Dr Anna Linkiewicz Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - PIB LAB-GMO Maj 2015

Transkrypt

1 Genetycznie modyfikowana żywność i pasze Streszczenie zajęć Blisko 50 różnych GMO jest dopuszczonych do stosowania w Unii Europejskiej jako żywność lub pasza. Podczas zajęć wyizolowane zostanie DNA z produktów żywnościowych i pasz znajdujących się na rynku polskim w celu analizy metodą PCR w czasie rzeczywistym. Przeprowadzone będzie oznaczenie obecności białka Cry1Ab w kukurydzy MON810 z wykorzystaniem szybki ego testu paskowego W wyniku ćwiczeń: - uzyskana będzie ogólna wiedza na temat metod analizowania w tym ilościowego oznaczania GMO w Unii Europejskiej - zrozumiane zostaną etapy prowadzące do detekcji i analizy ilościowej GMO - wykonane będzie oznaczenie białka Cry1Ab metodą ELISA - z żywności i paszy dostępnej na rynku polskim wyizolowane będzie DNA metodą na kolumienkach ze złożem krzemionkowym - zrozumiana będzie zasada stosowania pozytywnych i negatywnych kontroli w analizach GMO Opis i protokoły ćwiczeniowe Rozwój genetyki, technik biologii molekularnej i biotechnologii roślin umożliwił klonowanie genów i przenoszenie ich do żywych komórek, z których możliwe jest odtworzenie całego organizmu rośliny, mikroorganizmu lub zwierzęcia, znanego jako Genetycznie Zmodyfikowany Organizm (GMO). GMO to organizm inny niż organizm człowieka, w którym materiał genetyczny został zmieniony w sposób niezachodzący w warunkach naturalnych wskutek krzyżowania lub naturalnej rekombinacji. W roślinach zidentyfikowano i zmieniono wiele genów. Metody klasycznej hodowli wsparte technikami inżynierii genetycznej doprowadziły do wyhodowania roślin GM z cechami odporności na owady czy wirusy, tolerancyjności herbicydów, zmienionym składzie aminokwasowym lub kompozycji kwasów tłuszczowych, obniżonym poziomie niekorzystnych substancji jak kofeina, itd. Rośliny GM w 2014 roku uprawiano na świecie na powierzchni ponad 174 milionów hektarów. Najwyższy wzrost powierzchni upraw roślin GM obserwowany jest w krajach rozwijających się. Najczęściej modyfikowane są rośliny o dużym znaczeniu gospodarczym. Na świecie uprawia się przede wszystkim soję GM, kukurydzę i bawełnę. Odporność na owady typu Bt to cecha umożliwiająca ochronę roślin na polu uprawnym przed szkodnikami, zmniejszenie ilości zabiegów ochronnych i uniknięcie stosowania ścisłych terminów oprysków ochronnych. Stała się jedną z najbardziej popularnych modyfikacji roślin. Zmodyfikowane

2 rośliny z cechą Bt mają nowe geny odpowiedzialne za produkcję białek o cechach insektycydu (białka Cry).Przykładem modyfikacji tego typu jest modyfikacja kukurydzy MON810. Kukurydza MON810 jest rośliną transgeniczną dopuszczoną do uprawy w Unii Europejskiej. Odmiana ta jest odporna na najważniejszego szkodnika kukurydzy- omacnicę prosowiankę (Ostrinia nubilalis L.) dzięki wprowadzonemu genowi cry1ab z bakterii Bacillus thuringensis. Białko Cry1Ab wiąże się specyficznie do receptorów obecnych w przewodzie pokarmowym gatunków z rzędu motyle (Lepidoptera) i powoduje zaburzenia w przepływie jonów, perforacje błony przewodu pokarmowego, a w konsekwencji śmierć owada. Białko Cry1Ab znajduje się pod kontrolą zmienionego promotora 35s z wirusa mozaiki tytoniu CaMV wraz z wzmacniaczem (enhancerem -E35S). Rys 1. Konstrukt plazmidowy użyty do transformacji kukurydzy MON810( źródło: agbios.com) Metody wykrywania genetycznie zmodyfikowanych organizmów (GMO) Metody wykrywania i ilościowego oznaczania GMO opisane poniżej dotyczą wykrywania organizmów transgenicznych w materiale roślinnym a także w produktach żywnościowych i paszach pochodzenia roślinnego. Dwie główne grupy metod detekcji i oznaczania ilościowego GMO, używane powszechnie, stanowią metody oparte na analizie DNA oraz metody analizujące białka. PCR W Europie najczęściej stosowana jest metoda oparta na reakcji PCR (łańcuchowej reakcji polimerazy). Pozwala ona na powielenie wybranego fragmentu DNA w bilionach kopii. Do reakcji PCR niezbędne są startery (oligonukleotydy komplementarne do fragmentów DNA w rejonach granicznych powielanej sekwencji, o długości ok. 20 par zasad), polimeraza DNA, odpowiednie środowisko reakcji, jony magnezu niezbędne do działania polimerazy oraz deoksynukleotydy (dntp). Reakcja PCR składa się z trzech etapów: denaturacja DNA zachodząca w 95ºC, przyłączanie starterów (temp ok ºC) i synteza DNA przez polimerazę (temp. ok. 72ºC). Powieleniu ulega fragment sekwencji leżący pomiędzy miejscami przyłączenia starterów. Podczas wielokrotnego powtarzania tego cyklu

3 ilość produktu rośnie w tempie wykładniczym. Po 20 cyklach otrzymuje się około milion razy więcej kopii danego fragmentu niż na początku pierwszego cyklu. Metoda ta wykorzystywana jest do analiz przesiewowych i jakościowego oznaczania GMO. Real Time PCR Analiza ilościowa kwasów nukleinowych metodą PCR w czasie rzeczywistym, czyli Real Time PCR umożliwia określenie zawartości danej modyfikacji DNA w badanej próbie. Technika ta, dzięki zastosowaniu specyficznych barwników fluorescencyjnych lub wyznakowanych odpowiednimi fluorochromami sond molekularnych, umożliwia obserwację zmian w stężeniu produktu PCR w czasie trwania reakcji. W metodzie stężenie amplifikowanego DNA jest monitorowane w każdym cyklu reakcji poprzez pomiar intensywności fluorescencji, która jest proporcjonalna do ilości produktu. Barwniki fluorescencyjne wykorzystywane w tej metodzie działają na dwa sposoby. Pierwsza strategia działania to wiązanie się barwników bezpośrednio do podwójnej nici DNA (np. SYBR Green). Druga, droższa od poprzedniej ale bardziej specyficzna, wykorzystuje sondy znakowane barwnikami fluorescencyjnymi (np. sondy typu TaqMan, Molecular Beacons, Scorpion). Fluorescencja emitowana przez barwnik jest rejestrowana przez kamerę i przekazywana do komputera. Dzięki temu wynik reakcji Real Time PCR jest widoczny na monitorze w postaci krzywej amplifikacji, która oddaje zależność natężenia fluorescencji w stosunku do czasu trwania reakcji PCR. W początkowych cyklach powolne powielanie produktu rejestrowane jako niski poziom fluorescencji tła (ang. background). W późniejszych etapach wzrastające stężenie produktów reakcji powoduje przyrost fluorescencji. Cykl w którym fluorescencja przekracza poziom tła nazywamy cyklem progowym Ct (ang. treshold cycle). Cykl Ct charakteryzuje początek wczesnej fazy logarytmicznej PCR. Określenie cykli progowych dla badanych prób pozwala na porównanie ich pod względem zawartości sekwencji rozpoznawanych przez oligonukleotydy wykorzystane w reakcji PCR. Im więcej modyfikacji genetycznej w próbie tym we wcześniejszym cyklu fluorescencja przekroczy poziom tła i pojawi się krzywa amplifikacji produktu. W reakcji Real Time PCR wykorzystuje się dwa zestawy starterów (i sond), jeden dla szukanej modyfikacji, drugi dla genu referencyjnego. Dzięki temu możliwe jest ilościowe oznaczenie tej

4 modyfikacji. Gen referencyjny jest to sekwencja gatunkowo-specyficzna, występująca w pojedynczej kopii w genomie haploidalnym. Gen ten powinien być reprezentatywny dla różnych linii czy odmian w ramach gatunku oraz powinien być powielany podczas analizy w taki sam sposób jak modyfikacja genetyczna. Nie należy go mylić z genem referencyjnym używanym w analizach ekspresji genów. W metodach oznaczania zawartości GMO w próbie wykorzystuje się certyfikowane materiały odniesienia, czyli mączki lub izolaty DNA, w których znana jest procentowa zawartość danej modyfikacji genetycznej. Na podstawie materiałów odniesienia konstruowana jest krzywa wzorcowa. Wynik Ct uzyskany dla próbki odnosi się do wartości z krzywej standardowej. Ilość GMO w badanej próbie określa się jako procent danej modyfikacji genetycznej w odniesieniu do danego składnika np. 0,8% DNA kukurydzy MON810 w kukurydzy. Metody wykrywania GMO wykorzystujące amplifikację PCR, ze względu na specyficzność dzieli się na: 1. Metody przesiewowe (ang. screening). Pozwalają na wykrycie wielu linii transgenicznych roślin, bez identyfikacji konkretnego zdarzenia transformacyjnego. Najczęściej analizuje się obecność promotora 35S lub terminatora nos, które są najczęściej spotykanymi elementami genetycznymi w roślinach transgenicznych. 2. Metody specyficzne dla genu- oznaczana jest obecność transgenu lub innych elementów konstruktu np. genów markerowych 3. Metody specyficzne dla konstruktu (ang. construct specific)- amplifikowany jest fragment sekwencji DNA charakterystyczny dla wektora użytego do transformacji. 4. Metody specyficzne dla zdarzenia transformacyjnego (ang. event specific)- pozwalają na wykrycie konkretnej modyfikacji np. MON810, GA21, TC1507. W reakcji PCR amplifikowany jest fragment na styku DNA genomowego i konstruktu użytego do transformacji. Ćwiczenia praktyczne Izolacja DNA przy zastosowaniu zestawu NucleoSpin Food (Macherey Nagel). Do izolacji DNA próbki powinny być reprezentatywne do próbki laboratoryjnej, możliwie homogenne, rozdrobnione. Pozostałości struktur tkankowych i komórkowych są solubilizowane poprzez lizę w specjalnym buforze, który zapewnia integralność i ilościowy odzysk DNA. Proteinaza K degraduje białka komórkowe, w tym białka wiążące DNA i nukleazy. Dodanie kolejnego roztworu umożliwia precypitację organicznych i nieorganicznych substancji, m.in.: białek, pozostałości komórkowych, inhibitorów enzymatycznych. Następnie DNA zawarte w lizacie jest wiązane do minikolumny w obecności buforu zawierającego sole chaotropowe i etanolu. Zanieczyszczenia związane do złoża są skutecznie usuwane w trakcie etapów płukania. Elucję oczyszczonego DNA wykonuje się buforem niskosolnym, np.: zawierającym Tris-HCl. Oczyszczony preparat DNA po zmierzeniu stężenia, ewentualnym rozcieńczeniu jest gotowy do reakcji PCR.

5 Przygotować następujące roztwory Bufor C4 (Macherey-Nagel) Przenieś zawartość buforu C2 do buforu C3 i dobrze wymieszaj. Otrzymany bufor C4 oznakuj. Jest trwały do 4 miesięcy w temperaturze pokojowej o C i musi być przetrzymywany w ciemności. Dla lepszego rozpuszczenia komponentów buforu można je umieścić na 5 minut w 45 o C. Bufor C5 (Macherey-Nagel) Do buteleczki z buforem C5 dodać odpowiednią ilość absolutnego etanolu (zgodnie z zaleceniami producenta), przechowywać w temp o C przez 1 rok. Bufory CF, CQW znajdują się w zestawie Sposób postępowania Liza komórkowa 1. Próbkę do badania poddać homogenizacji/rozdrobnieniu. Pobrać 200 mg zhomogenizowanej próbki analitycznej do opisanej probówki o pojemności 2,0 cm 3 Dodać 550 μl (lub 750 μl dla matryc o większej chłonności) ogrzanego do 65 o C buforu CF. Ostrożnie wymieszać (15s). 2. Dodać 10 μl (lub 13,6 μl dla matryc o większej chłonności) proteinazy K (20 μg/ μl). Krótko zamieszać (2-3s). 3. Inkubować w 65 o C przez minimum 30 min. (można również overnight) 4. Wirować 10 min. > x g w temperaturze pokojowej. 5. Wstawić do ogrzania bufor CE (70 o C). Przygotowanie próbki do związania DNA na kolumnie. 6. Odpipetować 300 μl czystego supernatantu do probówki 1,5 ml. 7. Dodać 300 μl buforu C4 i 300 μl etanolu. Mieszać 30 s. Wiązanie DNA na kolumnie. 8. Umieścić kolumienkę NucleoSpin Food w nowej probówce 2 ml. Pipetą nanieść na kolumnę 750 μl roztworu. 9. Wirować 1 min x g. Odrzucić przesącz. Przemywanie kolumny o przemywanie: Pipetą nanieść na kolumnę 400 μl buforu CQW. Wirować 1 min x g. Odrzucić przesącz. W przypadku podejrzenia obecności silnych inhibitorów reakcji PCR w próbce, powtórzyć przemywanie buforem CQW o przemywanie: Pipetą nanieść na kolumnę na kolumnę 700 μl buforu C5. Wirować 1min x g. Odrzucić przesącz o przemywanie: Pipetą nanieść na kolumnę na kolumnę ponownie 200 μl buforu C5. Wirować 2 min x g. Odrzucić przesącz. Pozostawić kolumienkę otwartą na 5min. w temp. pokojowej, aby odparowały resztki buforu C5, które mogłyby hamować reakcję PCR. Elucja DNA z kolumny 13. Umieścić kolumnę w nowej probówce 1,5 ml. Pipetą nanieść na kolumnę 100 μl ogrzanego do 70 o C buforu CE. 14. Inkubować 5 min. w temp. pokojowej.

6 15. Wirować 1 min x g. W probówce zbiera się roztwór DNA. 16. Wykonać pomiar stężenia DNA na spektrofotometrze i wynik oznaczenia zapisać w zeszycie Identyfikacja kukurydzy MON810 przy użyciu testów paskowych ELISA Materiał badawczy: Mączki i liście z kukurydzy konwencjonalnej i kukurydzy MON810. Wykonanie ćwiczenia: 1. Do probówki 2ml zawierającej ok. 200mg mączki kukurydzianej lub liści dodać ok. 300 µl H2O (8-10 kropli). 2. Zawartość wymieszać patyczkiem przez 1 min i zamknąć probówkę. 3. Umieścić pasek ELISA w probówce (strzałkami do dołu). 4. Odczekać 5-10 minut. 5. Odczytać wynik. Linia kontrolna Linia wyniku negatywny pozytywny