Receptory (c.d.) Gabriel Nowak, Małgorzata Dybała Zakład Cytobiologii i Histochemii, Pracowia Farmakobiologii Collegium Medicum Uiwersytet Jagielloński Zagadieia: Co zaczy Radioligad bidig assay? Działaie leków a zasadzie iterakcji ligad receptor Podstawowe właściwości wiązaia ligad receptor Izotopy - uklidy (jądra atomowe) o tej samej liczbie atomowej i róŝej liczbie masowej, tj. o jedakowej liczbie protoów i róŝej liczbie eutroów p.: 12 C, 14 C; 1 H (wodór zwykły), 2 H (deuter), 3 H (tryt) Izotop promieiotwórczy, radioizotop izotop daego pierwiastka, którego jądra wykazują zdolość samorzutej przemiay z emisją promieiowaia joizującego. Promieiotwórczośćjest efektem iestabilego układu protoów i eutroów w jądrze, które ulega samorzutemu rozpadowi w celu osiągięcia iŝszego (bardziej korzystego) stau eergetyczego. Taki sta jest osiągay przez emisję cząstek alfa lub beta. Radioligad bidig assays Cząstkialfato jądra atomu helu, składające się z dwóch protoów i dwóch eutroów. A X A-4 X + 4 He Z Z-2 2 Ligad zakoway radioizotopem Cząstkibetato elektroy emitowae z jąder (eutro elektro + proto + v - ) A X A X + β - + v - Z Z+1 3 H, 125 I,... Promieiowaiegammato fale elektromagetycze, które towarzyszy emisji cząstek alfa lub beta 1
Radioligad bidig assays ligada do kompoety białkowej Receptory metabotropowe Są związae z systemem wtórych przekaźików za pośredictwem GTP. Przyłączeie edogeego ligada (agoisty) do miejsca wiązaia iicjuje kaskadę sygałów wewątrzkomórkowych (p. przez fosforylację) Neurotrasmitery Hormoy Czyiki wzrostu Cytokiy Leki Toksyy... Receptory Kaały joowe (VS) Ezymy Cząstki trasportujące (VS) = Voltage - sesitive Białko G Efektor Receptory jootropowe = kaały joowe bramkowae ligdem Podstawy działaia leków: iterakcja ligad - receptor W tym przypadku efektor (bramka) jest częścią receptora! Przyłączeie eurotrasmitera Wiele leków musi wiązać się z receptorem aby wywołać efekt. Takie leki są ligadami. Bramkowaie ligadem ozacza, Ŝe do otwarcia kaału koiecze jest przyłączeie specyficzego trasmitera (agoisty) do zewątrzkomórkowej części receptora. Otwarcie kaału Jeśli efektem wiązaia ligada do miejsca wiązaia są zmiay koformacyje i odpowiedź komórkowa to taki ligad jest agoistą. Zajęcie miejsca rozpozaia przez edogey ligad (agoistę) prowadzi do apływu joów przez błoę komórkową. Wpływ joów przez błoę Przyłączeie ligada do miejsca wiązaia moŝe ie powodować odpowiedzi komórkowej. Jakkolwiek, zajęcie tego miejsca czyi je iezdolym do przyłączaia iych ligadów, m. i. edogeych agoistów. W tym przypadku ligad azywamy atagoistą. Matematycze modelowaie odwracalego wiązaia ligada! ligada do miejsca wiązaia a receptorze ie zawsze pociąga za sobą odpowiedź wewątrzkomórkową. KaŜda cząstka ligada (L) moŝe tworzyć z receptorem (R) kompleks ligad receptor (LR)! ligada do receptora jest tylko jedym aspektem iterakcji ligad receptor. [L] + [R] [LR] Radioligad bidig assay dostarcza iformacji tylko o powiowactwie ligada do miejsca wiązaia. Te kompleks (LR) moŝe w kaŝdym momecie ulec rozpadowi, w wyiku czego powstaje wola cząstka ligada (L) i iezwiązay receptor (R). Wiosek: w celu sprawdzeia, czy ligad jest agoistą, czy atagoistą koiecze jest przeprowadzeie testów fukcjoalych. 2
Reakcja wiązaia ligada (L) z receptorem (R) przebiega zgodie z prawem działaia mas (Guldberga i Waagego) Dlaczego? K D [LR] = [L] [R] jest stałe gdzie K D jest stałą dysocjacji. K D zaleŝy od czyików fizyczych jak temperatura i od chemiczych właściwości substacji. To samo rówaie moŝe być stosowae dla bardziej skomplikowaych modeli, w których R i LR mogą mieć wielorakie koformacje. Zaczekaj! Pomyśl! PoiewaŜ całkowita liczba receptorów (w preparacie) jest ograiczoa Więc jakie jest wiązaie (bidig) do tej ograiczoej liczby receptorów? Jeśli wiązaie ligada (klucza) do kompoety białkowej (receptora) wymaga odpowiediego dopasowaia pomiędzy strukturą ligada a miejscem wiązaia (zamkiem) to taka iterakcja jest specyficza. wysycale do receptorów jest do receptorów jest wysycale (saturable) STEREOSPECYFICZNE Miejsce wiązaia Jeśli receptory są obece w ograiczoej ilości, to przy pewym stęŝeiu ligada wszystkie receptory są związae i krzywa wiązaia osiąga plateau. ligada do receptora jest specyficze i wysycale Wracając do modelowaia matematyczego: [L] + [R] [LR] Jeda cząstka ligada wiąŝe się z jedym receptorem (miejscem wiąŝącym ligad) w sposób odwracaly z określoymi szybkościami wiązaia (asocjacji) i rozpadu (dysocjacji). Reakcja wiązaia ligada (L) z receptorem (R) przebiega zgodie z prawem działaia mas. K D [LR] = [L] [R] gdzie K D jest stałą dysocjacji jako % maksymalego wiązaia specyficzego KD Bmax............... całkowite dla dwóch ligadów A i B maksymale...[m]... 3
lub Krzywa Scatcharda (Rosethala) Aktualie ta metoda ie jest juŝ uŝywaa. Posiada oa wiele ograiczeń. Obecie została zastąpioa przez programy komputerowe. Jest słusza tylko jeśli lek łączy się z pojedyczą populacją miejsc receptorowych Jest wraŝliwa a artefakty eksperymetale Związay radioligad Woly radioligad KD = - 1/tg α α Młody człowieku! Masz rację! Ale to jest Ograiczeia aalizy Scatcharda uczelia i aaliza Scatcharda jest koiecza abeci mogli zrozumieć podstawy I asuwa bardzo iteresujące pytaia egzamiacyje Związay radioligad (skala liiowa) Ograiczeia aalizy Scatcharda Defiicje Przygotowaie tkaki i radioligada Dobrze wymieszać Praktycze przedstawieie bidigu B max wyraŝaa p. w pikomolach a miligram białka (pmol/mg prot.) Maksymala ilość ligada, która wiąŝe się specyficzie z receptorem w błoie preparatu. Co zaczą te wszystkie liczby? Ikubacja K D - jedostką jest mol a litr (p. M) Stała dysocjacji zakowaego ligada wyzaczoa w metodzie wysyceiowej. Ozacza stęŝeie 3 H ligada, który w staie rówowagi procesów asocjacji i dysocjacji (equilibrium) łączy się z 50% receptorów. Filtracja Aaliza wyików Płukaie Liczeie Wiemy juŝ, Ŝe wiązaie ligada do receptora jest specyficze Więc radioaktywość związaa z tkaką odzwierciedla tylko ligad związay z receptorem tz. wiązaie specyficze? RECEPTORY [ 3 H] ligad Oczywiście NIE! 4
RECEPTORY [ 3 H] ligad RECEPTORY [ 3 H] ligad iespecyficze zimy ligad RECEPTORY [ 3 H] ligad Zarówo wiązaie specyficze (tz. ligad związay z receptorem) jak i wiązaie iespecyficze składają się a radioaktywość która pozostaje związaa z tkaką po odpłukaiu. Odpłukiwaie pozwala tylko a usuięcie wolego ligada obecego w środowisku ikubacyjym Ligady specyficze Tkaka Błoa komórkowa iespecyficze Problem wiązaia iespecyficzego Jak odróŝić wiązaie specyficze od iespecyficzego? Wiele ligadów ma zdolość do wiązaia się iespecyficzie z tkaką, i róŝymi powierzchiami, które ie są liczoe w trakcie procedury (p.: filtry, szkło,...) iespecyficze do powierzchi szklaych i filtrów papierowych moŝe być wyelimiowae przy pomocy atyadsorbatów, p. kolageu Pierwsza seria próbek: tkaka + zakoway ligad Ligad zakoway izotopem iespecyficze specyficze Błoa Tkaka Ale takie zabiegi ie zmiejszają wiązaia iespecyficzego do tkaki w czasie eksperymetu. Koiecze jest więc mierzeie wiązaia iespecyficzego Związaa radioaktywość = wiązaie iespecyficze + specyficze 5
Druga seria próbek: tkaka + zakoway ligad + ie zakoway (zimy) ligad DuŜo! iespecyficze zakowaego radioligada do tkaki NIE zmieia się po dodaiu duŝej ilości ie zakowaego ligada, poiewaŝ wiązaie iespecyficze NIE jest wysycale. iespecyficze specyficze Druga seria próbek = tkaka + zakoway ligad + admiar ie zakowaego (zimego) ligada Związaa radioaktywość = wiązaie iespecyficze Związaa radioaktywość z pierwszej serii próbek Nie zakoway ligad jest doday w duŝych ilościach, więc ligad zakoway jest przez iego całkowicie wyparty z miejsc wiąŝących (specyficzych) a receptorze. Związaa radioaktywość z drugiej serii próbek = Związaa radioaktywość pochodząca tylko z wiązaia specyficzego jako % maksymalego wiązaia specyficzego całkowite dla dwóch ligadów A i B Ligad musi być aktywy biologicze, Ŝeby jego wiązaie się do miejsca wiąŝącego receptora korelowało z aktywością farmakologiczą (jako agoisty bądź atagoisty). całkowite specyficze iespecyficze Czystość: ligad musi być czysty chemicze, przechowyway w odpowiedich warukach Jego rozkład moŝa ograiczyć przez: dodawaie zmiataczy wolych rodików do roztworu przechowywaie w jak ajiŝszej temperaturze ie dopuszczając jedak do zamarzaia uikaie światła (cieme butelki) dodawaie atyoksydatów (p. kwas askorbiowy) Ligad jest ajczęściej zakoway przez tryt [ 3 H] lub 125 jod [ 125 I] [ 3 H] Zalety: Ligad zakoway ie róŝi się od ie zakowaego MoŜa osiągąć wysokie aktywości specyficze (>80 Ci/mmol) Przechowywae w odpowiedich warukach ligady zakowae są trwałe Czas połowiczego rozpadu 12,5 roku. Tkaka i waruki ikubacji Tkaka musi zawierać odpowiedi receptor (miejsce wiąŝące) Tkaką moŝe być błoa, skrawek, koloia komórek a awet rozpuszczoy receptor W ostatim przypadku jakiej metody uŝylibyście aby oddzielić ligad iezwiązay od związaego; filtracji? MoŜa uŝyć cały mózg albo wybrae jego regioy Wady: Zakowaie trytem wymaga specjalistyczych laboratoriów Wysokie koszty Wybór preparatu tkakowego zaleŝy od rodzaju receptora i od hipotezy którą chcemy zbadać. Na przykład jaki obszar mózgu wybralibyście aby sprawdzić, czy zmieia się wiązaie do receptorów dopamiowych w modelu choroby Parkisoa? 6
Oddzielaie ligada związaego od wolego Testy kompetycyje (hamowaia/wypieraia) Oddzieleie kompleksu tkaki ze związaym ligadem od wolego ligada pozostającego w mieszaiie ikubacyjej zazwyczaj przeprowadza się a drodze filtracji lub wirowaia. Ale dla rozpuszczoych receptorów stosujemy wiele iych techik, p.. dializę, chromatografię kolumową, precypitację. Główym problemem w techikach rozdziału jest szybkość dysocjacji kompleksu ligad-receptor. Szybkość rozdziału musi być dostosowaa do powiowactwa ligada do receptora. Niskie powiowactwa (tz. wysokie K D ) wymagają szybkiego oddzieleia wolego ligada od związaego. Testy kompetycyje mają zastosowaie w screeigu leków mającym a celu charakterystykę profilu receptorów dla owych leków (p( p.. z którym receptorem oddziałuje lek); W tym typie testów uŝywa się jedego stęŝeia radioligada we wszystkich seriach próbek (iaczej iŝ w metodzie saturacyjej, gdzie stosujemy róŝe stęŝeia radioligada StęŜeie radioligada jest iskie, zazwyczaj K D Krzywe kompetycyje dla trzech związków: A, B & C Proces scytylacji Ilość związaego radioligada specyficze iespecyficze Log [stęŝeie ligada] W przeciwieństwie do promiei gamma, cząstki alfa i beta mają bardzo krótki zasięg. Dlatego w celu ich wykrycia koiecze jest umieszczeie detektora ajbliŝej jak to moŝliwe. Takim detektorem jest płyy koktajl scytylacyjy. Do pomiaru promieiowaia gamma detektor moŝa umieścić a zewątrz próbki. Pły scytylacyjy zawiera m. i. rozpuszczalik i substację posiadającą zdolość fluorescecji. IC 50 =Stężeie substacji (p. A), które wypiera w 50% radioligad z jego specyficzych połączeń. 1) 2) 3) * β - Cząstka beta Wzbudzoa cząsteczka rozpuszczalika O N Wzbudzoa cząsteczka substacji fluoryzującej * Wzbudzoa cząsteczka rozpuszczalika * O N Wzbudzoa cząsteczka substacji fluoryzującej Fotoy światła * Autoradiografia receptorów Topograficza aaliza rozmieszczeia receptorów w tkakach z uŝyciem specyficzych ligadów zakowaych radioizotopem (ajczęściej [ 3 H] lub [ 14 C]). Preparaty mikroskopowe są traktowae Ŝelatyą w celu zwiększeia zdolości przylegaia tkaki. Tkaka jest astępie usuwaa, zamraŝaa i cięta a kriomikrotomie a mikroskopijej grubości skrawki, które są astępie umieszczae a szkiełku mikroskopowym. Tkaka jest ikubowaa z radioligadem w obecości lub bez zimego ligada. Po przemyciu preparatu akładamy a iego kliszę fotograficzą lub emulsję. Gotowy autoradiogram aalizuje się przy uŝyciu mikroskopu. 7
Zastosowaie metod radioreceptorowych Badaie powiowactwa związków chemiczych do receptorów (testy kompetycyje, drug screeig) Badaie charakterystyki receptorów w patologii (tkaka postmortem) Badaie wpływu róŝych czyików (leki, stres, itp.) a charakterystykę receptorów Badaie dystrybucji receptorów w tkakach (autoradiografia). Podsumowaie: Metody radioreceptorowe pozwalają badać receptory (dokładiej: miejsca wiązaia) w preparatach tkakowych, oraz zmiay w ich astępujące pod wpływem leków, staów chorobowych lub waruków eksperymetalych. Metody radioreceptorowe są bardziej uiwersale iŝ radioimmuoassay, poiewaŝ ie są oparte a specyficzości atygeowej. Podstawowymi wymagaiami metod radioreceptorowych są: tkaka zawierająca stosowy receptor ligad zakoway radioizotopem urządzeie do oddzieleia wolego i związaego ligada aparat do pomiaru radioaktywości próbek 8