Nowoczesne techniki analityczne w analizie specjacyjnej arsenu i chromu w próbkach środowiskowych Danuta Barałkiewicz Izabela Komorowicz, Karol Sęk Pracownia Analizy Spektroskopowej Pierwiastków Wydział Chemii Uniwersytet im. Adama Mickiewicza
Specjacja wg IUPAC SPECJACJA (ang. speciation) to występowanie różnych fizycznych i chemicznych form danego pierwiastka, indywiduów w badanym materiale. ANALIZA SPECJACYJNA (ang. speciation analysis) to aktywność analityczna zmierzająca do identyfikacji i/lub oznaczenia ilości jednej lub więcej indywidualnych chemicznych form pierwiastków w próbce analitycznej. SPECJACJA CHEMICZNA (ang. chemical species) to specyficzne formy pierwiastków zdefiniowane jako skład izotopowy, struktura elektronowa lub stan utlenienia i/lub struktura kompleksowa lub cząsteczkowa. D.Templeton, A. Ariese, R. Cornelis, L. G. Danielsson, H. Muntau, H. P. van Leeuwen, R. Łobinski, Pure Appl. Chem., 72, 8 (2000) 1453-1470.
Drogi metabolizmu arsenu w organizmie ludzkim hiperpigmentacja, zmiany skórne, rogowacenie naskórka, zaburzenia układu krążenia, nowotwory skóry, pęcherza moczowego, nerek i wątroby. zakwalifikowany przez Międzynarodową Agencję Badań nad Rakiem do grupy I (substancje rakotwórcze dla człowieka) As(III) GSH Błona komórkowa Żółć As(III) Metylotransferaza S-adenozynometioniny GSH As(III lub V) Jednometylowa pochodna MMA MMA Mocz Metylotransferaza S-adenozynometioniny DMA Dimetylowa pochodna DMA
Formy specjacyjne arsenu i ich toksyczność TOKSYCZNOŚĆ: arseniany (III) organiczne związki arsenu (III) arseniany (V) Związki nieorganiczne Kwas arsenowy (III) As (III) As(OH) 3 Kwas arsenowy (V) As (V) AsO(OH) 3 Związki organiczne Kwas monometyloarsenowy MMA (V) CH 3 AsO(OH) 2 Kwas dimetyloarsenowy DMA (V) (CH 3 ) 2 AsO(OH) Arsenobetaina AsB (CH 3 ) 3 As + CH 2 COOH Arsenocholina AsC (CH 3 ) 3 As + CH 2 CH 2 OH organiczne związki arsenu (V) Tlenek trimetyloarsenowy TMAO (CH 3 ) 3 AsO Tetrametyloarsen Me 4 As + (CH 3 ) 4 As + Arsenolipidy AsL (CH 3 ) 3 As + CH 2 CHOHCOOH AsB, AsC Arsenocukry AsS
Zawartość arsenu w wodach rzeczywistych na podstawie literatury Rodzaj wody Zawartość [µg L -1 ] wody podziemne tereny górnicze wpływ geotermiczny <0,5 10 do 5000 do 50000 woda morska do 2 woda słodka 0,4 80 wody powierzchniowe tereny górnicze wpływ geotermiczny wpływ wód podziemnych 0,1-2 do 7900 nawet do 370 do 21800 woda deszczowa do 0,03 WHO 1 µg L-1 (1993) USEPA 50 µg L-1 (2001) UE 10 µg L -1 Rozporządzenie Ministra Zdrowia (2007)
HPLC-ICP-MS (High Performance Liquid Chromatography Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) Gaz reakcyjny Plazma Możliwości: wysoka czułość Analizator Detektor mas Soczewki skupiające DRC niskie granice wykrywalności komora DRC liniowość w zakresie kilku rzędów wielkości
Warunki pomiarowe oznaczania arsenu metodą ICP-MS Parametr Opis Komora mgielna Rozpylacz Palnik plazmowy Stożki zgarniacz i próbnik Moc generatora plazmy Przepływ gazu rozpylającego Przepływ gazu plazmowego Przepływ gazu pomocniczego Napięcie soczewek Napięcie detektora analogowego Napięcie detektora pulsowego Szybkość przepływu próbki Czas zatrzymania cykolonowa Koncentryczny typu Meinhardta kwarcowy platynowe 1400 W 0,95 L/min 15,00 L/min 1,375 L/min 9,75 V -1525 V 750 V 1 ml/min 100 ms Liczba przemiatań 20 Liczba powtórzeń 3
Optymalizacja wybranych parametrów oznaczania arsenu ogólnego 35000 30000 0,95 16 14 intensywność As [c 25000 20000 15000 10000 5000 12 10 8 6 4 2 RSD [% 0 0 0,75 0,8 0,85 0,9 0,95 1 1,05 1,1 1,15 1,2 1,25 przepływ gazu rozpylającego [L/min] Zależność przepływu gazu rozpylającego od intensywności sygnału jonów 75 As +
Optymalizacja wybranych parametrów oznaczania arsenu ogólnego 30000 18 intensywność As [cps] 25000 20000 15000 10000 5000 9,75 16 14 12 10 8 6 4 2 RSD [%] 0 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 napięcie na soczewkach [V] 0 Zależność napięcia soczewek od intensywności sygnału jonów 75 As +
Interferencje spektralne dla jonu 75 As + izobaryczne pierwiastkowe powodowane przez izotopy różnych pierwiastków o tym samym nominalnym stosunku masy do ładunku izobaryczne wieloatomowe powstające w wyniku oddziaływania składników gazowej plazmy, odczynników i matrycy próbki Międzypierwiastkowe Sm 2+ Eu 2+ Nd 2+ Interferencje teoretyczne Jony wieloatomowe 40 Ar 35 Cl + 59 Co 16 O + 36 Ar 38 Ar 1 H + 36 Ar 39 K Interferencje o znaczeniu praktycznym 40 Ar 35 Cl + 43 Ca 16 O 2 23 Na 12 C 40 Ar 12 C 31 P 16 O 2+ 40 Ca 35 Cl + 38 Ar 37 Cl +
Eliminacja interferencji jon poliatomowy 40 Ar 35 Cl + Komora DRC Równanie korekcyjne intensywność sygnału jonów arsenu dla roztworu 10 µg L -1 intensywność sygnału jonów arsenu dla ślepej próby wartość granicy wykrywalności [µg L -1 ] 0,1 ml/min NH 3 wyznaczone na podstawie analizy CRM CASS-4 (certyfikowana zawartość arsenu przy 3% stężeniu NaCl - 182 g L -1 ) Wyznaczenie optymalnej prędkości przepływu gazu przez komorę DRC przy oznaczaniu jonu 75 As + 75 As = -0,000194 35 Cl
Wyniki oznaczania arsenu ogólnego z dodatkiem chlorków bez eliminacji interferencji Stężenie As [µg L -1 ] z korekcją matematyczną z komorą DRC 1 µg L -1 As 50 mg L -1 Cl 1 µg L -1 As 100 mg L -1 Cl 1 µg L -1 As 200 mg L -1 Cl 1 µg L -1 As 300 mg L -1 Cl 1 µg L -1 As 400 mg L -1 Cl x (n=9) RSD [%] x (n=9) RSD [%] x (n=9) RSD [%] 1,04 2,11 1,01 1,14 1,02 1,58 1,05 2,84 1,05 1,86 1,01 1,33 1,13 3,02 1,01 1,60 1,03 2,12 1,28 3,07 1,03 1,44 1,04 1,95 1,41 2,80 1,04 2,05 1,04 1,07 1 µg L -1 As 500 mg L -1 Cl 1,63 2,66 1,04 1,81 1,03 0,98 CASS-4 34,12 (1,11)* * wartość certyfikowana 14,41 (2,24)* 1,13 3,01 1,09 3,65
Parametry charakterystyczne procedury analitycznej oznaczania arsenu ogólnego metodą ICP-MS 10 6 2,5 2 y = 2446,1x + 5661,1 R 2 = 0,9994 Parametr procedury analitycznej Wynik pomiaru intensywność [cp 1,5 1 Liniowość [µg L -1 ] 0,5-500 0,5 Zakres roboczy 0,14-500 0 [µg L -1 ] 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 stężenie As [ug/l] Precyzja 0,48 0,00045 0,0004 [%] Granica wykrywalności 0,14 intensywność/stęże 0,00035 0,0003 0,00025 0,0002 [µg L -1 ] Granica oznaczalności [µg L -1 ] 0,47 0,00015 0,0001 0,01 0,1 0,5 5 10 50 100 300 500 700 800 Zawartość arsenu we wzorcach [ug/l]
HPLC-ICP-MS (High Performance Liquid Chromatography Inductively coupled Plasma Mass Spectrometry) system do specjacji Chromera chromatografia jonowymienna kolumna anionowymienna 4,6mm 150mm, 5 µm faza stacjonarna styren/diwinylobe nzen, grupy funkcyjne trimetyloamonio we -N + (CH 3 ) 3
Analiza specjacyjna arsenu w wodzie procedura analityczna przygotowanie roztworów odpowiednich form specjacyjnych arsenu przygotowanie eluentu kondycjonowanie eluentem kolumny chromatograficznej ( 30 min) przygotowanie próbek do analizy rozdzielanie chromatograficzne (czas analizy od 4-10 min.) Procedura analityczna oznaczania: 1) AsIII 2) AsIII i AsV 3) MMA i DMA 4) AsIII, AsV, MMA i DMA 5) AsB, AsIII, AsV, MMA i DMA kondycjonowanie kolumny po analizach ( 30 min w układzie woda/metanol w stosunku 95/5)
Optymalizacja procedury analitycznej rozdzielania form specjacyjnych: AsIII i AsV Optymalizowane czynniki: Zależność temperatury od czasu retencji 8 7 stężenie eluentu rodzaj eluentu temperatura rozdzielania ph eluentu czas retencji [mi 6 5 4 3 2 1 0 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 temperatura [ o C] As III RSD [%] dla As III As V RSD [%] dla As V prędkość przepływu eluentu objętość nastrzyku próbki ciśnienie [ps 2000 1800 czas retencji [mi 8 7 6 Zależność prędkości przeplywu od czasu retencji Zależność prędkości przepływu od ciśnienia 1600 5 0,8 1400 4 0,7 0,6 1200 3 0,5 1000 2 0,4 800 1 0,3 600 0,2 400 0 0,1 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 200 0 0,9 1 prędkość 1,1 przepływu 1,2 eluentuj 1,3 [ml min 1,4-1 ] 1,5 prędkość przepływu eluentu [ml min -1 ] 1 0,9 As III RSD [%] dla As III As V ciśnienie RSD [% RSD [%] dla As V RSD [%]
Rozdzielanie form specjacyjnych AsIII i AsV As III As V Zoptymalizowane parametry procedury analitycznej Eluent 1) 12mM (NH 4 ) 2 HPO 4 + 10mM NH 4 NO 3 As III As V 2) 12mM (NH 4 ) 2 HPO 4 + 10mM NH 4 NO 3 w 1% CH 3 OH Elucja gradientowa As III As V Przepływ eluentu 1,2 ml/min ph eluentu 9,4 Temperatura pracy kolumny 22-26 C czas analizy 1) 5 min 2) 8 min Objętość nastrzyku próbki 50 µl
Optymalizacja procedury analitycznej rozdzielania form specjacyjnych: DMA i MMA roztwór 10mM (NH 4 ) 2 HPO 4 + NH 4 NO 3 Optymalizowane czynniki: 3,5 3 Zależność ph od czasu retencji stężenie eluentu rodzaj eluentu temperatura rozdzielania czas retencji [mi 2,5 2 1,5 1 0,5 0 9 9,2 9,4 9,6 9,8 ph DMA RSD [%] MMA RSD [%] ph eluentu roztwór 10mM(NH 4 ) 2 HPO 4 prędkość przepływu eluentu Zależność ph od czasu retencji objętość nastrzyku próbki 6 5 czas retencji [m 4 3 2 DMA RSD [%] dla DMA MMA RSD [%] dla MMA 1 0 8,9 9 9,1 9,2 9,3 9,4 9,5 9,6 9,7 9,8 9,9 ph
Rozdzielanie form specjacyjnych MMA i DMA DMA MMA Zoptymalizowane parametry procedury analitycznej Eluent 1) 10mM (NH 4 ) 2 HPO 4 + 10mM NH 4 NO 3 DMA MMA 2) 10mM (NH 4 ) 2 HPO 4 + 10mM NH 4 NO 3 w 1% CH 3 OH Elucja gradientowa DMA MMA Przepływ eluentu 1,0 ml/min ph eluentu 9,0 Temperatura pracy kolumny 29 C czas analizy 1) 3,5 min 2) 5 min Objętość nastrzyku próbki 50 µl
WALIDACJA KRZYWE KALIBRACYJNE powierzchnia piku DMA y = 3995,3x + 4030,9 R 2 = 1 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0 100 200 300 400 500 600 powierzchia piku 1800000 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 MMA y = 3397,6x + 3939,7 R 2 = 0,9999 0 100 200 300 400 500 600 stężenie [ppb] stężenie [ppb] LOD I LOQ STOSUNEK S/N METODA EKSPERYMENTALNA METODA GRAFICZNA LOD[µg/L] LOQ[µg/L] LOD[µg/L] LOQ[µg/L] LOD[µg/L] LOQ[µg/L] DMA 0,5 1,5 0,1518 0,4555 0.0396 0,1189 MMA 1 3 0,1529 0,4590 0,2467 0,6445 PRECYZJA dla DMA jest równa 4,99[%] dla MMA jest równa 5,09[%]
Analiza specjacyjna chromu
Analiza specjacyjna chromu system do specjacji Chromera kolumna pracująca w układzie odwróconych faz 3x3 CR C8 PerkinElmer faza stacjonarna C8 (fazy związane) faza ruchoma 1 mm TBAOH + 0,6 mm EDTA + 2% MeOH; ph=6,9 prędkość przepływu 1,5 ml/min czas analizy 3,5 min obj. nastrzyku próbki 50 µl temperatura pracy kolumny pokojowa możliwe interferencje 40 Ar 12 C, 36 Cl 16 O gaz reakcyjny (DRC) NH 3 przepływ gazu reakcyjnego 0,50 ml/min korekcja matematyczna -0,063703* 35 Cl FORMY SPECJACYJNE CHROMU Związki nieorganiczne Chromiany Cr (VI) CrO 4 2- Dichromiany Cr (VI) Cr 2 O 7 2- Wodorochromiany Cr (VI) HCrO 4 - Wodorotlenek chromu (III) Heksa-akwachrom (III) Kompleksy z kwasami fulwowymi humusowymi Cr (III) Cr(OH) 3 Cr (III) [Cr(H 2 O) 6 ] 3+ Związki organiczne Cr (III) - Amino kompleksy Cr (III) -
Chromatografia par jonowych w układzie faz odwróconych Faza stacjonarna: fazy związane oparte na matrycy krzemionkowej C8 i C18 Faza ruchoma: mieszanina wody z dodatkiem organicznego modyfikatora i odczynnika parującego Reagent parujący: TBAH wodorotlenek tetrabutyloamoniowy Modyfikator organiczny: metanol Faza ruchoma jest bardziej polarna niż faza stacjonarna Kolejność elucji związków na kolumnie C 8 jest następująca: od najbardziej polarnych (kolor żółty) do niepolarnych (kolor niebieski)
Procedura analityczna Parametry aparaturowe Przygotowanie eluentu (0,6 mm EDTA; 0,8 mm TBAH; ph 6.9) Kondycjonowanie kolumny chromatograficznej eluentem (30 min; przepływ 1ml/min) Przygotowanie wzorców i roztworów roboczych Faza ruchoma TBAH; EDTA; ph 6,9; Przepływ Prędkość przepływu Czas analizy Kolumna Temperatura kolumny izokratyczny 1,2 ml/min 3 min 3x3 CR C8 PerkinElmer Pokojowa Objętość analizowanej próbki 50 µl Detekcja Nebulizer PerkinElmer SCIEX ELAN DRC II ICP-MS Kwarcowy koncentryczny Rozdzielanie i oznaczanie ilościowe metodą HPLC-ICP-MS Komora mgielna Moc plazmy Przepływ gazu plazmowego Przepływ gazu nebulizującego Kwarcowa cyklonowa 1100 W 15 L/min 0,96 L/min Płukanie kolumny po zakończonej pracy: 15 min wodą, później 5/95 v/v MeOH/H 2 O Przepływ gazu pomocniczego 1,2 L/min Jon monitorowany 52 Cr + CeO + /Ce + <2% Gaz reakcyjny (DRC) NH 3 Przepływ gazu reakcyjnego 0,50 ml/min
Analiza specjacyjna chromu Aby przeprowadzić analizę specjacyjną chromu w jednej próbce, potrzeba: 50µL próbki; 5,25 ml eluentu oraz dodatkowo raz dziennie 30 ml eleuentu na kondycjonowanie kolumny Cr-EDTA - Cr 2 O 7 2-
Optymalizacja warunków chromatograficznych Stężenie EDTA czas retencji [min] 1,800 1,600 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 c EDTA [mm] chrom III chrom VI Przygotowano roztwory EDTA: 0,4 mm 0,5 mm 0,6 mm 0,7 mm 0,8 mm Cr EDTA - Cr 2 O 7 2-
TBAH [(C 4 H 9 ) 4 N]OH Czas retencji [min] 1,500 1,400 1,300 1,200 1,100 1,000 0,900 0,800 0,700 0,600 0,6 0,8 1 1,2 1,4 c TBAH [mm] Cr III Cr VI Powierzchnia piku [cps] 150000,00 100000,00 50000,00 0,00 TBAH 0,8 mm 0 10 20 30 40 50 Czas [min] Cr III Cr VI Powierzchnia piku [cps] 400000,00 300000,00 200000,00 100000,00 0,00 TBAH 0,9 mm 0 10 20 30 40 50 Czas [min] Cr III Cr VI
Metanol Czas retencji [min] 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 1 2 3 4 5 c MeOH [%] Cr III Cr VI Przygotowano roztwory o stężeniu MeOH: 0% 1% 2% 3% 4%
ph Prędkość przepływu Zbyt szybki przepływ może być przyczyną błędów na etapie atomizacji i jonizacji próbki (większe krople). Zmniejszenie prędkości przepływu wydłuża czas retencji obu form specjacyjnych, nie ma jednak wpływu na jakość rozdzielania, a ponadto pozwala nam zaoszczędzić eluent Ostateczne parametry fazy ruchomej to: - stężenie EDTA 0,6 mm - stężenie TBAH 0,8 mm - stężenie MeOH 0% - ph 6,9 Szybkość tworzenia się kompleksu z EDTA Kompleksowanie Cr(III) nie zachodzi od razu temp. pokojowa sprzyja reakcji Cr(VI) po ok. 100 min redukuje się do Cr(III)
Komora DRC Badano intensywność sygnału dla próbki chromu (10 µg/l Cr(III) w wodzie), eluentu i wody destylowanej w obecności i nieobecności komory DRC intensywność [cps] 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 77578,2 53709,4 DRC 0,5 ml/min bez komory 7407,8 415,4 78,6 2075 eluent chrom woda
Walidacja procedury analitycznej Krzywa kalibracyjna powierzchnia piku [cps] 800000,00 700000,00 600000,00 500000,00 400000,00 300000,00 200000,00 100000,00 0,00 Cr(III) y = 13709x + 22003 Cr(VI) y = 14906x - 11022 R² = 0,995 800000,00 R² = 0,999 powierzchnia piku [cps] 700000,00 600000,00 500000,00 400000,00 300000,00 200000,00 100000,00 0,00 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 stężenie [µg/l] stężenie [µg/l] 40 50 60 Test F-Snedecora Wartość parametru testu F-Snedecora obliczono według wzoru F obl F kryt (P=95%, f=6) Porównanie Cr (III) 8,03 4,28 F obl > F kryt Cr (VI) 66,55 4,28 F obl > F kryt W obu przypadkach F obl > F kryt Wniosek: należy zmniejszyć zakres krzywej kalibracyjnej, aż do uzyskania jednorodności wariancji lub podzielić krzywą na odcinki i dla nich przeprowadzić test F-Snedecora
LOD i LOQ Granicę wykrywalności obliczono korzystając ze wzoru: LOD = 0 + 3s s odchylenie standardowe LOQ = 3LOD Odzysk chrom III chrom VI LOD [µg/l] 0,26 0,15 LOQ [µg/l] 0,77 0,46 Certyfikowany materiał odniesienia 17, 92 R = ------------- = 0,98 x 100 = 98 % 18, 53 Woda wodociągowa 5-krotnie rozcieńczona z dodatkim 20 µg/l mieszaniny Cr(III) i Cr(VI) R% Cr(III) Cr(VI) 18,5 R = ------------- = 0,925 x 100 = 92,5 % 20,0 19,6 R = ------------- = 0,980 x 100 = 98,0 % 20,0
Podsumowanie: Zalety technik sprzężonych w analizie specjacyjnej: 1. Unikatowa selektywność; 2. Wysoka czułość; 3. Niska precyzja i duża dokładność; 4. Możliwość analizy wielopierwiastkowej; 5. Krótki czas analizy. Wady technik sprzężonych w analizie specjacyjnej: 1. Ciągle duży koszt aparatów i ich eksploatacji kształtujący znaczny koszt analizy; 2. Potrzeba dobrze wykształconych operatorów technik sprzężonych, których zadaniem jest kontrola pracy dwóch lub więcej skomplikowanych technicznie aparatów.
Dziękuję za uwagę