(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 11.07.2003, PCT/US03/021590

PL 214010 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 214010 (21) Numer zgłoszenia: 377743 (22) Data zgłoszenia: 11.07.2003 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 11.07.2003, PCT/US03/021590 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 22.01.2004, WO04/008099 (13) B1 (51) Int.Cl. G01N 33/53 (2006.01) C07K 16/30 (2006.01) (54) Rekombinowane humanizowane przeciwciało 2C4 i zastosowanie tego przeciwciała (30) Pierwszeństwo: 15.07.2002, US, 60/396,290 20.06.2003, US, 60/480,043 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 20.02.2006 BUP 04/06 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 28.06.2013 WUP 06/13 (73) Uprawniony z patentu: GENENTECH, INC., San Francisco, US F. HOFFMANN-LA ROCHE AG, Basel, CH (72) Twórca(y) wynalazku: HANS KOLL, Oberroth, DE BIRGIT BOSSENMAIER, Seefeld, DE HANS-JOACHIM MÜLLER, Penzberg, DE MARK X. SLIWKOWSKI, San Carlos, US STEPHEN MICHAEL KELSEY, Montara, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik

2 PL 214 010 B1 Opis wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy rekombinowanego humanizowanego przeciwciała 2C4 i zastosowania tego przeciwciała. Wynalazek opisuje także sposoby identyfikowania nowotworu, jako nowotworu wrażliwego na leczenie przeciwciałami anty-her2 praz pozwala na opracowanie sposobów leczenia pacjentów cierpiących na takie nowotwory. Tło wynalazku Rodzina receptorowych kinaz tyrozynowych ErbB stanowi ważne mediatory komórkowego wzrostu, różnicowania i przeżycia. Ta rodzina receptorów obejmuje czterech różnych przedstawicieli włączając receptor naskórkowego czynnika wzrostowego (epidermal growth factor - EGFR lub ErbB1), HER2 (ErbB2 lub pl85neu), HER3 (ErbB3) oraz HER4 (ErbB4 lub tyro2). EGFR kodowany przez gen erbb1 został wskazany, jako przyczynowo związany ze złośliwieniem nowotworów u ludzi. W szczególności, obserwowano podwyższoną ekspresję EGFR w nowotworze piersi, pęcherza, płuc, głowy, szyi oraz żołądka jak również w glejaku. Podwyższona ekspresja receptora EGFR często związana jest z podwyższoną produkcją ligandu EGFR, transformującego czynnika wzrostowego alfa (ang. transforming growth factor alpha - TGF-α) przez te same komórki nowotworowe, co powoduje aktywację receptora przez autowydzielniczą ścieżkę stymulatorową. Baselga and Mendelsohn Pharmac. Ther., 64:127-154 (1994). Dodatkowo, opisane zostało białko pokrewne receptorowi naskórkowego czynnika wzrostowego (ERRP) zawarte w sklonowanym fragmencie cdna o wielkości 1583 par zasad z 90-95% homologią sekwencji do mysiego EGFR i skróconego szczurzego EGFR (Patent USA Nr 6399743; oraz Publikacja USA Nr 2003/0096373). Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko EGFR lub jego ligandom, TGF-α oraz EGF zostały określone jako czynniki terapeutyczne w leczeniu takich nowotworów złośliwych. Patrz np. Baselga and Mendelsohn., jak wyżej; Masui i wsp., Cancer Research, 44: 1002-1007 (1984); oraz Wu i wsp., J. Clin. Invest., 95: 1897-1905 (1995). Drugiego przedstawiciela rodziny ErbB, pl85neu, początkowo zidentyfikowano jako produkt genu transformującego z nerwiaka szczurów traktowanych chemicznie. Aktywowana postać protoonkogenu neu jest rezultatem mutacji punktowej (zamiana waliny na kwas glutaminowy) w domenie transbłonowej kodowanego białka. Obserwuje się amplifikację ludzkiego homologu genu neu (HER2) w nowotworach piersi i jajników, i jest to skorelowane ze złym rokowaniem (Slamon i wsp., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon i wsp., Science, 244: 707-712 (1989); oraz Patent USA Nr 4968603). Dotychczas nie odnotowano żadnej mutacji punktowej analogicznej do tej w protoonkogenie neu dla ludzkich nowotworów. Nadmierną ekspresję ErbB2 (często, ale nie jedynie, spowodowaną amplifikacją genu) obserwowano także w innych rakach włączając raka żołądka, śluzówki macicy, ślinianek, płuc, nerek, okrężnicy, tarczycy, trzustki i pęcherza. Patrz, między innymi, King i wsp., Science, 229: 974 (1985); Yokota i wsp., Lancet, 1: 765-767 (1986); Fukushigi i wsp., Mol Cell Biol., 6: 955-958 (1986); Geurin i wsp., Oncogene Res., 3: 21-31 (1988); Cohen i wsp., Oncogene, 4: 81-88 (1989); Yonemura i wsp., Cancer Res., 51: 1034 (1991); Borst i wsp., Gynecol. Oncol., 38: 364 (1990); Weiner i wsp., Cancer Res., 50: 421-425 (1990); Kern i wsp., Cancer Res., 50: 5184 (1990); Park i wsp., Cancer Res., 49: 6605 (1989); Zhau i wsp., Mol. Carcinog., 3: 354-357 (1990); Aasland i wsp., Br. J. Cancer, 57: 358-363 (1988); Wiliams i wsp., Pathobiology, 59: 46-52 (1991); oraz McCann i wsp., Cancer, 65: 88-92 (1990). ErbB2 może ulec nadmiernej ekspresji w nowotworze prostaty (Gu i wsp., Cancer Lett., 99: 185-9 (1996); Ross i wsp., Hum. Pathol., 28: 827-33 (1997); Ross i wsp., Cancer, 79: 2162-70 (1997); oraz Sadasivan i wsp., J. Urol., 150: 126-31 (1993)). Nadmierna ekspresja ErbB3 może prowadzić do wzrostu nowotworu przez niezależną od ligandu aktywację ErbB2 lub homodimerów ErbB2. Opisano przeciwciała skierowane przeciwko produktom białkowym szczurzego pl85neu i ludzkiego ErbB2. Drebin i współpracownicy zgłosili przeciwciała przeciwko produktowi szczurzego genu neu, pl85neu. Patrz, na przykład, Drebin i wsp., Cell, 41: 695-706 (1985); Myers i wsp., Meth. Enzym., 198: 277-290 (1991), oraz WO94/22478. Drebin i wsp., Oncogene, 2: 273-277 (1988) donoszą, że mieszaniny przeciwciał reagujących z dwoma odrębnymi rejonami pl85neu mają w rezultacie synergistyczne anty-nowotworowe oddziaływania na komórki NIH-3T3 stransformowane neu, zaimplantowane do myszy bez grasicy. Patrz także Patent USA 5824311 złożony 20 października 1998. Hudziak i wsp., Mol. Cell. Biol., 9(3): 1165-1172 (1989), opisują wytwarzanie panelu przeciwciał anty-erbb2, które były charakteryzowane z użyciem linii komórkowej SK-BR-3 ludzkiego nowotworu piersi. Względną proliferację komórek SK-BR-3 po wystawieniu na działanie przeciwciał określano za

PL 214 010 B1 3 pomocą barwienia fioletem krystalicznym pojedynczych warstw komórek po 72 godzinach. Przy użyciu tego oznaczenia ustalono maksymalne zahamowanie przy użyciu przeciwciała zwanego 4D5, które hamuje proliferację komórkową w 56%. Inne przeciwciała w tym oznaczeniu w panelu obniżały proliferację komórkową w mniejszym stopniu. Przeciwciało 4D5 okazało się następnie uwrażliwiać linie komórkowe nowotworu piersi z nadmierną ekspresją ErbB2 na cytotoksyczne wpływy TNF-α. Patrz także Patent USA Nr 5677171 złożony 14 października 1997. Przeciwciała anty-erbb2 dyskutowane w Hudziak i wsp., są dalej charakteryzowane w Fendly i wsp., Cancer Research, 50: 1550-1558 (1990); Kotts i wsp., In Vitro, 26(3): 59A (1990); Sarup i wsp., Growth Regulation, 1: 72-82 (1991); Shepard i wsp., J. Clin. Immunol., 11(3): 117-127 (1991); Kumar i wsp., Mol. Cell. Biol., 11(2): 979-986 (1991); Lewis i wsp., Cancer Immunol. Immunother., 37: 255-263 (1993); Pietras i wsp., Oncogene, 9: 1829-1838 (1994); Vitetta i wsp., Cancer Research, 54: 5301-5309 (1994); Sliwkowski i wsp., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994); Scott i wsp., J. Biol. Chem., 266: 14300-5(1991); D'souza i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 7202-7206 (1994); Lewis i wsp., Cancer Research, 56: 1457-1465 (1996); oraz Schaefer i wsp., Oncogene, 15: 1385-1394 (1997). Zrekombinowana humanizowana wersja mysiego przeciwciała 4D5 anty-erbb2 (humab4d5-8, rhumab HER2 lub HERCEPTIN ; Patent USA Nr 5,821,337) jest aktywna klinicznie u pacjentów z nowotworami piersi, z nadmierną ekspresją ErbB2, w stadium przerzutów, którzy wcześniej otrzymywali szeroką terapię anty-nowotworową (Baselga i wsp., J. Clin. Oncol., 14: 737-744 (1996)). HERCEPTIN uzyskał zgodę na wprowadzenie do obrotu przez Food and Drug Administration 25 września 1998 w zakresie leczenia pacjentów z przerzutowym nowotworem piersi, których nowotwory miały nadmierną ekspresją białka ErbB2. Jednakowoż nie wszystkie nowotwory z nadekspresją ErbB2 reagują na HERCEPTIN - (Brockhoff i wsp., Cytometry., 44: 338-48 (2001)). Dodatkowo przedkliniczne dane sugerują, że HERCETNIN może być terapeutycznie skuteczny w leczeniu niedrobnokomókowego nowotworu płuc (ang. non small cell lung kancer, NSCLC). Białko HER2 nadmiernie ulega ekspresji w 20-66% wyciętych nowotworów NSCLC i wykazano, w wielokrotnych seriach pacjentów, złe rokowania (Azzoli, C. G. i wsp., Semin. Oncol., 29 (Suppl. 4): 59-65 (2002)). Inne przeciwciała anty-erbb2 z różnymi właściwościami opisano w Tagliabue i wsp., Int. J. Cancer, 47: 933-937 (1991); McKenzie i wsp., Oncogene, 4: 543-548 (1989); Maier i wsp., Cancer Res., 51: 5361-5369 (1991); Bacus i wsp., Molecular Carciaogenesis, 3: 350-362 (1990); Stancovski i wsp., PNAS (USA), 88: 8691-8695 (1991); Bacus i wsp., Cancer Research, 52: 2580-2589 (1992); Xu i wsp., Int. J. Cancer, 53: 401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk i wsp., Cancer Research, 52: 2771-2776 (1992); Hancock i wsp., Cancer Res., 51: 4575-4580 (1991); Shawver i wsp., Cancer Res., 54: 1367-1373 (1994); Arteaga i wsp., Cancer Res., 54: 3758-3765 (1994); Harwerth i wsp., J. Biol. Chem., 267: 15160-15167 (1992); Patent US Nr 5,783,186 oraz Klapper i wsp., Oncogene, 14: 2099-2109 (1997). Przeciwciało monoklonalne 2C4 opisano w publikacji WO 01/00245, która jest tutaj zacytowana jako odniesienie. Wykazano, że 2C4 niszczy tworzenie dimerów HER2 z innymi przedstawicielami rodziny receptorów ErbB (WO 01/00245). W wyniku przeszukiwania homologów, zidentyfikowano dwóch innych przedstawicieli rodziny receptorów ErbB: ErbB3 (Patenty USA Nr 5183884 oraz 5480968 jak również Kraus i wsp., PNAS (USA), 86: 9193-9197 (1989) oraz ErbB4 (EP Aplikacja Pat. Nr 599,274: Plowman i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993); oraz Plowman i wsp., Nature, 366: 473-475 (1993)). Oba te receptory wykazują podwyższoną ekspresję przynajmniej w niektórych liniach komórkowych nowotworu piersi. Receptory ErbB są na ogół znajdowane w różnych połączeniach w komórkach i uważa się, że heterodimeryzacja podnosi zróżnicowanie odpowiedzi komórkowych na różne ligandy ErbB (Earp i wsp., Breast Cancer Research and Treatment, 35: 115-132 (1995)). Jednakże, mechanizm za pomocą, którego receptory łączą się oraz sposób, w jaki wpływa to na sygnalizację nie jest w pełni zrozumiały (Brennan, P. J. i wsp., Oncogene, 19: 6093-6101 (2000)). Z EGFR łączy się sześć różnych ligandów: naskórkowy czynnik wzrostowy (EGF), transformujący czynnik wzrostowy alfa (TGF-α), amfiregulina, naskórkowy czynnik wzrostowy łączący się z heparyną (HB-EGF), betacelulina oraz epiregulina (Groenen i wsp., Growth Factors, 11:235-257 (1994)). Rodzina białek heregulinowych powstałych w wyniku alternatywnego składania pojedynczego genu stanowi ligandy dla ErbB3 i ErbB4. Do rodziny heregulin należą alfa, beta i gamma hereguliny (Holmes i wsp., Science, 256: 1205-1210 (1992); Patent USA Nr 5641869; oraz Schaefer i wsp., Oncogene, 15: 1385-1394 (1997)); czynniki różnicowania neu (NDFs), czynniki wzrostu komórek glejowych (GGF); receptor acetylocholinowy indukujący aktywność (ARIA); oraz czynnik pochodzący z neuronów czuciowych i motoneuro-

4 PL 214 010 B1 nów (SMDF). Patrz praca przeglądowa Groenen i wsp., Growth Factors, 11:235-257 (1994); Lemke,G., Molec.& Cell. Neurosci., 7: 247-262 (1996) oraz Lee i wsp., Pharm. Rev., 47: 51-85 91995). Ostatnio zidentyfikowano trzy dodatkowe ligandy ErbB: neuregulina-2 (NRG-2), dla której wykazano, że wiąże się z ErbB3 jak i ErbB4 (Chang i wsp., Nature, 387: 509-512 (1997); oraz Carraway i wsp., Nature, 387: 512-516 (1997)); neuregulina-3, która wiąże się z ErbB4 (Zhang i wsp., PNAS (USA), 94(18): 9562-7 (1997)); oraz neuregulina-4, która wiąże się z ErbB4 (Harari i wsp., Oncogene, 18: 2681-89 (1990)) HB-EGF, batacelulina i epiregulina także wiążą się z ErbB4. Podczas gdy EGF i TGF nie wiążą się z ErbB2, EGF stymuluje EGFR i ErbB2 do tworzenia heterodimeru, który aktywuje EGFR i powoduje transfosforylację ErbB2 w heterodimerze. Dimeryzacja i/lub fosforylacja okazuje się aktywować kinazę tyrozynową ErbB2. Patrz Earp i wsp., powyżej. Podobnie, heregulina nie wiąże się z ErbB2, ale gdy ErbB3 ulega ko-ekspresji z ErbB2, tworzony jest kompleks o aktywnej sygnalizacji (Nagy i wsp., Cytometry, 32: 120-31 (1998). Przeciwciała skierowane przeciwko ErbB2 są zdolne do niszczenia tego kompleksu (Sliwkowski i wsp., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)). ErbB3 jest defektywne pod względem kinazy tyrozynowej a tym samym wymaga heterodimeryzacji, korzystnie z rbb2, do zdolności trasdukcji sygnału. (Graus-Porta i wsp., EMBO J., 16: 1647-55 (1995)). Dodatkowo, powinowactwo ErbB3 do hereguliny (HRG) wzrasta do silniejszego powinowactwa, gdy ulega ko-ekspresji z ErbB2. Patrz także Levi i wsp., Journal of Neuroscience, 5: 1329-1340 (1995); Morrissey i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1431-1435 (1995); oraz Lewis i wsp., Cancer Res., 56: 1457-1465 (1996) w odniesieniu do kompleksu białkowego ErbB2-ErbB3. Istotnie, ErbB2 jest korzystnym partnerem do heterodimeryzacji zarówno dla EGFR jak i ErbB3. (Graus-Porta i wsp., powyżej). ErbB4 podobnie jak ErbB3 tworzy aktywny kompleks sygnalny z ErbB2 (Carraway and Cantley, Cell, 78:5-8 (1994)). Zależna od liganda heterodimeryzacja ErbB2 z EGFR lub ErbB3 może przyczyniać się do wzrostu nowotworów ligania ekspresją ErbB2. Ekspresja receptorów ErbB i hereguliny oraz fosforylacja HER2 była badana w materiale nowotworowym pochodzącym od pacjentów z pierwotnym rakiem piersi i rakiem pęcherza (Esteva i wsp., Pathol. Oncol. Res., 7:171-177 (2001); Chow i wsp., Clin. Cancer Res., 7:1957-1962 (2001)). Korelację pomiędzy aktywnym przekazywaniem sygnału przez Her2/neu a rezultatami badań klinikopatologicznych oraz badań pacjentów z rakiem piersi odnotowywali Thor i wsp., J. Clin. Oncology, 18: 3230-3239 (2000) i DiGiovanna i wsp., Cancer Res., 62: 6667-6673 (2002). Streszczenie wynalazku Przedmiotem wynalazku jest rekombinowane humanizowane przeciwciało 2C4 (rhumab 2C4) do zastosowania w sposobie leczenia raka jajnika, raka sutka, raka płuc, lub raka gruczołu krokowego, przy czym rhumab 2C4 zawiera sekwencje aminokwasowe zmienną lekką i zmienną ciężką odpowiednio o SEQ ID nr 3 i 4, oraz sekwencję lekką i sekwencję ciężką regionu stałego ludzkiej IgG1 (allotypu nie-a) i przy czym przeciwciało to jest przeznaczone do podawania w stałej dawce 420 mg co trzy tygodnie. W korzystnym rozwiązaniu, rekombinowane humanizowane przeciwciało charakteryzuje się tym, że rhumab 2C4 ulega ekspresji w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO). Rekombinowane humanizowane przeciwciało korzystnie jest przeznaczone do podawania w dawce wysycającej 840 mg na początku leczenia. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie rekombinowanego humanizowanego przeciwciała 2C4 (rhumab 2C4) do wytwarzania leku do leczenia raka jajnika, raka sutka, raka płuc, lub raka gruczołu krokowego, przy czym rhumab 2C4 zawiera sekwencje aminokwasowe zmienną lekką i zmienną ciężką odpowiednio o SEQ ID nr 3 i 4, oraz sekwencję lekką i sekwencję ciężką regionu stałego ludzkiej IgG1 (allotypu nie-a) i przy czym przeciwciało to jest przeznaczone do podawania w stałej dawce 420 mg co trzy tygodnie. Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku rhumab 2C4 ulega ekspresji w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO). W bardziej korzystnym rozwiązaniu lek jest do leczenia raka, przy czym przeciwciało to jest przeznaczone do podawania w dawce wysycającej 840 mg na początku leczenia. Wynalazek pozwala także na wdrożenie sposobu wykrywania nowotworu, który jest wrażliwy na leczenie przeciwciałem anty-her2. Przeciwciało anty-her2 blokuje aktywację przez ligand heterodimeru ErbB zawierającego HER2. W tym celu pozyskiwana jest próbka nowotworu i wykrywana jest w niej obecność kompleksu białkowego HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4. Nowotwór jest identyfikowany jako wrażliwy na leczenie przeciwciałem anty-her2, jeżeli wspomniany kompleks zostanie wykryty.

PL 214 010 B1 5 Obecność kompleksu wykrywana jest przez immunoprecypitację jakichkolwiek kompleksów białkowych zawierających HER2 z przeciwciałem anty-her2. Wytrącone kompleksy są następnie poddawane kontaktowi z przeciwciałem wybranym z grupy składającej się z przeciwciał anty-her3, przeciwciał anty-her1 oraz przeciwciał anty-her4, po czym oznacza się jakiekolwiek wiązanie. Kompleks HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 jest wykryty, jeśli wykazane jest, że przeciwciała anty-her3 i/lub anty-her1 i/lub anty-her4 wiąże się z wytrąconymi kompleksami. W innym wykonaniu, obecność kompleksu białek HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 wykrywana jest przez mieszanie próbki nowotworowej z przeciwciałem anty-her2 zawierającym pierwszy fluorofor. Następnie, próbka nowotworowa jest mieszana z przeciwciałem wybranym z grupy składającej się z przeciwciał anty-her3 i/lub anty-her1 i/lub anty-her4, gdzie wzmiankowane przeciwciało zawiera drugi fluorofor. Następnie dokonywany jest pomiar przenoszenia energii rezonansu fluorescencyjnego celem określenia czy pierwszy i drugi fluorofor znajdują się w dużej bliskości. Obecność kompleksu białek HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 wykrywana jest, o ile wykazane zostanie, że pierwszy i drugi fluorofor znajdują się w dużej bliskości. W jeszcze innym wykonaniu, obecność kompleksu HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 wykrywana jest przez mieszanie próbki nowotworowej z pierwszym związkiem wiążącym. Pierwszy związek wiążący zawiera część wiążącą pierwszą cząsteczkę docelową, która swoiście wiąże HER2. Część wiążąca pierwszą cząsteczkę docelową jest korzystnie przeciwciałem anty-her2 lub fragmentem przeciwciała. Pierwszy związek wiążący zawiera następnie wykrywalną domenę, połączoną z pierwszą domeną wiążącą możliwym do przecięcia łącznikiem. Próbka nowotworowa mieszana jest z drugim związkiem wiążącym. Drugi związek wiążący korzystnie zawiera część wiążącą drugą cząsteczkę docelową, która swoiście wiąże HER3 lub HER1 lub HER4 i korzystnie nie wiąże HER2. W innym wykonaniu, drugi związek wiążący wiąże HER3 lub HER1 i nie wiąże HER2 i HER4. W kolejnym wykonaniu, część wiążąca drugą cząsteczkę docelową zawiera przeciwciało lub fragment przeciwciała anty-her3 lub anty-her1 lub anty-her4. Zaktywowany drugi związek wiążący ma zdolność cięcia możliwego do przecięcia łącznika w pierwszym związku wiążącym, dostarczając w ten sposób wolnej wykrywalnej domeny, jeśli pierwszy związek wiążący i drugi związek wiążący znajdują się w dużej bliskości. Obecność kompleksu białkowego HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 jest wykrywany, jeśli zidentyfikowana zostanie wolna wykrywalna domena. W jednym z wykonań, obecność wolnej wykrywalnej domeny jest identyfikowana metodą elektroforezy kapilarnej. W innym wykonaniu, pierwszy związek wiążący zawiera część wiążącą pierwszą cząsteczkę docelową, która specyficznie wiąże HER1 lub HER3 lub HER4, a drugi związek wiążący zawiera część wiążącą drugą cząsteczkę docelową, która specyficznie wiąże HER2. W jeszcze innym wykonaniu, obecność kompleksu białkowego HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 i wynikła aktywacja HER2, wykrywana jest przez oszacowanie fosforylacji receptora ErbB, na przykład przez immunoprecypitację białka HER2, po której następuje immunodetekcja fosfotyrozyny techniką typu Western biot. Próbka nowotworu analizowana na obecność kompleksów białkowych HER2/HER3 oraz/lub HER2/HER1 oraz/lub HER2/HER4 jest korzystnie uzyskiwana od pacjenta cierpiącego na nowotwór. Próbka może być na przykład pozyskiwana przez biopsję. W innym wykonaniu próbka jest uzyskiwana przez oczyszczenie krążących w organizmie pacjenta komórek nowotworowych. W jeszcze innym wykonaniu próbkę uzyskuje się podczas operacji usuwania nowotworu z ciała pacjenta. W innym wykonaniu próbkę nowotworu uzyskuje się od ssaka innego niż pacjent, u którego pierwotnie rozwinął się nowotwór. Korzystnie, próbkę uzyskuje się z myszy lub innego gryzonia. Korzystniej, nowotwór jest heteroprzeszczepionym nowotworem. Heteropszeczepiony nowotwór jest korzystnie wytwarzany przez transplantację fragmentu ludzkiego nowotworu do myszy lub innego gryzonia. W jednym z wykonań jest to nowotwór płuc, korzystniej nowotwór płuc nie-drobnokomórkowy. W innym wykonaniu jest to nowotwór sutka. Wynalazek pozwala na rozwinięcie sposobu identyfikacji komórek nowotworowych jako wrażliwych na leczenie za pomocą przeciwciała hamującego łączenie się HER2 z innym członkiem rodziny receptorów ErbB, obejmując etapy (a) dostarczenia biologicznej próbki zawierającej komórki nowotworowe HER2 pozytywne; oraz (b) wykrywania fosforylacji receptora ErbB w próbce biologicznej, gdzie

6 PL 214 010 B1 wzmiankowana fosforylacja wskazuje na to, że komórki nowotworowe, są wrażliwe na leczenie przeciwciałem. W jednym z wykonań wykrywa się fosforylację receptora ErbB2 (HER2). Tak jak uprzednio, inny członek związany z HER2 to HER3, HER1 i/lub HER4, tak jak HER2 i/lub HER1. Sposób może dodatkowo obejmować etap wykrywania obecności kompleksów białkowych HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4, zasadniczo jak to opisano powyżej. Wynalazek pozwala również na opracowanie metody przewidywania odpowiedzi osobnika poddanego leczeniu, zdiagnozowanego z nowotworem HER2 pozytywnym, na leczenie przeciwciałem hamującym łączenie HER2 z innym członkiem rodziny receptorów ErbB, przez wykrywanie tworzenia kompleksów białkowych HER2/HER3 i/lub HER2/HER11 i/lub HER2/HER4 i/lub fosforylacji receptora ErbB w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta, zawierającej komórki nowotworowe HER2 dodatnie. Obecność takich kompleksów białkowych i/lub wspomnianej fosforylacji wskazuje na to, że prawdopodobnie pacjent zareaguje na leczenie przeciwciałem. W jednym z wykonań fosforyzacji, wykrycie fosforylacji receptora ErbB2 (HER2) wskazuje na to, że osobnik poddany leczeniu prawdopodobnie zareaguje na leczenie przeciwciałem. W oparciu o wynalazek można opracować sposób identyfikacji osobnika badanego reagującego na leczenie przeciwciałem anty-her2, przy użyciu wykrywania fosforylacji receptora ErbB w krążących komórkach nowotworowych osobnika badanego. Obecność takiej fosforylacji wskazuje na to, że osobnik badany prawdopodobnie zareaguje na leczenie przeciwciałem anty-her2. W jednym z wykonań wykrywa się fosforylację ErbB2 (HER2), przy czym osobnikem badanym jest człowiek. W oparciu o opisaną powyżej identyfikację, można wdrożyć leczenie osobnika badanego przeciwciałem anty-her2, korzystnie rhumab 2C4. Przeciwciało według wynalazku może być zawarte w wyrobie fabrycznym zawierającym pojemnik w którym jest przeciwciało wiążące się z HER2 oraz instrukcje podawania przeciwciała pacjentowi cierpiącemu na nowotwór. Korzystnie, ustalono, że nowotwór zawiera heterodimery HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4. Pojemnik taki może zawierać przeciwciało blokujące aktywację przez ligand heterodimery ErbB zawierającego HER2. W innym wykonaniu pojemnik może zawierać przeciwciało monoklonalne 2C4, korzystniej rhumab 2C4. Wynalazek dostarcza także sposobu leczenia pacjenta, obejmujący dostarczanie pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości przeciwciała, które wiąże się z HER2, przy czym pacjent cierpi na nowotwór, który określono jako zawierający heterodimery HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4. Przeciwciało według wynalazku blokuje aktywację przez ligand heterodimeru ErbB zawierającego HER2. W innym wykonaniu przeciwciało jest monoklonalnym przeciwciałem 2C4, korzystniej rhumab 2C4. W innym aspekcie wynalazek pozwala na opracowanie sposobu leczenia pacjenta obejmującego dostarczanie pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości przeciwciała wiążącego się z HER2. Korzystnie pacjent cierpi na nowotwór, który określono, jako posiadający ufosforylowany receptor ErbB. W jednym z wykonań ufosforylowanym receptorem ErbB jest HER2. W innym wykonaniu przeciwciało blokujące aktywację przez ligand heterodimera ErbB zawiera HER2. W jeszcze innym wykonaniu przeciwciało jest monoklonalnym przeciwciałem 2C3, korzystniej rhumab 2C4. Wynalazek został zilustrowany na następujących rysunkach. Figura 1A i 1B przedstawiają przyrównanie sekwencji aminokwasowych domen zmiennej łańcucha lekkiego (VL) (Fig. 1A) i zmiennej łańcucha ciężkiego (VH) (Fig. 1B) mysiego monoklonalnego przeciwciała 2C4 (odpowiednio SEK. ID. NR 1 i 2); domeny VL i VH humanizowanej wersji 2C4 (odpowiednio SEK. ID. NR 3 i 4) oraz konsensusowe rejony zrębowe ludzkiego VL i VH (hum 1, podgrupa łańcucha lekkiego kappa I; humlll, podgrupa III łańcucha ciężkiego) (odpowiednio SEK. ID. NR 5 i 6). Gwiazdki pokazują różnice pomiędzy wersją 574 humanizowanego 2C4 a mysiego przeciwciała monoklonalnego 2C4 lub pomiędzy wersją 574 humanizowanego 2C4 a ludzkim rejonem zrębowym. Rejony Determinujące Dopasowanie (ang. Complementary Determining Regions - CDRs) są w nawiasach. Figury 2A i 2B przedstawiają wpływ monoklonalnego przeciwciała 2C4, przeciwciała HERCEP- TIN lub przeciwciała anty-egfr na zależne od hereguliny (HGR) wiązanie ErbB2 z ErbB3 w komórkach MCF7 z ekspresją na niskich/normalnych poziomach ErbB2 (Fig. 2A) i komórkach SK-BR-3 z ekspresją na wysokich poziomach ErB2 (Fig. 2B); patrz Przykład 2 poniżej. Figura 3 przedstawia immunoblot ukazujący obecność heterodimerów HER1/HER2 i HER2/HER3 w ekstraktach białkowych z heteroprzeszczepu nie-drobnokomórkowego nowotworu płuc (NSCLC).

PL 214 010 B1 7 Figura 4 przedstawia immunoblot ukazujący obecność fosforylacji HER2 w ekstraktach białkowych z hetero przeszczepów nie-drobnokomórkowego raka płuc (NSCLC). Szczegółowy opis wynalazku i rozwiązania korzystne Niniejszy wynalazek w części oparty jest na spostrzeżeniach dokonanych na podstawie doświadczeń, takich że wrażliwość na anty-her2 przeciwciało rhumab 2C4 koreluje z obecnością heterodimerów HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 i/lub fosforylacją receptora ErbB w komórkach nowotworowych. Zatem nowotwór może być zidentyfikowany jako wrażliwy na leczenie przeciwciałem anty-her2, w szczególności przeciwciałem anty-her2, które posiada aktywność biologiczną przeciwciała anty-her2 2C4, w oparciu na obecności heterodimerów HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 i/lub ufosforylowanego receptora ErbB. Heterodimery HER2/HER3 i/lub HER2/HER1 i/lub HER2/HER4 oraz/lub fosforylacja receptora ErbB może być zidentyfikowana jakimkolwiek sposobem znanym w dziedzinie. Przez zidentyfikowanie specyficznych nowotworów i rodzajów nowotworów, które są wrażliwe na leczenie przeciwciałami anty-her2, można zidentyfikować pacjentów, którzy prawdopodobnie skorzystają najbardziej z takiego leczenia. Dodatkowo zidentyfikowani mogą być pacjenci, którzy prawdopodobnie nie zyskają na terapii przeciwciałem monoklonalnym 2C4. Definicje Receptor ErbB" jest receptorowym białkiem kinazy tyrozynowej należącym do rodziny receptorów ErbB i obejmuje receptory EGFR (ErbB1), ERRP, ErbB2, ErbB3 oraz ErbB4 oraz innych członków tej rodziny, którzy zostaną zidentyfikowani w przyszłości. Receptor ErbB zawiera na ogół domenę zewnątrzkomórkową, która może łączyć się z ligandem ErbB; lipofilową domenę transbłonową; konserwowaną wewnątrzkomórkową domenę kinazy tyrozynowej oraz karboksylo-końcową domenę sygnalną zawierającą kilka aminokwasów tyrozynowych, które mogą być fosforylowane. Receptor ErbB może być receptorem ErbB o natywnej sekwencji" lub jej wariantem sekwencji aminokwasowej". Korzystnie receptor ErbB jest ludzkim receptorem ErbB o natywnej sekwencji. Zgodnie z tym członkiem rodziny receptorów ErbB" jest EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3, ErbB4 lub każdy inny receptor ErbB znany obecnie lub zidentyfikowany w przyszłości. Korzystnie, członkiem jest EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3 lub ErbB4. Określenia ErbB1", receptor naskórkowego czynnika wzrostowego", EGFR" i HER1" są tu używane zamiennie i odnoszą się do EGFR w postaci opisanej np. w Carpenter i wsp., Ann. Rev. Blochem., 56:881-914 (1987), włączając naturalnie występujące formy jego mutantów (np. mutant z delecją EGFR jak u Humphrey i wsp., PNAS (USA), 87: 4207-4211 (1990)). ErbB1 odnosi się do genu kodującego białkowy produkt EGFR. Przeciwciała przeciwko HER1 opisano na przykład w Murthy i wsp., Arch. Biochem. Biophys., 252: 549-560 (1987) i w WO 95/25167. Określenie ERRP", białko pokrewne receptorowi EGF", białko pokrewne EGFR" oraz białko pokrewne receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu" używane są tutaj zamiennie i odnoszą się do ERRP jak opisano to na przykład w Patencie USA Nr 6399743 oraz Publikacji Pat. Nr 2003/0096373. Wyrażenia ErbB2" i HER2" używane są tutaj zamiennie i odnoszą się do białka HER2 opisanego na przykład w Semba i wsp., PNAS (USA), 82: 6497-6501 (1985) i Yamamoto i wsp., Nature, 319: 230-234 (1986) (Numer dostępu w Genebank X03363). Określenie ErbB2" odnosi się do genu kodującego ludzki ErbB2, a neu" odnosi się do genu kodującego szczurze pl85neu. Korzystnie ErB2 stanowi ludzkie ErbB2 o natywnej sekwencji. ErbB3" oraz HER3" odnoszą się do polipeptydów receptorowych opisanych na przykład w Patentach USA Nr 5183884 i 5480968 jak również Kraus i wsp., PNAS (USA), 86: 9193-9197 (1989). Przeciwciała przeciwko ErbB3 są znane w dziedzinie i opisane na przykład w Patentach USA Nr 5183884 oraz 5480968 i w WO 97/35885. Określenia ErbB4" i HER4" odnoszą się tutaj do polipeptydów receptorowych jak zostało to opisane na przykład w Aplikacji Pat. EP Nr 599274; Plowman i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993); i Plowman i wsp., Nature, 366: 473-475 (1993), włączając jego izoformy np. jak opisano to w WO 99/19488 opublikowanym 22 kwietnia 1999. Przeciwciała przeciwko HER4 opisano na przykład w WO 02/18444. Przeciwciała dla receptorów ErbB są dostępne handlowo z różnych źródeł włączając na przykład Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA. Przez ligand ErB" rozumie się polipeptyd, który wiąże się do i/lub aktywuje receptor ErbB. Ligand ErbB może stanowić ludzki ligand ErbB o natywnej sekwencji, taki jak naskórkowy czynnik wzrostowy (EGF) (Savage i wsp., J. Biol. Chem., 247: 7612-7621 (1972)); transformujący czynnik wzro-

8 PL 214 010 B1 stowy alfa (TGF-α) (Marquardt i wsp., Science, 223: 1079-1082 (1984)); amfiregulyna znana także jako autowydzielniczy czynnik wzrostu keratynocytów lub komórek Schwana (Shoyabet i wsp., Science, 243: 1073-1076 (1989); Kimura i wsp., Nature, 348: 257-260 (1990); i Cook i wsp., Mol. Cell. Biol., 11: 2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing i wsp., Science, 259: 1604-1607 (1993); oraz Sasada i wsp., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190:1173 (1993)); naskórkowy czynnik wzrostowy wiążący heparynę (HB-EGF) (Higashiyama i wsp., Science, 251: 936-939 (1991)); epiregulina (Toyoda i wsp., J. Biol. Chem., 270: 7495-7500 (1995); oraz Komurasaki i wsp., Oncogene, 15: 2841-2848 (1997)); heregulina (patrz poniżej); neuregulina-2 (NGR-2) (Carraway i wsp., Nature, 387: 512-516 (1997)); neuregulina-3 (NGR-3) (Zang i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 9562-9567 (1997)); neuregulina-4 (NGR-4) (Harari i wsp., Oncogene, 18: 2681-89 (1999)) lub kripto (CR-1) (Kannan i wsp., J. Biol. Chem., 272(6): 3330-3335 (1997)). Ligandy ErbB, które wiążą się z EGFR obejmują TGF-α, amfiregulinę, betacelulinę, HB-EGF i epiregulinę. Ligandy ErbB, które wiążą się z ErbB3 obejmują hereguliny. Ligandy ErbB zdolne do wiązania ErbB4 obejmują betacelulinę, epiregulinę, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 i hereguliny. Ligand ErbB może także być syntetycznym ligandem ErbB. Syntetyczny ligand może być specyficzny dla szczególnego receptora ErbB lub może rozpoznawać szczególne kompleksy receptora ErbB. Przykładem syntetycznego liganda jest syntetyczna chimera heregulina/egf biregulina (patrz, na przykład, Jones i wsp., FEBS Letters, 447: 227-231 (1991), przedstawiony tutaj w postaci referencji). Heregulina" (HGR) użyta tutaj odnosi się do polipeptydu kodowanego przez produkt genowy hereguliny jak zawarty w Patencie USA Nr 5641869 lub Marchionni i wsp., Nature, 362: 312-318 (1993). Przykłady heregulin obejmują heregulinę-, heregulinę- 1, heregulinę- 2 oraz heregulinę- 3 (Holmes i wsp., Science, 256: 1205-1210 (1992); oraz Patent USA Nr 5641869); czynnik różnicujący neu (NDF) (Peles i wsp., Cell, 69: 205-216 (1992)); aktywator indukujący receptor acetylocholiny (ARIA) (Falls i wsp., Cell, 72: 801-815 (1993)); czynniki wzrostu komórek glejowych (GGF) (Marchionni i wsp., Nature, 362: 312-318 (1993)); czynnik pochodzący z neuronów czuciowych i motoneuronów (SMDF) (Ho i wsp., J. Biol. Chem., 270: 14523-14532 (1995)); -heregulina (Schaefer i wsp., Oncogene, 15: 1385-1394 (1997)). Określenie obejmuje biologicznie aktywne fragmenty i/lub odmiany sekwencji aminokwasowych polipeptydu HRG o natywnej sekwencji, takie jak jego fragment domeny podobnej do EGF (np., ΗRGβ1177-244).,,Hetero-oligomer ErbB" jest tutaj niekowalencyjnie połączonym oligomerem zawierającym, co najmniej dwa różne receptory ErbB. Dimer ErbB" jest niekowalencyjnie połączonym oligomerem zawierającym dwa różne receptory ErbB. Kompleksy takie mogą powstawać, gdy komórka z ekspresją dwóch lub więcej receptorów ErbB wystawiona jest na działanie ligandu ErbB. Oligomery ErbB, takie, jak dimery ErbB, mogą być izolowane za pomocą immunoprecypitacji i analizowane za pomocą SDS- PAGE jak to opisano na przykład w Sliwkowski i wsp., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994). Przykłady takich hetero-oligomerów ErbB obejmują kompleksy EGFR-ErbB2 (odnoszący się także do HER1/HER2), ErbB2-ErbB3 (HER2/HER3) oraz ErbB3-ErbB4 (HER3/HER4). Ponadto, heterooligomer ErbB może zawierać dwa lub więcej receptorów ErbB2 związanych z innym receptorem ErbB, takim jak ErbB3, ErbB4 lub EGFR (ErbB1). Inne białka, takie jak podjednostka receptora cytokiny (np. gpl30) mogą być włączone w hetero-oligomer. Przez aktywację przez ligand receptora ErbB" rozumie się przekazywanie sygnału (np. wywołane przez wewnątrzkomórkową domenę kinazową receptora ErbB fosforylujące reszty tyrozynowe w receptorze ErbB lub polipeptydzie substratowym) z udziałem wiązania liganda ErbB do heterooligomeru ErbB zawierającego, będący przedmiotem zainteresowania, receptor ErbB. Na ogół, obejmuje to wiązanie liganda ErbB do hetero-oligomeru, co powoduje aktywację kinazowej domeny jednego lub więcej receptorów ErbB w hetero-oligomerze i w wyniku czego dochodzi do fosforylacji reszt tyrozynowych w jednym lub więcej receptorze ErbB i/lub fosforylacji reszt tyrozynowych w dodatkowym polipeptydzie(ach) substratowym. Aktywację receptora ErbB można ująć ilościowo przy zastosowaniu rozmaitych oznaczeń fosforylacji tyrozyny. Polipeptyd o sekwencji natywnej" to taki, który ma identyczną sekwencję aminokwasową, jak polipeptyd (np. receptor ErbB lub ligand ErbB) pozyskany z organizmu żywego. Takie polipeptydy o sekwencji natywnej można wyizolować z organizmu żywego bądź otrzymać metodą rekombinacji lub syntezy. Zatem polipeptyd o sekwencji natywnej może mieć sekwencję aminokwasową naturalnie występującego polipeptydu ludzkiego, polipeptydu mysiego lub polipeptydu pochodzącego od jakiegokolwiek gatunku ssaka.

PL 214 010 B1 9 Pojęcie wariant sekwencji aminokwasowej" odnosi się do polipeptydów, których sekwencja aminokwasowa różni się do pewnego stopnia od polipeptydu o sekwencji natywnej. Zazwyczaj, warianty sekwencji aminokwasowej będą wykazywały co najmniej około 70% homologię z przynajmniej jedną domeną wiążącą receptor natywnego liganda ErbB lub z co najmniej jedną domeną wiążącą ligand natywnego receptora ErbB, a korzystnie, będą wykazywały przynajmniej około 80%, bardziej korzystnie, przynajmniej około 90% homologii z takimi domenami wiążącymi receptor lub ligand. Warianty sekwencji aminokwasowej wykazują podstawienia, delecje i/lub insercje w niektórych pozycjach sekwencji aminokwasowej natywnej sekwencji aminokwasowej. Homologia" jest określana jako procent reszt w wariancie sekwencji aminokwasowej, które są identyczne po przyrównaniu sekwencji i, o ile to konieczne, wprowadzeniu przerw celem uzyskania maksymalnej procentowej homologii. Sposoby oraz programy komputerowe do zestawiania sekwencji są powszechnie znane w tej dziedzinie. Jednym z takich programów komputerowych jest Align 2", autoryzowany przez Genetech, Inc., który został skatalogowany z dokumentacją użytkownika w United States Copyright Office, Washington, DC 20559, dnia 10 grudnia, 1991. Termin przeciwciało" jest tutaj stosowane w szerokim pojęciu i specyficznie oznacza nieuszkodzone przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała multispecyficzne (np., przeciwciała dwuspecyficzne) utworzone z co najmniej dwóch nieuszkodzonych przeciwciał i fragmentów przeciwciał, tak długo, jak wykazują one pożądaną aktywność biologiczną. Pojęcie przeciwciało monoklonalne" zastosowane tutaj, odnosi się do przeciwciała pozyskanego z populacji w znacznym stopniu homogennych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała tworzące populację są identyczne z wyjątkiem naturalnie pojawiających się, możliwych mutacji, występujących w pomniejszej ilości. Przeciwciała monoklonalne są wysoce specyficzne, jako skierowane przeciw pojedynczemu miejscu antygenowemu. Co więcej, w przeciwieństwie do preparatów przeciwciał poliklonalnych, które obejmują różne przeciwciała skierowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne skierowane jest przeciw pojedynczej determinancie na antygenie. Dodatkowo, oprócz swojej specyficzności, przeciwciała monoklonalne mają tę zaletę, że można syntetyzować je bez zanieczyszczeń innymi przeciwciałami. Określenie monoklonalny" wskazuje na charakter przeciwciała, jako otrzymanego z w znacznym stopniu homogennej populacji przeciwciał, i nie ma być interpretowane, jako wymagające do produkcji przeciwciała jakiegoś wyszczególnionego sposobu. Na przykład, przeciwciała monoklonalne możliwe do zastosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem można wyprodukować metodą hybrydomy, opisaną po raz pierwszy przez Kohler i wsp., Nature, 256: 495 (1975) lub metodami rekombinacji DNA (patrz, np., Patent USA Nr 4816567). Przeciwciała monoklonalne" mogą również być wyizolowane z fagowych bibliotek przeciwciał przy zastosowaniu technik opisanych np., w Clackson i wsp., Nature, 352: 624-628 (1991) i Marks i wsp., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991). Do przeciwciał monoklonalnych specyficznie zalicza się tu przeciwciała chimerowe", w których część ciężkiego i/lub lekkiego łańcucha jest identyczna z, lub homologiczna do odpowiednich sekwencji przeciwciał pozyskanych ze zwierzęcia danego gatunku lub należących do poszczególnych klas lub podklas przeciwciał, podczas gdy pozostała część łańcucha (łańcuchów) jest identyczna z, lub homologiczna do odpowiednich sekwencji przeciwciał pozyskanych z innego gatunku lub należących do innej klasy lub podklasy przeciwciał, jak również zalicza się fragmenty takich przeciwciał, o ile wykazują one pożądaną aktywność biologiczną (Patent USA Nr 4816567; i Morrison i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984). Przeciwciała chimerowe, będące tu przedmiotem zainteresowania, obejmują przeciwciała prymityzowane" zawierające sekwencje domen zmiennych wiążących antygen pochodzące nie od człowieka (np., Małpy Starego świata, itp.) i ludzkie sekwencje rejonu stałego. Fragmenty przeciwciała" zawierają część nienaruszonego przeciwciała, korzystnie zawierającą ich rejon wiążący antygen lub rejon zmienny. Przykłady takich fragmentów przeciwciał obejmują fragmenty Fab, Fab', F(ab')2 oraz Fv; dwuciała, przeciwciała liniowe, cząsteczki przeciwciał o jednym łańcuchu; i przeciwciała multispecyficzne utworzone z fragmentu(ów) przeciwciał. Przeciwciało niezmienione" to takie, które zawiera zmienny rejon wiążący antygen, jak również stałą domenę łańcucha lekkiego (CL) oraz stałe domeny łańcuchów ciężkich, CH1, CH2 i CH3. Domeny stałe mogą być domenami stałymi o sekwencjach natywnych (np., ludzka stała domena o sekwencji natywnej) lub ich wariantami pod względem sekwencji aminokwasowej. Korzystnie, przeciwciało niezmienione posiada jedną lub więcej funkcji efektorowych. Funkcje efektorowe" przeciwciała odnoszą się do tych aktywności biologicznych, które są właściwe dla rejonu Fc (sekwencja natywna rejonu Fc lub wariant rejonu Fc pod względem sekwencji

10 PL 214 010 B1 aminokwasowej) przeciwciał. Przykłady efektorowych funkcji przeciwciał obejmują wiązanie Clq; cytotoksyczność zależną od dopełniacza; wiązanie receptora Fc; cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC); fagocytozę; regulację w dół receptorów powierzchniowych komórek (np., receptora limfocytów B; BCR), itd. W zależności od aminokwasowej sekwencji domen stałych łańcuchów ciężkich niezmienione przeciwciała można przypisać do różnych klas". Istnieje pięć głównych klas przeciwciał niezmienionych: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a kilka z nich można następnie podzielić na podklasy" (izotypy), np., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Domeny stałe łańcuchów ciężkich odpowiadające różnym klasom przeciwciał nazwano odpowiednio α,, ε, i μ. Budowa podjednostek oraz trójwymiarowe kształty immunoglobulin różnych klas są dobrze znane. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał" oraz ADCC" odnosi się do reakcji z udziałem komórek, w której niespecyficzne komórki cytotoksyczne wykazujące ekspresję receptorów Fc (FcRs) (np., komórki NK, neutrofile i makrofagi) rozpoznają przeciwciało związane na komórcedocelowej, a następnie powodują lizę komórki docelowej, Główne komórki, które pośredniczą w ADCC, komórki NK, wykazują jedynie ekspresję Fc RIII, podczas gdy monocyty wykazują ekspresję Fc RI, Fc RII oraz Fc RIII. Ekspresja FcR na komórkach hematopoetycznych streszczona jest w Tabeli 3 na stronie 464 Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991). W celu oznaczenia aktywności ADCC badanej cząsteczki, można przeprowadzić test ADCC in vitro taki, jak opisany w Patencie USA nr 5500362 lub 5821337. Przydatne do takich oznaczeń komórki efektorowe obejmują obwodowe komórki jednojądrzaste krwi (PBMC) oraz komórki NK. Alternatywnie lub dodatkowo, aktywność ADCC badanej cząsteczki można oznaczyć in vivo, np., w modelu zwierzęcym takim, jak ujawniony w Clynes i wsp., PNAS (USA), 95:652-656 (1998). Ludzkie komórki efektorowe" to leukocyty, które wykazują ekspresję jednego lub więcej FcR i wykazują funkcje efektorowe. Korzystnie, komórki wykazują ekspresję co najmniej Fc RIII i wykazują efektorową funkcję ADCC. Przykłady ludzkich leukocytów, które pośredniczą w ADCC obejmują obwodowe komórki jednojądrzaste krwi (PBMC), komórki NK, monocyty, cytotoksyczne limfocyty T oraz neutrofile; przy czym komórki PBMC i komórki NK są preferowane. Komórki efektorowe mogą zostać wyizolowane z ich naturalnego źródła, np. z krwi lub PBMC jak to opisano tutaj. Pojęcia receptor Fc" lub FcR" stosowane są do opisania receptora wiążącego się do rejonu Fc przeciwciała. Preferowanym FcR jest ludzki FcR o sekwencji natywnej. Ponadto, preferowanym FcR jest taki, który wiąże przeciwciało IgG (receptor gamma) i obejmuje receptory podklas Fc RI, Fc RII i Fc RIII, wliczając warianty allelowe i alternatywnie złożone formy tych receptorów. Do receptorów Fc RII zalicza się Fc RIIA ( receptor aktywujący") i Fc RIIB ( receptor hamujący"), które mają podobne sekwencje aminokwasowe różniące się przede wszystkim w swych domenach cytoplazmatycznych. Aktywujący receptor Fc RIIA zawiera w swej domenie cytoplazmatycznej aktywujący motyw immunoreceptora oparty na tyrozynie (ITAM). Hamujący receptor Fc RIIB zawiera w swej domenie cytplazmatycznej hamujący motyw immunoreceptora oparty na tyrozynie (ITIM). (Patrz praca przeglądowa M. w Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15: 203-234 (1997)). Przegląd receptorów FcR zawarty jest w Ravetch i Kinet, Anne. Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991); Capel i wsp., Immunomethods, 4: 25-34 (1994); i de Haas i wsp., J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41 (1995). Inne receptory FcR, wliczając te, które zostaną zidentyfikowane w przyszłości, objęte są tu pojęciem FcR". Pojęcie to obejmuje również receptor obecny u noworodków, FcRn, odpowiedzialny za przenoszenie matczynych IgG do płodu (Guyer i wsp., J. Immunol., 117:587 (1976) i Kim i wsp., J. Immunol., 24:249 (1994)). Cytotoksyczność zależna od dopełniacza" lub CDC" odnosi się do zdolności cząsteczki do Iizy komórki docelowej w obecności dopełniacza. Ścieżka aktywacji dopełniacza jest rozpoczynana poprzez wiązanie się pierwszego składnika układu dopełniacza (Clq) do cząsteczki (np., przeciwciała) tworzącej kompleks z odpowiednim antygenem. W celu oznaczenia aktywacji układu dopełniacza można przeprowadzić test CDC, np., w sposób opisany w Gazzano-Santoro i wsp., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996). Przeciwciała natywne" są zazwyczaj heterotetramerycznymi glikoproteinami o masie około 150000 daltonów, złożonymi z dwóch jednakowych łańcuchów lekkich (L) i dwóch jednakowych łańcuchów ciężkich (H). Każdy łańcuch lekki jest połączony z łańcuchem ciężkim jednym kowalencyjnym wiązaniem dwusiarczkowym, zaś pomiędzy łańcuchami ciężkimi różnych izotypów przeciwciał liczba wiązań dwusiarczkowych jest zmienna. Każdy ciężki i lekki łańcuch ma także regularnie rozmieszczone wewnątrz łańcucha mostki dwusiarczkowe. Każdy łańcuch ciężki ma na jednym końcu domenę

PL 214 010 B1 11 zmienną (VH), za którą leży duża liczba domen stałych. Każdy łańcuch lekki ma na jednym końcu domenę zmienną (VL) oraz domenę stałą na końcu drugim. Domena stała łańcucha lekkiego leży równolegle w stosunku do pierwszej domeny stałej łańcucha ciężkiego, a domena zmienna łańcucha lekkiego leży równolegle w stosunku do domeny zmiennej łańcucha ciężkiego. Uważa się, że poszczególne reszty aminokwasowe tworzą połączenie pomiędzy domenami zmiennymi łańcucha lekkiego i ciężkiego. Określenie zmienny" odnosi się do faktu, że pewne części domen zmiennych różnią się znacznie sekwencją pomiędzy przeciwciałami i stosowane są w wiązaniu i specyficzności danego przeciwciała względem swoistego dla niego antygenu. Jednakże zmienność nie jest równomiernie rozłożona w obszarze domen zmiennych przeciwciał. Mieści się w trzech segmentach zwanych rejonami superzmiennymi w domenach zmiennych zarówno lekkiego, jak i ciężkiego łańcucha. Bardziej konserwowane części domen zmiennych zwane są rejonami zrębowymi (FRs). Domeny zmienne natywnych łańcuchów ciężkich i lekkich zawierają po cztery FRs, przeważnie przyjmujące konfigurację β-kartki, połączone za pomocą trzech rejonów superzmiennych, które tworzą połączenia pętli i w niektórych przypadkach tworzące część struktury β-kartki. Rejony superzmienne w każdym łańcuchu są utrzymywane razem w ścisłej bliskości poprzez FRs i, wraz z rejonami superzmiennymi z innego łańcucha, przyczyniają się do tworzenia w przeciwciałach miejsca wiążącego antygen (patrz Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-te wydanie, Public Health Service, National Insitutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Domeny stałe nie są bezpośrednio zaangażowane w wiązanie przeciwciała do antygenu, ale wykazują wiele funkcji efektorowych, takich jak udział przeciwciała w cytotoksycznej odpowiedzi komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC). Określenie rejon superzmienny" używane tutaj odnosi się do reszt aminokwasowych przeciwciała, które odpowiedzialne są za wiązanie antygenu. Na ogół rejon superzmienny zawiera reszty aminokwasowe z rejonu determinującego dopasowanie" lub CDR" (np. reszty aminokwasowe 24-34 (L1), 50-56 (L2) oraz 89-97 (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego oraz 31-35 (H1), 50-65 (H2) oraz 95-102 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5te wydanie, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) i/lub reszty aminokwasowe z pętli superzmiennej" (np. reszty aminokwasowe 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego oraz 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Chothia i Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)). Rejon zrębowy" lub reszty aminokwasowe FR" to reszty aminokwasowe domeny zmiennej inne niż reszty aminokwasowe rejonu superzmiennego zdefiniowanego tutaj. W wyniku trawienia przeciwciał papainą powstają dwa identyczne fragmenty wiążące ant y- gen, zwane fragmentami Fab", każdy z pojedynczym miejscem wiązania antygenu oraz fragment Fc", którego nazwa odzwierciedla zdolność do natychmiastowej krystalizacji. Trawienie pepsyną dostarcza fragmentu F(ab')2, który ma dwa miejsca wiążące antygen i nadal jest zdolny do krzyżowego wiązania antygenu. Fv" jest najmniejszym fragmentem przeciwciała, zawierającym kompletne miejsce rozpoznające antygen i wiążące antygen. Rejon ten składa się z dimeru tworzonego przez jedną domenę zmienną łańcucha ciężkiego i jedną domenę zmienną łańcucha lekkiego w ścisłym niekowalencyjnym wiązaniu. To właśnie w tym ułożeniu następuje oddziaływanie pomiędzy trzema superzmiennymi rejonami każdej domeny zmiennej, co determinuje miejsce wiązania antygenu na powierzchni dimeru VH-VL. Razem, sześć superzmiennych rejonów składa się na specyficzność wiązania antygenu przez przeciwciało. Jednakże, nawet pojedyncza domena zmienna (lub połowa Fv obejmująca tylko trzy superzmienne rejony specyficzne względem antygenu) ma zdolność do rozpoznawania i wiązania antygenu, choć z mniejszym powinowactwem niż w przypadku pełnego miejsca wiążącego. Fragment Fab także zawiera domenę stałą łańcucha lekkiego oraz pierwszą stałą domenę (CH1) łańcucha ciężkiego. Fragmenty Fab' różnią się od fragmentów Fab kilkoma dodatkowymi resztami na końcu karboksylowym domeny CH1 łańcucha ciężkiego wliczając jedną lub więcej cystein z rejonu zawiasowego przeciwciała. Fab'-SH jest tutaj określeniem dla Fab', w którym cysternowa (-owe) reszta(-y) domeny stałej wyposażone są w co najmniej jedną wolną grupę tiolową. Fragmenty F(ab')2 przeciwciała zostały najpierw wytworzone jako pary fragmentów Fab', posiadające pomiędzy sobą zawiasowe cysteiny. Inne rodzaje chemicznego parowania fragmetów przeciwciał są także znane. Łańcuchy lekkie" przeciwciał pochodzące z jakiegokolwiek gatunku kręgowca mogą być, na podstawie sekwencji aminokwasowej ich domen stałych, przypisane do jednego z dwóch wyraźnie odmiennych typów, zwanych kappa ( ) i lambda ( ).

12 PL 214 010 B1 Jednołańcuchowe Fv" lub fragmenty przeciwciał scfv" zawierają domeny VH i VL przeciwciała, przy czym domeny te obecne są w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Korzystnie, polipeptyd Fv zawiera polipeptydowy łącznik pomiędzy domenami VH i VL, co umożliwia scfv utworzenie pożądanej struktury dla związania antygenu. Celem przeglądu literatury dotyczącej scfv patrz Plückthun w The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, red. Rosenburg and Moore, Springer-Verlag, New York, str. 269-315 (1994). Fragmenty scfv przeciwciał anty-erbb2 opisano w WO93/16185; Patent U.S.A nr 5571894; i Patent U.S.A nr 5587458. Określenie dwuciała" odnosi się do małych fragmentów przeciwciał z dwoma miejscami wiążącymi antygen, których fragmenty obejmują ciężką domenę zmienną (VH) połączoną z lekką domeną zmienną (VL) w tym samym łańcuchu polipeptydowym (VH-VL). Zastosowanie łącznika, który jest zbyt krótki by umożliwić parowanie pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha, domeny zmuszone są parować z komplementarnymi domenami innego łańcucha i tworzyć dwa miejsca wiązania antygenu. Bardziej całościowo dwuciała opisane są np., w EP 404097; WO93/11161; oraz Hollinger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993). Humanizowane" formy, innych niż ludzkie, przeciwciał (np., przeciwciał gryzoni) to przeciwciała chimerowe zawierające najmniejszą sekwencję pochodzącą z immunoglobulin innych niż ludzkie. W większości, przeciwciała humanizowane to immunoglobuliny ludzkie (przeciwciało biorcy), w których reszty z rejonu superzmiennego biorcy zostały zastąpione resztami pochodzącymi z superzmiennych rejonów gatunku innego niż ludzki (przeciwciało dawcy) takiego, jak mysz, szczur, królik lub inny niż człowiek gatunek naczelnego, posiadającymi pożądaną specyficzność, powinowactwo i wydajność. W pewnych przypadkach reszty z rejonu zrębowego (FR) ludzkich immunoglobulin zastąpione są odpowiadającymi im resztami innego niż ludzki gatunku. Ponadto, przeciwciała humanizowane mogą zawierać reszty, których brak jest w przeciwciele biorcy lub przeciwciele dawcy. Modyfikacje te są dokonywane celem dalszego ulepszania działania przeciwciał. Ogólnie, przeciwciało humanizowane będzie zawierało w istocie wszystkie spośród co najmniej jednej, a zwykle dwóch, domen zmiennych, w których wszystkie lub w istocie wszystkie spośród superzmiennych pętli odpowiadają pętlom immunoglobuliny innej niż ludzka oraz wszystkie lub w istocie wszystkie spośród rejonów FR mają sekwencję immunoglobuliny ludzkiej. Przeciwciało humanizowane będzie opcjonalnie zawierało co najmniej część rejonu stałego immunoglobuliny (Fc), zwykle immunoglobuliny ludzkiej. Celem zapoznania się z dalszymi szczegółami, patrz Jones i wsp., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann i wsp., Nature, 332: 323-329 (1988); oraz Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992). Humanizowane przeciwciała anty-erbb2 obejmują humab4d5-1, humab4d5-2, humab4d5-3, humab4d5-4, humab4d5-5, humab4d5-6, humab4d5-7 i humab4d5-8 (HERCEPTIN ), jak opisano w Tabeli 3 Patent U.S.A Nr 5821337 załączonej tutaj w formie odnośnika; humanizowane przeciwciało 520C9 (WO 93/21319) i humanizowane przeciwciało 2C4, jak poniżej opisano. Przeciwciało wyizolowane" to takie, które zidentyfikowano i oddzielono i/lub odzyskano ze składnika ich naturalnego środowiska. Składniki zanieczyszczające środowiska naturalnego przeciwciał to materiały, które zakłócałyby diagnostyczne lub terapeutyczne zastosowanie przeciwciała i mogą obejmować enzymy, hormony oraz inne białkowe lub niebiałkowe substancje rozpuszczone. W preferowanych wykananiach, przeciwciało będzie oczyszczone (1) w stopniu większym niż 95% masy przeciwciała, co określane jest sposobem Lowry'ego, a najbardziej korzystnie większym niż 99% masy, (2) w stopniu wystarczającym do uzyskania co najmniej 15 reszt N-końcowej lub wewnętrznej sekwencji aminokwasowej przy zastosowaniu urządzenia do sekwencjonowania metodą naczynia przędzalniczego (ang. spinning cup) lub (3) do osiągnięcia homogeniczności metodą SDS-PAGE w warunkach redukujących i nieredukujących przy zastosowaniu barwienia błękitem Coomassiego lub korzystnie, barwienia srebrowego. Przeciwciało wyizolowane obejmuje przeciwciało in situ w zrekombinowanych komórkach, o ile co najmniej jeden składnik naturalnego środowiska przeciwciała będzie usunięty. Zazwyczaj jednakże, wyizolowane przeciwciało będzie przygotowane w co najmniej jednym etapie oczyszczania. Przeciwciało, które wiąże" badany antygen, np., antygen ErbB2, to takie, które jest zdolne do wiązania tego antygenu z wystarczającym powinowactwem, tak, że przeciwciało jest przydatne w rozpoznawaniu komórki wykazującej ekspresję tego antygenu. W przypadku, gdy przeciwciałem jest takie, które wiąże się z ErbB2, zazwyczaj będzie ono preferencyjnie wiązać ErbB2 w przeciwieństwie do innych receptorów ErbB, i może być tym, które nie wchodzi w znaczący sposób w reakcje krzyżowe z innymi białkami takimi jak EGFR, ErbB3 lub ErbB4. W takich wykonaniach, zakres wiązania przeciwciała do owych białek niebędących ErbB2 (np., wiązanie się do endogennego receptora na