+ regulatory T-cells are associated with recurrence in pathologic stage I NSCLC patients. Cancer 107:2866-2872, 2006 22. Zhong L, Coe SP, Stromberg AJ, et al: Profiling tumor-associated antibodies for early detection of non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol 1:513-519, 2006 23. Welsh TJ, Green RH, Richardson D, et al: Macrophage and mast-cell invasion of tumor cell islets confers a marked survival advantage in non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol 23:8959-8967, 2005 24. Condeelis J, Pollard JW: Macrophages: Obligate partners for tumor cell migration, invasion, and metastasis. Cell 124:263-266, 2006 Oświadczenie autorów na temat potencjalnych konfliktów interesów Autorzy nie wskazali możliwości konfliktu interesów. Wkład poszczególnych autorów Pomysł i projekt badania: Edward F. Patz Jr, Michael J. Campa, Elizabeth B. Gottlin, James E. Herndon II Wsparcie finansowe: Edward F. Patz Jr Wsparcie administracyjne: Edward F. Patz Jr, Michael J. Campa, Xiang Rong Guan Dostarczenie próbek lub umożliwienie dostępu do chorych: Edward F. Patz Jr, Michael J. Campa, Elizabeth B. Gottlin, Xiang Rong Guan Zbieranie i gromadzenie danych: Edward F. Patz Jr, Michael J. Campa, Elizabeth B. Gottlin, Irina Kusmartseva, Xiang Rong Guan, James E. Herndon II Analiza i interpretacja danych: Edward F. Patz Jr, Michael J. Campa, Elizabeth B. Gottlin, Irina Kusmartseva, James E. Herndon II Pisanie manuskryptu: Edward F. Patz Jr, Michael J. Campa, Elizabeth B. Gottlin, James E. Herndon II Ostateczna akceptacja manuskryptu: Edward F. Patz Jr, Michael J. Campa, Elizabeth B. Gottlin, Irina Kusmartseva, Xiang Rong Guan, James E. Herndon II Załącznik Załącznik zamieszczono w pełnej wersji artykułu, dostępnej na stronie internetowej www.jco.org. www.jco.org 183