Ćwiczenie numer 6. Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO



Podobne dokumenty
Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów. Rozdział 9

PL B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL BUP 26/11

Novabeads Food DNA Kit

Zestaw do wykrywania Chlamydia trachomatis w moczu lub w kulturach komórkowych

AmpliTest GMO screening-nos (Real Time PCR)

Laboratorium 8. Badanie stresu oksydacyjnego jako efektu działania czynników toksycznych

Genomic Midi AX. 20 izolacji

Genomic Maxi AX zestaw do izolacji genomowego DNA wersja 0616

TaqNova-RED. Polimeraza DNA RP20R, RP100R

Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16

Zestaw do wykrywania Anaplasma phagocytophilum w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925

Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu

Zestaw do wykrywania Babesia spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych

Pakiet 3 Zestawy do izolacji, detekcji i amplifikacji badań grypy i Borrelia met. real time PCR część 67

Genomic Mini AX Plant Spin

Genomic Mini AX Milk Spin

Genomic Maxi AX Direct

Ćwiczenie 3 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6 metodą PCR w czasie rzeczywistym (rtpcr) przy użyciu sond typu TaqMan

PL B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL BUP 04/14. SYLWIA OKOŃ, Dąbrowica, PL KRZYSZTOF KOWALCZYK, Motycz, PL

Ampli-LAMP Babesia canis

RT31-020, RT , MgCl 2. , random heksamerów X 6

2. Przedmiot zamówienia: Odczynniki chemiczne do izolacji DNA i reakcji PCR, wymienione w Tabeli 1. Nazwa odczynnika Specyfikacja Ilość*

AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR)

AmpliTest Chlamydia/Chlamydophila (Real Time PCR)

Saccharomyces Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae. Metoda chemiczna.

ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków)

StayRNA bufor zabezpieczający RNA przed degradacją wersja 0215

Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215

AmpliTest Babesia spp. (PCR)

Genomic Mini AX Bacteria+ Spin

Ćwiczenie 2. Identyfikacja płci z wykorzystaniem genu amelogeniny (AMGXY)

Uniwersalny zestaw do izolacji DNA (GeDI)

Gel-Out. 50 izolacji, 250 izolacji. Nr kat , Zestaw do izolacji DNA z żelu agarozowego. wersja 0617

Zestaw przeznaczony jest do całkowitej izolacji RNA z bakterii, drożdży, hodowli komórkowych, tkanek oraz krwi świeżej (nie mrożonej).

Ilość TAK TAK TAK TAK TAK TAK

Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu

bi ~ Zestaw dydal<tyczny umożliwiający przeprowadzenie izolacji genomowego DNA z bakterii EasyLation Genomie DNA INSTRUI<CJA DLA STUDENTÓW

Techniki molekularne ćw. 1 1 z 6

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika

Biologia medyczna, materiały dla studentów

MATERIAŁY SZKOLENIOWE DLA ZAKŁADÓW HIGIENY WETERYNARYJNEJ W ZAKRESIE LABORATORYJNEJ DIAGNOSTYKI AFRYKAŃSKIEGO POMORU ŚWIŃ

Zestaw dydaktyczny. genotypowanie szczepów 5taphy/ococcus aureus metodą PCR-RFLP

Parametr Wymagany parametr Oferowany parametr a) z wbudowaną pompą membranową PTEE, b) kondensorem par, System

Sherlock AX. 25 izolacji, 100 izolacji

GRADIENT TEMPERATUR TOUCH DOWN PCR. Standardowy PCR RAPD- PCR. RealTime- PCR. Nested- PCR. Digital- PCR.

Total RNA Zol-Out. 25 izolacji, 100 izolacji

Opis przedmiotu zamówienia wraz z wymaganiami technicznymi i zestawieniem parametrów

E.coli Transformer Kit

umożliwiający wyl<rywanie oporności na HIV przy użyciu

Odczynnik do izolacji RNA z tkanek zwierzęcych, roślinnych oraz linii komórkowych

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

(wypełnia Wykonawca) (wypełnia Wykonawca) (wypełnia Wykonawca)

Platforma Genie II. innowacyjne narzędzie do identyfikacji materiału genetycznego patogenów techniką LAMP Loop-mediated Isothermal AMPlification

ĆWICZENIE 5 MECHANIZMY PROMUJĄCE WZROST ROŚLIN

Polimeraza Taq (1U/ l) 1-2 U 1 polimeraza Taq jako ostatni składniki mieszaniny końcowa objętość

Część I Zakup zestawów diagnostycznych do GMO.

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV

Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, Warszawa. Zakład Biologii Molekularnej

AmpliTest Panel odkleszczowy (Real Time PCR)

E.coli Transformer Zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli

Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów:

Genomic Mini AX Body Fluids zestaw do izolacji DNA z płynów ustrojowych wersja 1115

fix RNA Roztwór do przechowywania i ochrony przed degradacją próbek przeznaczonych do izolacji RNA kat. nr. E0280 Sierpień 2018

PathogenFree RNA Isolation Kit Zestaw do izolacji RNA

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej

Metody wykrywania genetycznie zmodyfikowanych organizmów

Genomic Mini. 50 izolacji, 250 izolacji. Uniwersalny zestaw do izolacji genomowego DNA z różnych materiałów. wersja Nr kat.

Otrzymany w pkt. 8 osad, zawieszony w 2 ml wody destylowanej rozpipetować do 4 szklanych probówek po ok. 0.5 ml do każdej.

Genomic Micro AX Swab Gravity Plus

Ampli-LAMP Goose Parvovirus

Metody badania ekspresji genów

GeneMATRIX Cell Culture DNA Purification Kit

Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR System, czyli Mercedes wśród termocyklerów do analizy PCR w czasie rzeczywistym

Dr Anna Linkiewicz Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - PIB LAB-GMO Maj 2015

Color Compensation Set (FAM, HEX, Texas Red, Cy5)

Prowadzący: dr Lidia Boss znacznik fluorescencyjny (np. SYBR Green II)

Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.

Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.

Zestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych. Nr kat. EM08 Wersja zestawu:

Zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych. Nr kat. EM03 Wersja zestawu:

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej

Część I Zakup zestawów diagnostycznych do GMO.

Instrukcja ćwiczeń Biologia molekularna dla II roku Analityki Medycznej. Reakcja odwrotnej transkrypcji. Projektowanie starterów do reakcji PCR.

Zestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych. Nr kat. EM08 Wersja zestawu:

WYBRANE RODZAJE REAKCJI PCR. RAPD PCR Nested PCR Multipleks PCR Allelo-specyficzny PCR Real Time PCR

Syngen Gel/PCR Mini Kit

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia:

ZZ/480/008/D/15 Gdańsk, dnia OGŁOSZENIE O UDZIELANYM ZAMÓWIENIU

Genomic Micro AX Blood Gravity 96-well

Zestaw do izolacji genomowego DNA z bakterii

Deproteinizacja jako niezbędny etap przygotowania próbek biologicznych

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

AmpliTest BVDV (Real Time PCR)

Zestaw do izolacji plazmidowego DNA. Nr kat. EM01 Wersja zestawu:

Przetarg nieograniczony na zakup specjalistycznej aparatury laboratoryjnej Znak sprawy: DZ-2501/280/18

Transkrypt:

Ćwiczenie numer 6 Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO 1. Informacje wstępne -screening GMO -metoda CTAB -qpcr 2. Izolacja DNA z soi metodą CTAB 3. Oznaczenie ilościowe i jakościowe DNA 4. Detekcja genu lektyna 6 metodą qpcr 5. Omówienie wyników 6. Charakterystyka odczynników szkodliwych 1. Informacje wstępne Screening GMO Analiza produktu żywnościowego polega na oszacowaniu, czy ich zawartość jest zgodna z prawem (Regulacja EC 1829/2003, Regulacja EC 1830/2003). Regulacja zakłada, ze wszystkie produkty składające się lub produkowane przez GMO muszą zostać oznaczone. Znakowanie nie jest wymagane dla produktów, w których rozważane składniki zawierają mniej niż 1% ( obecnie 0,9%) GMO, gdyż taka ilość może być przypadkowa i wynika z błędów technicznych. Jeśli dany produkt zawiera dwie odmiany tego samego składnika np. soja wówczas uzyskany wynik sumuje się i sumaryczny udział procentowy decyduje o konieczności znakowania. Metoda CTAB-izolacja roślinnego DNA Metoda oparta jest na wykorzystaniu bromku heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAB). Został opracowana przez Murray a i Thompsona w 1980 roku (Murray i Thompson, 1980) i opisana przez Wagnera i współpracowników w 1987 roku (Wagner i in., 1987). Metoda ta jest wykorzystywana do izolacji i oczyszczania DNA z materiału roślinnego i produktów pochodzenia roślinnego. Procedura CTAB jest szeroko wykorzystywana w technikach biologii molekularnej roślin i była sprawdzana w testach walidacyjnych dotyczących detekcji GMO (Lipp i in., 1999; 2001). Istnieje kilka wariantów tej metody opracowanych dla szerokiego zakresu materiałów spożywczych nisko i wysoko przetworzonych (Hupfer i in., 1998; Hotzel i in., 1999; Mayer i in., 1997; Poms i in., 2001). Komórki roślinne mogą być poddane lizie przy użyciu detergentu jonowego bromku heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAB), który tworzy nierozpuszczalny kompleks z kwasami nukleinowymi w środowisku o niskim zasoleniu. W tych warunkachpolisacharydy, fenole i inne zanieczyszczenia pozostają w supernatancie i mogą być usunięte. Kompleks DNA jest rozpuszczany w roztworze o zwiększonym stężeniu soli i wytrącany etanolem lub izopropanolem. qpcr Dokładniejszą i obecnie szerzej stosowaną metodą do ilościowego oznaczania DNA jest PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR). W przeciwieństwie klasycznego PCR, gdzie oznaczanie zachodziło w końcowym punkcie reakcji, system ten pozwala na monitorowanie reakcji w czasie, w którym ona rzeczywiście zachodzi. W tego rodzaju systemie reakcja PCR jest związana z emisją sygnału fluorescencyjnego proporcjonalnego do ilości produktu generowanego w każdym cyklu reakcji. Poprzez pomiar fluorescencji w każdym cyklu reakcji, jest możliwe śledzenie reakcji w fazie ekspotencjalnej. Pierwszy znaczący wzrost fluorescencji jest skorelowany z początkową ilością matrycy (Ahmed, 2002).

Specyficzność metody PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR) zależy zarówno od chemicznego sposobu generowania i monitorowania reakcji powielania, jak i od instrumentu stosowanego do śledzenia sygnału. Do metody tej opracowano różne inerkalujące barwniki (bromek etydyny, SYBR Green I) i hybrydyzujące sondy (TaqMan, Fluorescence Resonance Energy Transfer, Molecular Beacons, Scorpions, TaqMan Minor Groove Binder). 2. Izolacja DNA z soi metodą CTAB Tabela.1 Lista odczynników Odczynnik Skład 100 mm Tris, ph 9,5 20 mm EDTA Bufor lizujący Carlson a 1,4 M NaCl 2% CTAB 1% PEG 2-β-merkaptoetanol* Chloroform:alkohol 96 ml chloroform izoamylowy 24:1 4 ml alkoholu izoamylowego Alkohol etylowy 70% Izopropanol Bufor TE 10 mm Tris HCl, ph 8.0 1 mm EDTA, ph 8.0 RNaza 1,0 mg/ml *dodać na świeżo pod dygestorium. 2 µl na 1 ml buforu Tabela.2 Lista wymaganego sprzętu Pipeta 1 ml, 20-100 ml Tipsy 1 ml, 20-100 ml Moździerz Probówki typu eppendorf 1,5 ml x2 Blok grzewczy 74 C Wirówka 10 000 rpm

Etapy izolacji DNA 1. Homogenizacja materiału w ciekłym azocie z użyciem moździerza (100 mg). Czynność należy wykonywać w okularach ochronnych. 2. Zhomogenizowany materiał przenieść do probówki 1,5 ml i dodać 750 µl buforu lizującego Carlsona. Mieszać zawartość przez odwracanie 6-10 razy aż do momentu uzyskania jednolitej konsystencji. 3. Probówkę wraz z zawartością umieścić w bloku grzewczym na 30 min w temperaturze 74 C pamiętając o mieszaniu zawartości probówki przez worteksowanie co 10 min. 4.Wirowanie prób w temperaturze pokojowej (10 000 rpm, 10 min). 5.Po zakończonym procesie wirowania przenieść supernatant do nowej probówki (1,5 ml). 6.Do supernatantu należy dodać 1 objętość mieszaniny chloroform: alkohol izoamylowy* a następnie delikatnie wymieszać zawartość przez odwracanie 6-7 razy. * jeśli zawartość probówki jest ciepła należy wstrzymać się z dodaniem mieszaniny zawierającej chloroform do czasu spadku temperatury 7.Probówkę wirujemy przez 10 min w temperaturze pokojowej (10 000 rpm) 8.Przenieść górną fazę do nowej probówki a następnie zmierzyć objętość cieczy. 9.Należy dodać 1 objętość izopropanolu a następnie wymieszać zawartość przez odwracanie probówki 6-7 razy. 10.Probę wirujemy przez 10 min w temperaturze pokojowej (10 000 rpm). 11.Po zakończonym wirowaniu usuwamy supernatant a do uzyskanego osadu (DNA) dodajemy 500 µl zimnego alkoholu 70%. 12. Wirowanie 4 C, 10 000 rpm, 10 min. 13. Usunąć supernatant a uzyskany osad suszymy na powietrzu przez 5 min. 14. W zależności od wielkości uzyskanego osadu dodać od 20-100 µl buforu TE. Rozpuścić osad przez pipetowanie a następnie dodać 2 µl RNasy. Inkubacja T= 37 C, t= 10 min. 3. Oznaczenie ilościowe i jakościowe DNA a. pomiar spektofotometryczny (NanoDrop ND-1000) b. analiza produktu na 1% żelu agarozowym 4. Detekcja genu lektyny 6 metodą qpcr Identyfikacja DNA soi z użyciem techniki qpcr jest przeprowadzana poprzez znalezienie genu lektyny 6 (startery GMO3/GMO4), która jest genem referencyjnym wykorzystywanym do oznaczenia procentowej zwartości GMO w produktach żywnościowych. Kontrole W każdej analizie bardzo ważne jest przeprowadzanie eksperymentów kontrolnych. Kontrole negatywne są zaprojektowane w celu sprawdzenia czy odczynniki użyte do reakcji PCR nie są zanieczyszczone przez DNA. Kontrole pozytywne zawierające scharakteryzowane próbki są również konieczne w celu sprawdzenia efektywności i specyficzności reakcji PCR. Przygotowanie reakcji qpcr Odczynniki potrzebne do serii 6 próbek (włączając kontrole pozytywne/negatywne) są ze sobą mieszane według instrukcji podanej w Tab. 4.

Tabela 3. Charakterystyka badania KIERUNEK BADANIA soja amplifikowana sekwencja Glycine max lectin-like (LOC100818710) XM_003518752.2 wielkość produktu 117 bp metoda REAL-TIME PCR aparat LIGHT CYCLER 2.0 odczynniki LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I starter starter GMO_1 GMO_2 sekwencja 5 GCCCTCTACTCCACCCCCATCC 3 długość 22nt sekwencja 5' GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG 3 długość 23nt Tabela 4. Skład mieszaniny reakcyjnej SKŁAD MIESZANINY REAKCYJNEJ substraty stężenie końcowe w reakcji stężenie odczynnika objętość na pojedynczą reakcję LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I 1x 10x 1 µl Mix starterów GMO_1+ GMO_2 0, 5 pmol/µl 5 pmol/µl 1 µl Mg 2+ 15 mmol/µl 25 mmol/µl 0,6 µl DNA - - 1,5 µl woda - - 5,9 µl objętość reakcji 10 µl kontrola pozytywna reakcji materiał referencyjny dla soi GTS40-3-2 kontrola negatywna reakcji premix +woda

Tabela 5. Program reakcji WARUNKI REAKCJI etap temperatura czas liczba cykli szybkość nagrzewania tryb pomiaru tryb analizy INKUBACJA 95 C 10 1 20 C/s none none AMPLIFIKACJA (45 X) denaturacja 95 C 10 20 C/s none hybrydyzacja starterów 63 C 5 45 20 C/s none quantification KRZYWA TOPNIENIA (1 X) elongacja 72 C 6 20 C/s single denaturacja 95 C 0 20 C/s none hybrydyzacja starterów 65 C 15 20 C/s none 1 denaturacja z pomiarem fluorescencyjny CHŁODZENIE (1x) 95 C 0 0,2 C/s continuous melting curves 40 C 30 1 20 C/s none wielkość kapilar 20 µl kompensacja koloru off metoda liczenia - 5.Omówienie wyników

6. Charakterystyka odczynników szkodliwych Źródło: http://www.zpb-innowacje.pl/files/karty_charakterystyk/chloroform.pdf Źródło: http://www.google.pl/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&c Źródło: http://www.poch.com.pl/1/wysw/msds_clp.php?a=4e1ab2745b315f510001

Źródło: http://www.bold.gliwice.pl/bhp/inne/poch_msds_izopropanol.pdf